鵝腸道纖維素分解菌的分離與優(yōu)化組合研究

周海柱，高云航，徐 博，陶大鵬，勾長(zhǎng)龍，騰戰(zhàn)偉，婁玉杰

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118）

鵝腸道纖維素分解菌的分離與優(yōu)化組合研究

周海柱，高云航，徐 博，陶大鵬，勾長(zhǎng)龍，騰戰(zhàn)偉，婁玉杰*

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118）

本研究旨在從鵝腸道中分離、鑒定纖維素分解菌，并進(jìn)行優(yōu)化組合，通過(guò)平板法篩選纖維素分解菌，根據(jù)菌株形態(tài)、培養(yǎng)特征、生理生化試驗(yàn)和16S rDNA序列分析確定其種屬，并利用菌株拮抗試驗(yàn)和交叉酶活力測(cè)定試驗(yàn)對(duì)優(yōu)勢(shì)纖維素分解菌進(jìn)行優(yōu)勢(shì)組合。結(jié)果表明：從鵝腸道樣品中分離出纖維分解菌29株，其中需氧菌19株、厭氧菌10株；8株纖維分解能力較強(qiáng)的菌株分別為膠質(zhì)類(lèi)芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、梭狀芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、解纖維梭菌、溶血性葡萄球菌、綠膿假單胞菌；蠟樣芽孢桿菌與綠膿假單胞菌組合的酶活力最高，達(dá)到9.86 U/mL。

鵝；腸道；纖維分解菌；優(yōu)化

在養(yǎng)鵝成本中，飼料成本占70%以上，因此提高鵝對(duì)粗飼料的利用效率可顯著減少養(yǎng)殖成本。鵝對(duì)日糧纖維的分解是一個(gè)復(fù)雜的、多種微生物共同作用的結(jié)果，單一腸道纖維素分解菌的應(yīng)用不能真正實(shí)現(xiàn)纖維素分解系統(tǒng)的穩(wěn)定運(yùn)行，利用纖維素分解功能菌組合成的菌系是提高鵝對(duì)日糧纖維消化利用的有效手段。目前有學(xué)者已從土壤[1]、海水[2]、糞便[3]、腐敗植物[4]和動(dòng)物胃腸道[5]等不同生境中分離篩選出了纖維素分解菌，但從鵝腸道分離鑒定纖維素分解菌的研究較少，特別是對(duì)鵝腸道纖維素分解菌優(yōu)化組合的研究鮮有報(bào)道。本研究通過(guò)對(duì)鵝腸道中纖維分解菌進(jìn)行分離培養(yǎng)、鑒定，根據(jù)菌株形態(tài)、生理生化試驗(yàn)和16S rDNA測(cè)序等確定其種屬，并利用菌株拮抗試驗(yàn)和交叉酶活力測(cè)定試驗(yàn)對(duì)優(yōu)勢(shì)纖維素分解菌進(jìn)行優(yōu)勢(shì)組合，為進(jìn)一步研究鵝腸道細(xì)菌分解纖維的機(jī)制及開(kāi)發(fā)微生態(tài)制劑提高纖維物質(zhì)消化率提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 卡洛斯鵝由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院提供。鵝屠宰后迅速取出十二指腸、回腸、盲腸并分別進(jìn)行結(jié)扎，經(jīng)75%酒精擦拭消毒后，將各腸段分別剪開(kāi)，經(jīng)無(wú)菌生理鹽水沖洗后，輕輕刮取腸道黏膜，收集于凍存管中，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：每升培養(yǎng)基中含有牛肉膏3.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g、瓊脂15.0 g。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基：每升培養(yǎng)基中含有馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g和瓊脂20 g。發(fā)酵培養(yǎng)基：每升培養(yǎng)基中含有羧甲基纖維素鈉5 g，牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g。

1.1.3 主要試劑與配制方法 Ex Taq聚合酶、pMD 18-T Simple Vector、Amp、DNA Marker DL2000（寶生物工程有限公司）；蛋白酶K、溶菌酶、凝膠回收試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；E.coli.DH5α（康為世紀(jì)有限公司）；PCR引物、牛肉浸膏、蛋白胨、瓊脂粉（生工生物工程（上海）股份有限公司）； Na2SO3、NaOH、HCl等常規(guī)化學(xué)試劑（沈陽(yáng)化學(xué)試劑廠）。

剛果紅染色液：準(zhǔn)確稱(chēng)量1 g剛果紅試劑加入1 000 mL蒸餾水配制成1 mg/mL的剛果紅染色液。

DNS試劑：準(zhǔn)確稱(chēng)取200 g酒石酸鉀鈉，溶于少量的蒸餾水中，加熱溶解后，加入3,5-二硝基水楊酸和NaOH各10 g，待試劑溶解后分別加入2 g苯酚和5 g無(wú)水Na2SO3，冷卻至室溫后定容至1 000 mL，室溫放置備用。

1.1.4 主要儀器 超凈工作臺(tái)（江蘇蘇凈集團(tuán)有限公司）；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（島津國(guó)際貿(mào)易上海有限公司）；振蕩培養(yǎng)箱BSD-150（北京昊天科技有限公司）；凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)UVP公司）；Gene Amp PCR System9700（珀金埃爾默儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株分離與純化 以無(wú)菌法分別稱(chēng)取5 g卡洛斯鵝腸黏膜置于裝有玻璃珠和45 mL蒸餾水的錐形瓶中，充分搖勻后置于搖床中振蕩2 h，靜置1 h后取上清液梯度稀釋?zhuān)瑢?0-1、10-2、10-33個(gè)梯度菌液涂布于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，分別進(jìn)行需氧和厭氧培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)1～2 d。觀察培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)，根據(jù)菌落形態(tài)差異挑取菌落劃線(xiàn)培養(yǎng)，直至分離出單一的純培養(yǎng)菌落。

1.2.2 纖維素分解菌株的篩選 采用點(diǎn)種在纖維素酶篩選培養(yǎng)基上，培養(yǎng)12 ～24 h，分別用剛果紅染色劑和1 mol/L NaCl溶液各處理15 min，測(cè)定水解圈直徑。

1.2.3 形態(tài)學(xué)特征觀察 對(duì)菌株進(jìn)行革蘭氏染色、芽孢染色等形態(tài)學(xué)和生理生化試驗(yàn)，參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[6]進(jìn)行菌落形態(tài)和培養(yǎng)特征觀察。

1.2.4 分子生物學(xué)鑒定 提取細(xì)菌總DNA[7]，采用細(xì)菌通用引物（P-1：5'-AGAGTTTGATCCTGG CTCAG-3'，P-2：5'-GGTTACCTTGTTACGA CTT-3'），進(jìn)行16S rDNA 擴(kuò)增。反應(yīng)體系：模板DNA 1.5 μL，引物P-1 0.5 μL，引物P-2 0.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs Mixture 2.0 μL，10×Ex Taq Buffer（Mg2+Plus） 2.5 μL，Ex Taq（5 U/μL） 0.3 μL，ddH2O 17.7 μL，反應(yīng)體系總體積為25.0 μL。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃，60 s；50℃，45 s；72℃，1 min，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后采用凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收與純化，參照pMD18-T Simple Vector試劑盒進(jìn)行連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞（E.coli.DH5α）中，提取重組質(zhì)粒，將陽(yáng)性重組質(zhì)粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。利用BLAST將測(cè)序結(jié)果與GenBank已知序列進(jìn)行對(duì)比，根據(jù)菌株間的親緣關(guān)系確定菌株的種屬。

1.2.5 纖維素分解菌優(yōu)勢(shì)組合的確定

拮抗試驗(yàn)：將試驗(yàn)獲得的纖維素分解菌兩兩組合進(jìn)行拮抗試驗(yàn)。菌株在NA培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線(xiàn)不相交試驗(yàn)，倒置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，觀察菌株的生長(zhǎng)情況，交叉處不生長(zhǎng)的菌株說(shuō)明有拮抗作用。

總酶活力和交叉組合酶活力測(cè)定（濾紙酶活力）：配制葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)溶液，并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)[8]?？偯富盍Φ臏y(cè)定首先要制備酶液[9]，取0.5 mL酶液和0.05 mol/L的檸檬酸緩沖液（pH為4.5）1.5 mL，加入濾紙條50 mg （新華定量濾紙，約1 cm×6 cm），50℃水浴30 min，應(yīng)用3,5-二硝基水楊酸法（DNS）法在540 nm處測(cè)定吸光值并計(jì)算濾紙酶活力。交叉酶活力測(cè)定首先將無(wú)拮抗作用的菌株兩兩組合接種至含50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的200 mL錐形瓶中，在37℃、160 r/min條件下培養(yǎng)48 h，10 000 r/min離心10 min，取上清液，按照總酶活力測(cè)定方法，選擇酶活力較高且大于單一菌株酶活力的組合為最優(yōu)組合。

1個(gè)酶活單位（U/mL）即每毫升酶液每分鐘水解纖維素產(chǎn)生1 μg葡萄糖所需要的酶量。

2 結(jié) 果

2.1 纖維素分解菌的分離與篩選結(jié)果 從鵝腸段黏膜中共分離出29株菌，其中從盲腸中分離出12株，其中需氧菌8株，厭氧菌4株；從回腸中分離出8株，其中需氧菌3株，厭氧菌5株；從十二指腸中分離出9株，其中需氧菌8株，厭氧菌1株。

圖1 產(chǎn)纖維素酶菌株在培養(yǎng)基上的水解圈

經(jīng)羧甲基纖維素鈉平板法和剛果紅染色法篩選，從鵝腸道黏膜中篩選出8株具有纖維素分解能力的菌株，其中盲腸中3株：M4、M5、M8，回腸中3株：H2、H4、H6，十二指腸中2株：S2和S6。其中H6和S6為厭氧菌，其余均為需氧菌（圖1）。2.2 功能菌株形態(tài)及生理生化特征 如表1所示，菌株H2、H4、 H6、M4、M5為革蘭氏陽(yáng)性桿菌，S2為革蘭氏陽(yáng)性球菌，M8和S6為革蘭氏陰性桿菌。由表2可知，8株菌均能利用D-葡萄糖和蔗糖，液化明膠；菌株H2、H4、M5、S6甲基紅陽(yáng)性；V-P試驗(yàn)和檸檬酸鹽利用試驗(yàn)只有S6為陰性，其余均為陽(yáng)性；S2和S6吲哚試驗(yàn)陰性，其余為陽(yáng)性；8株菌中只有M8和S6不能水解淀粉；8株菌除S2接觸酶陰性，其余菌株均為接觸酶陽(yáng)性；H6、M5和M8硫化氫陽(yáng)性，其余為陰性；M8脲酶陰性，其余菌株為陽(yáng)性；M5和S2硝酸鹽還原為陰性，其余為陽(yáng)性。初步認(rèn)定菌株H2、H4、M4、M5均為芽孢桿菌屬；H6為梭菌屬，M8為腸球菌屬，S2為葡萄球菌屬，S6為假單胞菌屬。

2.3 分子生物學(xué)鑒定 成功提取8個(gè)菌株基因組DNA（圖2），片段大小為20 000 bp左右，與預(yù)期結(jié)果相符。將其作為PCR模板擴(kuò)增其16S rRNA基因，在1 500 bp左右得到該基因的擴(kuò)增帶（圖3），經(jīng)回收純化后將其連接于pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌細(xì)胞，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。目的片段序列大小分別為H4：1 451 bp、M4：1 452 bp、S2：1 452 bp、M5：1 448 bp、S6：1 434 bp、H2：1 451 bp、H6：1 448 bp、M6：1 680 bp。

表1 功能菌株的形態(tài)學(xué)特征

表2 功能菌株的生理生化試驗(yàn)結(jié)果

圖2 功能菌株總基因組提取結(jié)果

Blast對(duì)比可知，H2與Paenibacillus cookii的親緣關(guān)系最近，同源性為99%，確定菌株H2為膠質(zhì)類(lèi)芽孢桿菌；H4與Bacillus subtilis strain CJ2的親緣關(guān)系最近，同源性為100%，確定菌株H4為枯草芽孢桿菌；H6與Clostridium lentocellum DSM 5427的同源性為99%，確定菌株H6為梭狀芽孢桿菌；M4與 Bacillus licheniformis strain C1-5-8的親緣關(guān)系最近，同源性為98%，確定菌株M4為地衣芽孢桿菌；M5與Bacillus cereus strain P14的親緣關(guān)系最近，同源性為99%，確定菌株M5為蠟樣芽孢桿菌；M8與Clostridium cellulolyticum H10的同源性為99%，確定菌株M8為解纖維梭菌；S2與Staphylococcus haemolyticus strain CIFRI P-TSB-72的親緣關(guān)系最近，同源性為99%，確定菌株S2為溶血性葡萄球菌；S6與Pseudomonas aeruginosa strain F1的同源性為99%，確定菌株S6為綠膿假單胞菌。

圖3 功能菌株P(guān)CR產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.4 拮抗試驗(yàn) 如表3所示，菌株H2與H6、M4、M8、S2、S6均有拮抗作用，只與H4、M5無(wú)拮抗作用；菌株S2與菌株H2、H4、M4、M5、S6有拮抗作用，與菌株H6、M8無(wú)拮抗作用，其余菌株之間均無(wú)拮抗作用。因此，結(jié)合前期水解圈測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果棄去菌株H2和S2，選取其余6株菌進(jìn)行酶活力測(cè)定試驗(yàn)。

表3 菌株之間的拮抗關(guān)系

2.5 交叉組合酶活力

2.5.1 交叉組合酶活力測(cè)定結(jié)果 由表4可知，單菌株酶活力大小依次為S6>M5>M4>H6>M8>H4，其中菌株S6酶活力高達(dá)7.52 U/mL。菌株M4與M5、S6組合后總酶活力為6.77、7.77 U/mL，較單一菌株酶活力略有提高；而菌株M5與S6組合后的總酶活力達(dá)到9.86 U/mL，組合后的總酶活力比M5單菌株酶活力提高了3.31 U/mL，比菌株S6單菌株酶活力提高了2.34 U/mL，因此，菌株M5與S6為產(chǎn)纖維素酶的最優(yōu)組合。

3 討 論

高效纖維分解菌篩選一直是學(xué)者努力研究的方向[10]，高云航等[9,11]、劉占英等[12]分別采用剛果紅平板法從鵝腸道、綿羊瘤胃中分離篩選出了纖維素分解菌株。本研究從卡洛斯鵝腸道中共篩選出8株具有纖維素分解能力的菌株，與高云航等[9]、劉占英等[12]分離的纖維素分解菌數(shù)量相比，本研究中篩選出的纖維分解菌數(shù)量較多，這可能與試驗(yàn)動(dòng)物腸道生境和飼養(yǎng)管理等因素有關(guān)。由于纖維素酶活力測(cè)定缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，不同報(bào)道中纖維素降解菌的酶活力差別較大[13]，因此不同測(cè)定方法測(cè)定的酶活力不具有可比性。

由于受菌株變異以及屬類(lèi)菌種多樣性的客觀現(xiàn)實(shí)影響，傳統(tǒng)的生理生化試驗(yàn)并不能準(zhǔn)確地對(duì)菌株進(jìn)行鑒定，利用16S rDNA序列進(jìn)行同源性比對(duì)是鑒定細(xì)菌的重要方法，與傳統(tǒng)的生理生化方法結(jié)合，可對(duì)細(xì)菌的種屬進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定[14]。本研究中經(jīng)分子生物學(xué)鑒定，8株纖維素分解菌株分別確定為膠質(zhì)類(lèi)芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、梭狀芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、解纖維梭菌、溶血性葡萄球菌、綠膿假單胞菌，同源性均在98%以上，與高云航等[9]研究結(jié)果一致。

本研究中大多數(shù)菌株組合的總酶活力都處于兩菌株單一酶活力之間，但一些菌株也表現(xiàn)出菌株的協(xié)同作用，其中菌株M5與S6為產(chǎn)纖維素酶的最優(yōu)組合。蠟樣芽孢桿菌與綠膿假單胞菌分別產(chǎn)葡聚糖內(nèi)切酶和羧甲基纖維素酶，這2種酶在纖維素的分解中可能存在協(xié)同作用，這2種菌的組合提高了總酶活力。馬鳳蓮[15]研究指出，混合菌株可以相互補(bǔ)充，促進(jìn)纖維分解，與本研究結(jié)果一致。另外，受分離技術(shù)和培養(yǎng)方法等因素制約，還有很多具有木質(zhì)纖維素分解功能的微生物未被發(fā)現(xiàn)[16]。因此，需要從分離技術(shù)和培養(yǎng)方法方面對(duì)鵝腸道纖維分解菌進(jìn)行深入研究。

表4 交叉組合總酶活力測(cè)定結(jié)果 U/mL

4 結(jié) 論

本研究從鵝腸段黏膜中共分離具有纖維分解能力的菌株29株，其中需氧菌19株，厭氧菌10株。經(jīng)生化和分子鑒定，8株纖維素分解菌株分別為膠質(zhì)類(lèi)芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、梭狀芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、解纖維梭菌、溶血性葡萄球菌、綠膿假單胞菌，其中蠟樣芽孢桿菌與綠膿假單胞菌為產(chǎn)纖維素酶的最優(yōu)組合。

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Isolation and Identification and Optimal Combination of Cellulose Decomposing Bacteria from Goose Intestinal Tracts

ZHOU Hai-zhu, GAO Yun-hang, XU Peng, TAO Da-peng, GOU Chang-long, TENG Zhan-wei, LOU Yu-jie*

(College of Animal Science and Technology, Jilin Agricultural University, Jilin Changchun 130118, China)

The present study was conducted to isolate cellulose decomposing bacteria from goose intestine tracts, and identify their optimal combination. Isolated cellulose decomposing bacteria were scanned and identified by morphology,physiological biochemical characteristics and 16S rDNA gene sequence. The optimal combination between them was scanned via orthogonal enzyme activity assay and antagonism test of strains. The result showed that 29 cellulose decomposing bacteria strains including 19 aerobic strains and 10 facultative anaerobe strains were isolated from goose intestine tracts. Eight strains occupying high capability of decomposing cellulose were identified as Paenibacillus mucilaginosus, Bacillus subtilis, Clostridium, Bacillus licheniformis, Bacillus cereus, Clostridium cellulolyticum,hemolytic staphylococcus and pseudomonas aeruginosa. The highest cellulase activity of the combination between Bacillus cereus and Pseudomonas aeruginosa reached 9.86 U/mL.

Goose; Intestinal tracts; Cellulose decomposing bacteria; Optimization

S835.5

A

10.19556/j.0258-7033.2017-10-096

2017-04-05；

2017-06-05

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2016YFD0501409-03）；國(guó)家自然基金（NSFC：31372331）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng) （CARS-38）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專(zhuān)項(xiàng)（201303091）作者簡(jiǎn)介：周海柱（1982-），男，吉林長(zhǎng)春人，博士，主要從事飼草資源開(kāi)發(fā)與利用研究，E-mail：goodhaizhu@163.com

*通訊作者：婁玉杰，E-mail：louyujie560305@126.com