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    “標(biāo)本配穴”電針對(duì)糖尿病腎病的改善作用及腎臟SIRT1 蛋白表達(dá)水平的影響?

    2017-10-21 08:18:00何文娟周煥嬌王雅媛唐宏圖梁鳳霞
    關(guān)鍵詞:配穴電針腎臟

    何文娟,陳 麗,舒 晴,周煥嬌,王雅媛,高 炎,陳 瑞,吳 松,唐宏圖,梁鳳霞△

    (1. 湖北中醫(yī)藥大學(xué)針灸骨傷學(xué)院/針灸治未病湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心,武漢 430061; 2.武漢市第九醫(yī)院,武漢 430082; 3. 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科,武漢 430022)

    【針灸研究】

    “標(biāo)本配穴”電針對(duì)糖尿病腎病的改善作用及腎臟SIRT1蛋白表達(dá)水平的影響?

    何文娟1,2,陳 麗1,舒 晴1,周煥嬌1,王雅媛1,高 炎1,陳 瑞3,吳 松1,唐宏圖1,梁鳳霞1△

    (1. 湖北中醫(yī)藥大學(xué)針灸骨傷學(xué)院/針灸治未病湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心,武漢 430061; 2.武漢市第九醫(yī)院,武漢 430082; 3. 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科,武漢 430022)

    目的:觀察“標(biāo)本配穴”電針干預(yù)方法對(duì)糖尿病腎病大鼠模型腎功能、超微結(jié)構(gòu)的改善作用及腎臟SIRT1蛋白表達(dá)的影響。方法: Zucker fa/fa大鼠12只按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型對(duì)照組及非電針刺激組、電針治療組,另選其同窩瘦鼠(Zucker+/?)4只作為空白對(duì)照組。非電針刺激組和電針治療組分別治療3周,于治療后第21天測(cè)其4組大鼠的飲水量、進(jìn)食量、體質(zhì)量和空腹血糖、餐后血糖;治療3周后大鼠處死,觀察血清白蛋白、血肌酐、血尿素、血尿氮、腎臟超微結(jié)構(gòu)及SIRT1蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:與模型對(duì)照組比較,“標(biāo)本配穴”電針治療組大鼠進(jìn)食量減少,體質(zhì)量降低,空腹血糖、餐后血糖降低,血肌酐、血尿素、血尿氮水平降低,腎臟超微結(jié)構(gòu)得到明顯改善,SIRT1蛋白表達(dá)增多。結(jié)論:“標(biāo)本配穴”電針能夠改善糖尿病腎病腎功能和超微結(jié)構(gòu),可能與其上調(diào)腎臟SIRT1蛋白表達(dá)水平有關(guān)。

    糖尿病腎??;標(biāo)本配穴;電針;SIRT1;Zucker大鼠

    糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病常見的慢性微血管并發(fā)癥,是終末期腎病的主要原因[1],也是糖尿病致死致殘的最主要原因之一。

    近年來研究表明,沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent mating type information regulation 2 homolog 1, SIRT1)與糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),而成為糖尿病腎病的一個(gè)新潛在治療靶點(diǎn)[2-3]。SIRT1可以從增加腎臟游離脂肪酸代謝、改善腎臟線粒體功能、促進(jìn)腎臟細(xì)胞恢復(fù)自噬、減少腎臟細(xì)胞凋亡、抑制炎癥產(chǎn)生、減輕腎臟纖維化等方面延緩糖尿病腎病進(jìn)程[4]。而在糖尿病腎病動(dòng)物模型Zucker fa/fa大鼠中SIRT1表達(dá)下降[5]。因此,我們采用“標(biāo)本配穴”電針刺激糖尿病腎病大鼠,觀察“標(biāo)本配穴”電針對(duì)糖尿病腎病的改善作用及腎臟SIRT1蛋白表達(dá)的影響。

    1 材料與方法

    1.1 動(dòng)物

    選擇7周齡雄性Zuckerfa/fa大鼠12只及其同窩瘦鼠4只(由北京維通利華實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司提供,許可證號(hào)SCXK(京)2012-0001,大鼠(動(dòng)物許可證號(hào)為SYXK(鄂)2010-0057)在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院SPF級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)間飼養(yǎng),溫度(23±2)℃,濕度50%~70%,12 h明暗交替。實(shí)驗(yàn)過程遵守《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理與福利》相關(guān)原則和規(guī)定。

    1.2 主要試劑與儀器

    RIPA裂解液(碧云天生物技術(shù)研究所);PMSF(碧云天生物技術(shù)研究所);BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所);SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5X)、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所); PVDF膜(Millipore);SIRT1 多克隆兔抗、β-actin多克隆兔抗(美國Santa Cruz 公司,批號(hào)sc-15404、sc-9104);蛋白Marker (美國Fermentas 公司,批號(hào)26616)。

    針灸針(環(huán)球牌0.30×13 mm一次性針灸針); HANS LH202H 型韓氏電針儀(南京濟(jì)生醫(yī)療科技醫(yī)療有限公司);精密電子秤(SF- 400A,上海志榮電子科技公司);快速血糖儀(強(qiáng)生(中國)投資有限公司); ELX800 酶標(biāo)儀(美國Biotek 公司);DYY-7C型電泳儀(北京市六一儀器廠); EBA12R 低溫離心機(jī)(德國Hettich 公司);日立H2600型透射電鏡(武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院電鏡實(shí)驗(yàn)室)。

    1.3 分組及處理方法

    將12只Zuckerfa/fa大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型對(duì)照組(B組)、非電針刺激組(C組)、電針治療組(D組)各4只,另選無脂質(zhì)等代謝紊亂、無胰島素抵抗的同窩瘦鼠(Zucker +/?)4只為正常對(duì)照組(A組)。

    C組和D組大鼠按“標(biāo)本配穴”法,取“本”穴“關(guān)元”“足三里”和“標(biāo)”穴“中脘”“豐隆”[6]?!瓣P(guān)元”向恥骨聯(lián)合部斜刺3 mm左右,“中脘”向劍突方向斜刺3 mm左右,“足三里”和“豐隆”直刺3 mm左右連接電針治療儀,接線方式為同側(cè)負(fù)極接“足三里”穴,正極接“豐隆”穴,另一組電針負(fù)極接“關(guān)元”,正極接“中脘”,其中足三里和豐隆兩穴為左右交替使用。C組不通電,D組通電,頻率2Hz,強(qiáng)度1mA,留針10 min。隔日針刺1次,共治療3周。A組和B組大鼠不給予電針或非電針刺激,僅與C組、D組以相同方法、相同時(shí)間段內(nèi)抓取固定。

    1.4 檢測(cè)指標(biāo)與方法

    1.4.1 大鼠一般情況 在治療后第21天測(cè)量各組大鼠的飲水量、進(jìn)食量和體質(zhì)量。

    1.4.2 大鼠空腹血糖、餐后血糖 在治療后第21天采用尾靜脈采血的方式,對(duì)所有大鼠的空腹血糖及餐后血糖進(jìn)行測(cè)量。測(cè)量空腹血糖之前,大鼠禁食不禁水12 h。

    1.4.3 檢測(cè)大鼠血清白蛋白、血肌酐、血尿氮和血尿酸 3周治療結(jié)束后,各組大鼠給予腹腔10%水合氯醛注射麻醉(劑量為0.35 ml/ 100 g),快速處死,心尖取血入抗凝管,送往我校附屬醫(yī)院湖北省中醫(yī)院檢測(cè)血清白蛋白、血肌酐、血尿氮和血尿酸。

    1.4.4 大鼠腎臟超微結(jié)構(gòu)觀察 在冰上迅速取腎臟1 mm3大小的組織塊,用4%冷戊二醛溶液固定,送往我校合作單位武漢大學(xué)用于透射電子顯微鏡觀察。

    1.4.5 大鼠腎臟SIRT1蛋白表達(dá) 用化學(xué)免疫印跡法檢測(cè)腎組織SIRT1蛋白表達(dá)水平,取綠豆粒大小的腎臟組織在碎冰中研磨,裂解組織提取總蛋白,BCA 法進(jìn)行蛋白濃度定量。制膠,各樣本均上樣30 μg/孔蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 電泳,并轉(zhuǎn)至PVDF膜上,5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,分別加入β-actin和SIRT1一抗于4 ℃ 下孵育1.5 h,二抗封閉,孵育1 h洗滌。加入化學(xué)發(fā)光底液PlusA液和PlusB液,暗室中用X 線片曝光、顯影、定影,置于成像儀中進(jìn)行定量分析。

    1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    2 結(jié)果

    2.1 各組大鼠一般情況

    表1顯示,在治療后第21天,各組大鼠的飲水量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與空白對(duì)照組比較,其他3組進(jìn)食量顯著增多(P<0.01),體質(zhì)量顯著上升(P<0.01)。與模型對(duì)照組比較,非電針刺激組的進(jìn)食量顯著減少(P<0.01),體質(zhì)量雖有所減輕但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);電針治療組進(jìn)食量顯著減少(P<0.01),體質(zhì)量明顯降低(P<0.05)。

    2.2 各組大鼠空腹血糖、餐后血糖比較

    表1顯示,在治療后第21天與空白對(duì)照組比較,其他3組的空腹血糖、餐后血糖均顯著升高(P<0.01)。與模型對(duì)照組比較,非電針刺激組餐后血糖明顯降低(P<0.05),而空腹血糖差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);電針治療組大鼠空腹血糖和餐后血糖均明顯下降(P<0.05)。

    表1 各組大鼠飲水量、進(jìn)食量、體質(zhì)量、空腹血糖、餐后血糖比較

    注:與空白對(duì)照組比較:△△P<0.01;與模型對(duì)照組比較:*P<0.05,**P<0.01

    表2 各組大鼠血清白蛋白、血肌酐、血尿酸、血尿氮和SIRT1蛋白灰度比值比較

    注:與空白對(duì)照組比較:△P<0.05,△△P<0.01;與模型對(duì)照組比較:*P<0.05,**P<0.01

    2.3 各組大鼠血清白蛋白、血肌酐、血尿氮和血尿酸比較

    表2顯示,各組大鼠血清白蛋白濃度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與空白對(duì)照組比較,非電針刺激組血肌酐、血尿酸濃度明顯升高(P<0.05),血尿酸濃度顯著升高(P<0.01);電針治療組血肌酐、血尿酸、血尿氮濃度雖然升高,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與模型對(duì)照組比較,非電針刺激組血肌酐、血尿氮濃度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),血尿酸濃度明顯降低(P<0.05);電針治療組血肌酐、血尿酸濃度明顯降低(P<0.05),血尿酸濃度顯著降低(P<0.01)。

    2.4 各組大鼠電鏡觀察結(jié)果

    圖1顯示,空白對(duì)照組大鼠基底膜結(jié)構(gòu)良好,足突排列較為整齊清晰;內(nèi)皮孔清晰可見,內(nèi)皮細(xì)胞核呈細(xì)長形居中,核仁明顯;足細(xì)胞體積較大,形態(tài)不規(guī)則,排列于基底膜外側(cè)。模型對(duì)照組大鼠基底膜出現(xiàn)顯著增厚,尤其是在足細(xì)胞側(cè)出現(xiàn)駝峰狀增厚,上足突增寬;內(nèi)皮細(xì)胞體積縮小;足細(xì)胞體積腫脹,數(shù)量減少。非電針治療組基底膜出現(xiàn)較明顯增厚,足突排列不整齊,部分足突出現(xiàn)彌漫性融合甚至消失;內(nèi)皮細(xì)胞萎縮,足細(xì)胞固縮數(shù)量減少。電針治療組基底膜結(jié)構(gòu)較好,偶見增厚和上足突增寬;內(nèi)皮細(xì)胞體積縮小,內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見多泡小體,足細(xì)胞體積較大,形態(tài)排列均不規(guī)則。

    圖1 “標(biāo)本配穴”電針對(duì)糖尿病腎病大鼠腎臟超微結(jié)構(gòu)影響

    2.5 各組大鼠腎組織SIRT1蛋白表達(dá)比較

    表2圖2顯示,與空白對(duì)照組比較,其他3組SIRT1蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.01)。與模型對(duì)照組比較,非電針刺激組SIRT1蛋白表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);電針治療組SIRT1蛋白表達(dá)明顯增多(P<0.05)。

    圖2 “標(biāo)本配穴”電針對(duì)糖尿病腎病大鼠腎臟SIRT1蛋白表達(dá)的影響

    3 討論

    目前針對(duì)糖尿病腎病尚無特效治療方法,主要是通過運(yùn)動(dòng)、低蛋白飲食、控制血糖血壓、降脂和血管緊張素等藥物來治療[7-8]。這些方法對(duì)糖尿病腎病雖有緩解作用,但治療效果不明顯,且長期服用西藥對(duì)人體肝腎功能損傷較大。因此,更多的治療糖尿病腎病的方法需要被研究揭示?,F(xiàn)有研究已證實(shí),針灸可以從調(diào)節(jié)糖脂代謝、降低尿蛋白排泄率、改善腎功能、增加腎臟血流灌注等方面治療糖尿病腎病[9-12]。

    Zucker fa/fa大鼠是目前公認(rèn)的2型糖尿病和肥胖的遺傳性大鼠模型,不僅表現(xiàn)為血脂等代謝紊亂,胰島素分泌缺失(β細(xì)胞功能受損)、胰島素利用障礙(肝臟和肌肉等組織胰島素抵抗)和糖耐量異常等特征[5],還有腎小球、腎小管的損傷及蛋白尿、肌酐清除率下降等,一系列證據(jù)表明Zucker fa/fa大鼠中存在糖尿病腎病[13-16]。

    本實(shí)驗(yàn)以中醫(yī)針灸“治未病”理論為指導(dǎo),提出“標(biāo)本配穴”法[17],即固護(hù)正氣腧穴為本、祛除邪氣腧穴為標(biāo),增強(qiáng)機(jī)體抵抗病邪能力為本,同時(shí)利導(dǎo)邪氣排除,注重調(diào)動(dòng)機(jī)體整體潛在抗病能力為標(biāo),標(biāo)本同治達(dá)到防治疾病的目的,兩者配合應(yīng)用腧穴配伍方法[18]。選取關(guān)元、足三里、中脘、豐隆進(jìn)行針灸治療。關(guān)元為任脈與足三陰經(jīng)交會(huì)穴,針之可以益精補(bǔ)氣,扶助人體先天之本;足三里為胃經(jīng)合穴和胃腑之下合穴,針之可補(bǔ)益氣血生化之源,固護(hù)后天之本;關(guān)元、足三里相配合,兼顧先天和后天,補(bǔ)益正氣;中脘穴位胃之募穴,八會(huì)穴之腑會(huì),針之可以健脾和胃,通降腑氣;豐隆為胃經(jīng)之絡(luò)穴,具有化痰定喘、寧心安神之功;中脘、豐隆配合可調(diào)理腸胃、化痰和胃、祛除邪氣。四穴配合固護(hù)先天和后天,祛邪防微,可達(dá)以治為防、防治結(jié)合之目的。

    另外有研究發(fā)現(xiàn),電針尤其是低頻電針能夠促進(jìn)β內(nèi)啡肽的釋放,增強(qiáng)胰島素分泌[19],改善糖尿病,因此本研究采用低頻電針進(jìn)行干預(yù)。

    本實(shí)驗(yàn)研究表明,“標(biāo)本配穴”電針能夠減少糖尿病腎病大鼠的進(jìn)食量,降低其體質(zhì)量,但對(duì)其飲水量無明顯影響;“標(biāo)本配穴”電針也能夠降低糖尿病腎病大鼠的空腹血糖和餐后血糖;雖然“標(biāo)本配穴”電針對(duì)糖尿病腎病大鼠的血清白蛋白無明顯影響,但能顯著降低其血肌酐、血尿酸、血尿氮的濃度。這些結(jié)果提示, “標(biāo)本配穴”電針能夠改善糖尿病腎病的腎功能,而且“標(biāo)本配穴”電針對(duì)糖尿病腎病大鼠腎臟的超微病理學(xué)結(jié)構(gòu)有明顯改善作用,還能顯著上調(diào)糖尿病腎病大鼠SIRT1蛋白的表達(dá)水平。

    課題組前期的研究顯示,“標(biāo)本配穴”電針能夠改善高脂飲食所致胰島素抵抗大鼠的胰島素敏感性,這與“標(biāo)本配穴”電針提高骨骼肌SIRT1蛋白表達(dá)水平有關(guān)[20]。有研究發(fā)現(xiàn),電針能治療膝骨關(guān)節(jié)炎,其作用機(jī)制與電針提高膝骨關(guān)節(jié)軟骨的SIRT1表達(dá)相關(guān)[21]。另有研究證實(shí),電針能改善老年癡呆癥的腦能量代謝,其作用與電針上調(diào)海馬體的SIRT1表達(dá)聯(lián)系密切[22]。我們由此推測(cè),電針對(duì)全身多個(gè)器官的SIRT1都有作用,從而發(fā)揮電針整體調(diào)節(jié)的作用,這有待進(jìn)一步的研究來證實(shí)。

    綜上所述,“標(biāo)本配穴”電針具有改善大鼠糖尿病腎病的作用,可能與上調(diào)腎臟SIRT1蛋白的表達(dá)水平有關(guān)。

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    TheEffectsofElectro-acupunctureonDiabeticNephropathyandTheExpressionofRenalSIRT1ProteininZuckerDiabeticFattyRats

    HE Wen-juan1, CHEN Li1, SHU Qing1, ZHOU Huan-jiao1, WANG Ya-yuan1, GAO Yan1, CHEN Rui3, WU Song1, TANG Hong-tu1, LIANG Feng-xia1△

    (1.HubeiProvincialCollaborativeInnovationCenterofPreventiveTreatmentbyAcupunctureandMoxibustion/HubeiUniversityofChineseMedicine,Wuhan430061,China; 2.TheNinthHospitalofWuhan,Wuhan430082,China; 3.DepartmentofTraditionalChineseMedicine,UnionHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430022,China)

    Objective: To observe the effect of "the Combination of Biao-Ben Acupoints" electro-acupuncture(EA) on renal function,kidney ultramicrostructure, and the expression of renal SIRT1 protein of diabetic nephropathy rats model. Methods:12 male Zucker fa/fa rats, were randomly divided into model control group, none EA group,EA group and 4 in each group. 4 zucker lean (ZL) rats (fa/-),their lean normoglycemic littermates, were set for control group. none EA group and EA group was treated, after 3 weeks, all rats were sacrificed and the blood,kidney were extracted for detection. Results: After treatment, Compared with model control group, the EA group’s food-intake reduced,weight lossed, fasting and postprandial blood glucose lower, the level of CREA, UA,BUN dropped,kidney ultramicro- structure improved,the expression of renal SIRT1 protein up-regulated. Conclusion:"The Combination of Biao-Ben Acupoints" EA can improve renal function,kidney ultramicro -structure,up-regulate the expression of renal SIRT1 protein of diabetic nephropathy.

    Diabetic nephropathy; The Combination of Biao-Ben Acupoints; Electro-acupuncture; SIRT1; Zucker fa/fa Rats

    R245.9+7

    B

    1006-3250(2017)09-1280-04

    國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81473787)-針刺通過調(diào)控下丘腦SIRT1/ FoxO1 治療胰島素抵抗肥胖的機(jī)制研究

    何文娟(1988-),女,湖北谷城人,醫(yī)學(xué)碩士,從事針灸作用機(jī)理研究。

    梁鳳霞(1975-),女,教授,醫(yī)學(xué)博士,博士研究生導(dǎo)師,從事針灸作用機(jī)理研究,Tel:18971371818,E-mail:315938821@qq.com。

    2017-03-18

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