擬南芥響應(yīng)NO突變體的篩選及遺傳分析

夏金嬋，張小莉

(河南中醫(yī)藥大學(xué),河南 鄭州 450008)

擬南芥響應(yīng)NO突變體的篩選及遺傳分析

夏金嬋，張小莉*

(河南中醫(yī)藥大學(xué),河南 鄭州 450008)

從甲基磺酸乙酯(EMS)誘變獲得的擬南芥突變體庫中篩選對(duì)一氧化氮(NO)脅迫敏感的突變體，以期為研究信號(hào)分子NO在植物中的分子調(diào)控機(jī)制提供遺傳材料。從EMS誘變獲得的擬南芥突變體庫中篩選得到1株對(duì)NO敏感的突變體nsm1(nitric oxide sensitive mutant 1)，在正常生長(zhǎng)條件下，突變體nsm1與野生型擬南芥的表型并沒有明顯區(qū)別，但是對(duì)NO脅迫的敏感性明顯高于野生型擬南芥，在50 μmol/L SNP(NO供體)處理下，野生型擬南芥的相對(duì)根長(zhǎng)(與在正常生長(zhǎng)的根長(zhǎng)比值)為50.8%，而突變體nsm1的相對(duì)根長(zhǎng)為22.4%。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，突變體nsm1對(duì)甘露醇模擬的干旱脅迫敏感，在100 mmol/L甘露醇處理下，野生型擬南芥的相對(duì)根長(zhǎng)為83.4%，而突變體nsm1的相對(duì)根長(zhǎng)僅為45.7%，這可能與突變體nsm1的失水率、水勢(shì)、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率高于野生型擬南芥有關(guān)。遺傳學(xué)分析表明，該突變體為單基因隱性突變。

擬南芥； 一氧化氮； 突變體nsm1； 干旱

干旱嚴(yán)重影響植物的生長(zhǎng)和發(fā)育，限制農(nóng)作物的產(chǎn)量[1-2]。全球干旱和半干旱區(qū)約占世界陸地總面積的1/3，據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年因干旱導(dǎo)致的作物減產(chǎn)高達(dá)20%。我國干旱缺水地區(qū)面積約占我國國土面積的1/2。因此，研究植物抗旱的分子調(diào)控機(jī)制對(duì)提高農(nóng)作物的產(chǎn)量具有重要的理論與現(xiàn)實(shí)意義[3-5]。一氧化氮(NO)作為信號(hào)分子或生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，參與調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育過程，如植物開花、側(cè)根形成、種子萌發(fā)、根向地性、下胚軸伸長(zhǎng)以及果實(shí)等組織的成熟和衰老等，而且還參與調(diào)節(jié)植物對(duì)生物及非生物脅迫的響應(yīng)過程[6-7]，如在干旱脅迫下，NO能提高種子的淀粉酶活性、增加種子內(nèi)促進(jìn)萌發(fā)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量、誘導(dǎo)抗氧化基因的表達(dá)、降低質(zhì)膜的透性以維持細(xì)胞的正常代謝[8]。在玉米中的研究發(fā)現(xiàn)，NO能提高根系中谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)、過氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)的活性[9]。PsbA編碼類囊體膜蛋白D1蛋白(又稱QB蛋白)，是葉綠體基因組中重要的光合基因，在小麥中的研究發(fā)現(xiàn)，干旱能降低PsbA基因的表達(dá)量，而外源施加SNP(sodium nitroprusside，NO供體)能顯著提高小麥葉片中PsbA基因的表達(dá)量，說明在小麥中NO可促進(jìn)類囊體膜蛋白D1蛋白的合成，增強(qiáng)光合組織的抗旱能力[10]。

盡管人們?cè)谥参镏幸呀?jīng)發(fā)現(xiàn)了一些受NO調(diào)控的基因，但相對(duì)于NO對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的整個(gè)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)而言還知之甚少?；诖?，采用正向遺傳學(xué)的方法，從甲基磺酸乙酯(EMS)誘變后的擬南芥突變體庫中，通過在培養(yǎng)基中施加SNP觀察其生長(zhǎng)發(fā)育表型，篩選對(duì)NO敏感的突變體，并對(duì)篩選獲得的潛在突變體進(jìn)行詳細(xì)的表型和生理分析，以期為揭示植物的NO信號(hào)網(wǎng)絡(luò)提供遺傳材料。

1 材料和方法

1.1植物材料的培養(yǎng)

擬南芥(Arabidopsisthaliana)野生型種子的生態(tài)型為Columbia(Col-0)。擬南芥在無菌培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)過程為：首先將種子在1.5 mL離心管中用70%乙醇消毒30 s，再用10%～15%次氯酸鈉溶液處理10～15 min，期間上下晃動(dòng)離心管，用無菌水漂洗3～5次，將消毒后的擬南芥種子置于4 ℃條件下處理4 d，之后均勻種植在1/2MS培養(yǎng)基上，用Parafilm膜將培養(yǎng)皿口封好后置于16 h光照/8 h黑暗、光照強(qiáng)度為100 μmol/(m2·s)、溫度為22 ℃條件下培養(yǎng)。擬南芥在營養(yǎng)土中的培養(yǎng)過程為：將擬南芥種子放在1.5 mL離心管中，添加適量水沒過種子，之后將種子放在4 ℃條件下處理4 d，均勻種植在營養(yǎng)土上，澆水后置于16 h光照/8 h黑暗、光照強(qiáng)度為100 μmol/(m2·s)、溫度為22 ℃條件下培養(yǎng)。

1.2突變體的篩選

利用EMS對(duì)擬南芥野生型種子進(jìn)行誘變獲得突變體庫，將突變體庫種子均勻撒播在含20 μmol/L SNP的滅菌的1/2MS培養(yǎng)基上，待種子萌發(fā)并生長(zhǎng)至15 d時(shí)，挑選根生長(zhǎng)相對(duì)較短的幼苗作為潛在突變體，即對(duì)NO敏感的突變體。然后將潛在突變體移至正常培養(yǎng)基上進(jìn)行恢復(fù)生長(zhǎng)1周，最后移至營養(yǎng)土中生長(zhǎng)至成熟，收取種子。將擬南芥野生型與潛在突變體的種子分別種在營養(yǎng)土中，觀察整個(gè)生長(zhǎng)周期中這些突變體的株高、果莢長(zhǎng)度、開花時(shí)蓮座葉片的數(shù)量等生長(zhǎng)發(fā)育表型，并與野生型擬南芥進(jìn)行比較，將上述表型能夠穩(wěn)定遺傳的個(gè)體作為NO敏感突變體。

1.3擬南芥突變體對(duì)NO抗性的檢測(cè)

在經(jīng)過滅菌的1/2MS培養(yǎng)基中分別添加0、10、20、30、40、50、60 μmol/L的SNP，然后將經(jīng)過消毒的擬南芥野生型和突變體種子種在培養(yǎng)基上，統(tǒng)計(jì)擬南芥野生型與突變體的萌發(fā)率，生長(zhǎng)20 d測(cè)量根長(zhǎng)，并計(jì)算相對(duì)根長(zhǎng)，相對(duì)根長(zhǎng)=處理?xiàng)l件下的根長(zhǎng)/在正常培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的根長(zhǎng)×100%。

1.4擬南芥突變體對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)

采用甘露醇(滲透脅迫)模擬干旱脅迫。培養(yǎng)皿中甘露醇模擬干旱的處理過程為在1/2MS培養(yǎng)基中分別添加0、100、200 mmol/L甘露醇，之后對(duì)培養(yǎng)基滅菌，把經(jīng)過消毒的擬南芥野生型和突變體種子種在培養(yǎng)基上，統(tǒng)計(jì)擬南芥野生型與突變體的萌發(fā)率，生長(zhǎng)20 d測(cè)量根長(zhǎng)，并計(jì)算相對(duì)根長(zhǎng)。營養(yǎng)土中甘露醇模擬干旱的處理過程為，對(duì)在正常營養(yǎng)土中生長(zhǎng)3周的擬南芥野生型和突變體nsm1植株，用300 mmol/L甘露醇溶液每周灌溉一次，3周后統(tǒng)計(jì)死亡率。

1.5擬南芥突變體吸水保水生理指標(biāo)的測(cè)定

以在營養(yǎng)土中正常生長(zhǎng)3周的擬南芥野生型與突變體植株為材料測(cè)定葉片的水勢(shì)、失水速率、蒸騰速率及氣孔導(dǎo)度。葉片水勢(shì)的測(cè)定：剪取擬南芥野生型和突變體的葉片，用研磨棒磨碎后，吸取15 mL細(xì)胞液置于測(cè)量管中，用冰點(diǎn)滲透計(jì)(Fiske one-ten osmometer) 測(cè)定葉片水勢(shì)的大小。葉片失水速率的測(cè)定：分別剪取擬南芥野生型和突變體的葉片各25片置于培養(yǎng)皿中，在溫度22 ℃、空氣濕度50%的條件下培養(yǎng)，隔一定的時(shí)間(1、3、5、7 h)稱質(zhì)量并計(jì)算葉片的失水率。葉片的蒸騰速率及氣孔導(dǎo)度采用LI-6400便攜式光合儀測(cè)定。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.6突變體的遺傳分析

將篩選得到的突變體M3代種子種于1/2MS培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)1周后移植于營養(yǎng)土中，培養(yǎng)至開花，以野生型Col-0為父本，突變體為母本，進(jìn)行雜交，得到F1代。將野生型與F1代種子種在含有50 μmol/L SNP的1/2MS培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)20 d后，以根長(zhǎng)為特征分別檢測(cè)植株對(duì)NO的抗性表現(xiàn)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果用于遺傳分析。F1代植株自交得到F2代，將F2代種子種在含有50 μmol/L SNP的1/2MS培養(yǎng)基上，以根長(zhǎng)為特征檢測(cè)植株對(duì)NO的抗性表現(xiàn)，生長(zhǎng)20 d后，統(tǒng)計(jì)對(duì)NO敏感與不敏感的植株數(shù)目，進(jìn)行遺傳分析。

2 結(jié)果與分析

2.1NO敏感突變體的篩選

從大約40 000粒種子的EMS突變體庫中篩選獲得18株候選突變體，這些突變體都不同程度地顯

示出對(duì)NO敏感的表型。其中，突變體nsm1(nitric oxide sensitive mutant 1)在正常生長(zhǎng)條件下與野生型沒有明顯的表型區(qū)別，生長(zhǎng)50 d時(shí)，植株株高均可達(dá)26 cm，果莢長(zhǎng)度均為1.52 cm，開花時(shí)蓮座葉片的數(shù)量均為8～10片。根據(jù)突變體nsm1對(duì)NO抗性的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，野生型擬南芥與突變體nsm1的萌發(fā)率沒有明顯區(qū)別；在正常生長(zhǎng)條件下，野生型擬南芥與突變體nsm1的根長(zhǎng)區(qū)別不明顯，但是在SNP處理下，突變體nsm1的根生長(zhǎng)受到的抑制程度比野生型擬南芥明顯，如在50 μmol/L SNP處理下生長(zhǎng)20 d后，野生型擬南芥的相對(duì)根長(zhǎng)為50.8%，而突變體nsm1的相對(duì)根長(zhǎng)僅為22.4%(圖1)。這些結(jié)果表明，NSM1基因?qū)M南芥的正常生長(zhǎng)發(fā)育影響不明顯，但是參與了NO相關(guān)的信號(hào)傳遞過程。

A為野生型擬南芥和突變體nsm1分別在0(左)、50(右) μmol/L SNP處理下生長(zhǎng)20 d的表型； B為野生型擬南芥和突變體nsm1在不同濃度SNP處理下的相對(duì)根長(zhǎng)(生長(zhǎng)20 d)； C為在正常培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的野生型擬南芥和突變體nsm1的表型

2.2突變體nsm1響應(yīng)干旱脅迫的表型分析

NO作為信號(hào)分子參與植物對(duì)干旱、鹽度、重金屬等[11]非生物脅迫的響應(yīng)過程。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，突變體nsm1對(duì)干旱脅迫敏感，用甘露醇模擬干旱處理檢測(cè)突變體nsm1的抗性，結(jié)果顯示，野生型擬南芥與突變體nsm1的萌發(fā)率沒有明顯區(qū)別，甘露醇對(duì)突變體nsm1根的抑制程度高于野生型擬南芥，在100 mmol/L甘露醇處理下，野生型擬南芥的相對(duì)根長(zhǎng)為83.4%，而突變體nsm1的相對(duì)根長(zhǎng)僅為45.7%(圖2)。而且，為了進(jìn)一步驗(yàn)證NSM1基因在抗旱反應(yīng)中作用，對(duì)在營養(yǎng)土中生長(zhǎng)3周的野生型擬南芥和突變體nsm1植株進(jìn)行干旱處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，野生型擬南芥的死亡率是70.2%，而突變體nsm1的死亡率為80.3%。

A為野生型擬南芥和突變體nsm1分別添加0(左)、100(右) mmol/L 甘露醇處理下生長(zhǎng)20 d的表型； B.野生型擬南芥和突變體nsm1 在不同濃度甘露醇處理下的相對(duì)根長(zhǎng)(生長(zhǎng)20 d)

2.3野生型擬南芥和突變體nsm1的吸水保水能力比較

植物的吸水能力或保水能力在抗旱過程中起著非常重要的作用，突變體nsm1對(duì)干旱敏感的表型是否與其有一定的聯(lián)系？圖3表明，突變體nsm1的水勢(shì)、失水率、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率均高于野生型擬南芥，說明突變體nsm1的保水能力比野生型擬南芥差。

2.4突變體nsm1的遺傳學(xué)分析

以突變株nsm1進(jìn)行自交和雜交，檢測(cè)F1和F2代對(duì)NO的抗性。結(jié)果表明，雜交成功的F1代用50 μmol/L SNP進(jìn)行處理，植株的根長(zhǎng)與野生型擬南芥無明顯差異，即幼苗全部對(duì)SNP不敏感，表明NSM1基因是隱性突變基因。而F2代植株中對(duì)SNP處理敏感與不敏感的植株比例為1 850∶600，卡方檢驗(yàn)結(jié)果表明符合孟德爾遺傳分離規(guī)律(3∶1)，證明nsm1突變體是由單基因控制的隱性突變體。

圖3 正常生長(zhǎng)3周的野生型擬南芥和突變體nsm1的生理指標(biāo)

3 結(jié)論與討論

NO作為一種信號(hào)分子，可在細(xì)胞間自由擴(kuò)散，調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育，并參與植物的抗逆反應(yīng)過程[12-13]。目前的相關(guān)研究表明，NO能夠有效緩解干旱脅迫對(duì)植物造成的傷害，對(duì)抗旱分子調(diào)控機(jī)制的研究也取得了一些進(jìn)展[14-16]。氣孔是植物與外界進(jìn)行物質(zhì)與能量交換的門戶，氣孔運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)能力影響植物的抗旱能力，外源NO處理小麥能夠降低氣孔導(dǎo)度與蒸騰作用，提高小麥的抗旱能力[17]；干旱脅迫下NO參與ABA調(diào)節(jié)氣孔運(yùn)動(dòng)的過程，能夠誘導(dǎo)植物葉片氣孔關(guān)閉，降低蒸騰速率，其分子機(jī)制為干旱條件下植物中NO含量增加，誘導(dǎo)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，從而抑制內(nèi)向K+通道活性或激活外向K+通道，導(dǎo)致胞內(nèi)K+濃度下降，氣孔關(guān)閉[18-20]。劉建中等[21]研究表明，擬南芥NO合成缺陷突變體noa1的耐旱性與抗旱有關(guān)基因表達(dá)的相關(guān)性不明顯。Shi等[22]研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源NO含量的升高可以激活A(yù)BA受體AtPYL5和AtPYL4的表達(dá)，該受體的過表達(dá)植株可以通過調(diào)節(jié)活性氧代謝和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累而增強(qiáng)植物的抗旱能力。但是，由于NO相關(guān)突變體稀少，目前對(duì)于其調(diào)控的分子機(jī)制還知之甚少。

本研究從EMS誘變獲得的擬南芥突變體庫中篩選到1株在NO處理下生長(zhǎng)明顯受到抑制、正常條件下與野生型生長(zhǎng)狀況并無明顯區(qū)別的突變體nsm1。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，突變體nsm1對(duì)干旱脅迫也表現(xiàn)出敏感的表型，突變體nsm1的水勢(shì)、失水率、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率均高于野生型，說明NSM1基因可能參與了干旱脅迫與NO的信號(hào)交叉途徑。遺傳學(xué)分析表明，NSM1是單基因隱性突變。該突變體的獲得將為研究植物干旱脅迫調(diào)控途徑的分子機(jī)制提供理想的遺傳材料。

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Screening and Genetic Analysis of Nitric Oxide Sensitive Mutant inArabidopsisthaliana

XIA Jinchan,ZHANG Xiaoli*

(Henan University of Traditional Chinese Medicine,Zhengzhou 450008,China)

In order to investigate the molecular regulation mechanism of nitric oxide inArabidopsis,we screened nitric oxide(NO)-sensitive mutants from an EMS mutant library in the plants.As a result,nsm1 mutant(nitric oxide sensitive mutant 1) was screened from this library.Mutantnsm1 was sensitive to nitric oxide though there was no obvious difference of phenotype between the mutant and wild type under normal growth conditions.Under 50 μmol/L SNP treatment,the relative root length of wild type(compared with root length in normal growth) was 50.8%,while the relative root length of mutant was 22.4%.Further study found that mutantnsm1 was sensitive to drought stress simulated by mannitol.Under 100 mmol/L mannitol treatment,the relative root length of wild type was 83.4%,while the relative root length of mutant was 45.7%.It possibly related with high dehydration rate,water potential,stomatal and transpiration rate in mutantnsm1.Genetic analysis suggested thatnsm1 was a single recessive mutant．

Arabidopsisthaliana； nitric oxide； mutantnsm1； drought

Q945.78;Q344+.12

A

1004-3268(2017)10-0021-05

2017-05-06

國家自然科學(xué)青年基金項(xiàng)目(31600206)

夏金嬋(1978-)，女，河南鄭州人，副教授，博士，主要從事分子生物學(xué)研究。E-mail:epsalon@163.com

*通訊作者：張小莉(1962-)，女，河南鄭州人，教授，博士，主要從事分子生物學(xué)研究。E-mail:zxl7666@163.com