反相高效液相色譜測定飲料中新橙皮苷二氫查爾酮

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(1.四川省分析測試服務中心,四川成都 610023;2.四川賽納斯分析檢測有限公司,四川成都 610023;3.西華大學理學院,四川成都 610039;4.賽默飛世爾科技有限公司成都應用實驗室,四川成都 610023)

反相高效液相色譜測定飲料中新橙皮苷二氫查爾酮

張劍1,2,蔡函青2,楊捷2,蓋世英1,趙彥3,冉良冀4

(1.四川省分析測試服務中心,四川成都 610023;2.四川賽納斯分析檢測有限公司,四川成都 610023;3.西華大學理學院,四川成都 610039;4.賽默飛世爾科技有限公司成都應用實驗室,四川成都 610023)

建立了反相高效液相色譜檢測飲料中新橙皮苷二氫查爾酮的分析方法。分別對提取方法、沉淀劑的使用和色譜條件進行了優(yōu)化。采用核殼型的Accucore C18(2.6 μm,4.6 mm×100 mm)色譜柱為分析柱,以甲醇和水(45∶55,v/v)為流動相,等度洗脫,流速1.0 mL/min,柱溫25 ℃,紫外檢測波長283 nm,進樣量10 μL,外標法定量分析。結果表明新橙皮苷二氫查爾酮的分離在10 min以內,具有良好峰形,在0.5～50 mg/L濃度范圍內,有良好的線性關系,相關系數(shù)r>0.999,檢出限為0.15 mg/L,在10、40、80 mg/kg加標水平下平均回收率在90.2%～103.5%之間,相對標準偏差(RSD)在1.96%～7.59%之間(n=6)。結果表明該方法選擇性強、靈敏度高、操作簡便,可用于飲料中新橙皮苷二氫查爾酮的檢測。

新橙皮苷二氫查爾酮,高效液相色譜,飲料,甜味劑

新橙皮苷二氫查耳酮(Neohesperidin dihydrochalcone,NHDC)是一種二氫查耳酮糖苷化合物,有多種生理活性功能,甜度通常是蔗糖的1000～2000倍,甜味口感好,持續(xù)時間長,具有高甜度、低熱量、低毒、穩(wěn)定性好等特點,逐漸引起了廣泛的關注,在食品工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)和飼料工業(yè)等領域都有良好的應用[1-4]。新橙皮苷二氫查耳酮是美國學者Horowitz和Gentili在研究柑桔黃酮類物質時發(fā)現(xiàn)的[5-6],1994年歐盟批準新橙皮苷二氫查耳酮作為食品甜味劑使用,我國也于1997年將其列入《食品添加劑使用衛(wèi)生標準》中允許使用的食品香料品種名單[2-3]。食品添加劑是現(xiàn)代食品工業(yè)尤其是飲料工業(yè)發(fā)展中不可或缺的物質,然而近年來食品添加劑的超量、超范圍使用現(xiàn)象屢見不鮮。我國國家標準GB 2760-2014只對常見甜味劑的適用范圍和添加限量有明確的規(guī)定[7],監(jiān)管部門的日常監(jiān)督也往往局限于糖精鈉、安賽蜜和甜蜜素等老一代甜味劑。目前,對新型甜味劑如新橙皮苷二氫查耳酮的檢測方法研究較少,沒有相應的檢測標準。因此,有必要建立一種專屬性強、靈敏度高、定性定量準確的檢測方法。

食品中新橙皮苷二氫查耳酮的檢測方法已有毛細管區(qū)帶電泳法(CZE)、液相色譜法(HPLC)、液相色譜-串聯(lián)質譜法(HPLC-MS/MS)等[8-16]。HPLC-MS/MS方法雖然靈敏度高、選擇性強,但儀器昂貴,普及性不強。利用液相色譜檢測飲料中新橙皮苷二氫查耳酮的方法鮮見報到,因此,本文建立了采用反相液相色譜法測定飲料中新橙皮苷二氫查耳酮的方法。

圖1 新橙皮苷二氫查耳酮的結構式Fig.1 Structure of neohesperidin dihydrochalcone

1 材料與方法

1.1材料與儀器

新橙皮苷二氫查耳酮 純度>98%,美國Sigma-Aldrich公司；甲醇 色譜純,美國Fisher公司；其它試劑均為分析純,實驗用水為超純水,飲料樣品為超市購買。

Ultimate 3000超高效液相色譜儀 美國賽默飛公司;配雙三元梯度泵DGP-3600RS、自動進樣器WPS-3000TRS、柱溫箱TCC-3000RS、二極管陣列檢測器DAD-3000RS、變色龍色譜管理軟件Chromeleon 7.2 SR4;ME204E 電子天平 瑞士Mettler公司;Integral 3 Milli-Q超純水儀 德國Millipore公司;臺式高速離心機H/T16MM 湖南赫西;數(shù)控超聲波清洗器KQ-500DE 昆山市超聲儀器有限公司;微孔過濾膜0.45 μm 天津津騰。

1.2色譜條件

色譜柱:Accucore C18柱(2.6 μm,4.6 mm×100 mm);柱溫:25 ℃;進樣量:10 μL;檢測波長:283 nm;流動相:甲醇∶水=45∶55;流速:1.0 mL/min。

1.3標準溶液的配制

標準儲備溶液:稱取新橙皮苷二氫查爾酮約0.05 g(精確至0.0001 g)于小燒杯中,加入甲醇,超聲溶解后轉移至50 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,搖勻,配成質量濃度約1000 mg/L的標準儲備溶液,于4 ℃保存。

中間標準溶液:移取1000 mg/L的標準儲備溶液2.5 mL至50 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,搖勻,配成質量濃度約為50 mg/L的中間標準溶液,于4 ℃保存。

系列濃度標準溶液:移取中間標準溶液0.1、0.2、1.0、2.0、5.0、10.0 mL分別置于10 mL容量瓶中,用流動相稀釋至刻度,搖勻,得到質量濃度為0.5、1、5、10、25、50 mg/L的標準工作溶液,現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4樣品處理

蛋白飲料:準確稱取5.0 g樣品于25 mL比色管中,加入1.0 mol/L乙酸鋅溶液和0.25 mol/L亞鐵氰化鉀溶液(含3%冰乙酸)各1.0 mL,加入提取液,定容至刻度,混勻,5000 r/min離心10 min,取上清液,經微孔過濾膜過濾,濾液上機分析。

非蛋白飲料:準確稱取2.0 g樣品于25 mL比色管中,加入提取液,定容至刻度,混勻,經微孔過濾膜過濾,濾液上機分析。

固體飲料:準確稱取2.0 g樣品于25 mL比色管中,加入20 mL提取液,超聲提取10 min,定容至刻度,混勻,經微孔過濾膜過濾,濾液上機分析。

2 結果與分析

2.1樣品處理條件的優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的選擇 本實驗以不同體積份數(shù)的甲醇水溶液(0、45%、65%、85%、100%,v/v)作為提取液進行超聲提取,比較不同溶劑的提取能力。結果表明以水作為單一溶劑回收率小于80%,效果相對較差。而其余不同濃度的甲醇水溶液作為提取液的回收率均大于90%,能夠滿足實驗要求,但樣品溶劑中甲醇濃度過高易出現(xiàn)分叉峰。為了新橙皮苷二氫查耳酮具有良好峰形,同時又不影響回收率,實驗選用65%甲醇水溶液作為提取溶劑。

圖2 不同溶劑的提取效率Fig.2 Extracting efficiency of different extracting solvents

圖3 新橙皮苷二氫查耳酮的色譜圖Fig.3 Chromatogram of neohesperidin dihydrochalcone注:1.新橙皮苷二氫查耳酮；A.標準品；B.固體飲料加標；C.非蛋白飲料加標；D. 蛋白飲料加標。

2.1.2 沉淀劑的選擇 乳飲料中含有大量蛋白質及其他大分子顆粒物,不僅導致基線發(fā)生較大波動,同時也會影響色譜柱的分離效果和使用壽命,因此需要快速、高效的沉淀蛋白質。常用沉淀蛋白質的方法有:加酸、加濃鹽溶液、加重金屬鹽、加有機溶劑等,一般以后兩者方法應用最為廣泛[17-18]。本實驗比較了5 g乳飲料樣品中加入250 μg新橙皮苷二氫查耳酮,分別用5、10、15 mL不同體積的乙腈沉淀蛋白質,結果表明乙腈用量少,蛋白質沉淀不完全,15 mL乙腈能完全沉淀蛋白,但目標峰受雜質干擾較大。同時本實驗也參考了國家標準GB/T 23495-2009聯(lián)合使用亞鐵氰化鉀和乙酸鋅進行蛋白沉淀,也參考了其它文獻,兩者的濃度一般約為0.25 mol/L和1.0 mol/L[18-22]。本實驗比較了兩種沉淀劑的不同使用量(0.5、1、2 mL)對結果的影響,實驗表明亞鐵氰化鉀和乙酸鋅分別加入1 mL,沉淀效果明顯,回收率也最高。因此本實驗最終選擇亞鐵氰化鉀和乙酸鋅作為最終蛋白沉淀劑。

表1 NHDC的線性方程、相關系數(shù)、線性范圍、檢出限和定量限Table 1 Linear equations,correlation coefficients,linear ranges,limit of detection and limit of quantification of NHDC

2.2色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇 選取了不同型號的5種色譜柱Inertsil ODS-SP,CNW Athena C18-WP,Agilent ZORBAX SB-aq C18,Diamonsil C18和Accucore C18,按相同的色譜條件進行實驗。結果顯示,新橙皮苷二氫查耳酮在5種不同型號的C18色譜柱上均能得到良好的峰形,Accucore C18峰形更加尖銳,信噪比和靈敏度更高,因此確定Accucore C18為首選的色譜柱。

2.2.2 流動相的選擇 本實驗考察了甲醇和乙腈兩種有機相分別與水(45∶55,v/v)混合作為流動相對新橙皮苷二氫查耳酮出峰的影響,結果表明在兩種流動相下均得到了良好的峰形?？紤]到甲醇的毒性和成本都比乙腈要小,最終選擇甲醇作為有機相。同時也比較了以不同比例(30∶70、45∶55、60∶40,v/v)的甲醇-水作為流動相時,新橙皮苷二氫查耳酮的出峰情況,結合樣品中基質的干擾與分析效率,最終選擇甲醇-水(45∶55,v/v)作為流動相。

2.2.3 檢測波長的選擇 對新橙皮苷二氫查耳酮在210～400 nm波長范圍內進行掃描,光譜圖見圖4,發(fā)現(xiàn)NHDC在223 nm和283 nm附近有特征吸收。考慮到樣品基質可能帶來的干擾,同時為了使目標物得到較高的響應值,因此選擇283 nm作為最佳的檢測波長。

圖4 NHDC的光譜圖Fig.4 Spectrogram of neohesperidin dihydrochalcone

2.3線性范圍、檢出限和定量限

將1.3中不同質量濃度的標準溶液按設定的色譜條件進行測定,繪制標準工作曲線。結果表明,在1.0～100 mg/L的質量濃度范圍內,目標物的質量濃度X(mg/L)和峰面積Y之間有良好的線性關系,以信噪比(S/N)為3確定檢出限(LOD),以信噪比(S/N)為10確定定量限(LOQ),結果見表1。

2.4回收率和精密度

采用在空白樣品中添加標準溶液的方法,對蛋白飲料、非蛋白飲料和固體飲料進行添加回收率實驗,3個質量濃度添加水平分別為10、40、80 mg/kg,每個濃度水平進行6次重復實驗,計算平均回收率和精密度。結果表明新橙皮苷二氫查耳酮的平均回收率在90.2%～103.5%,相對標準偏差RSD為1.96%～7.59%(見表2),說明該方法的準確度與精密度可滿足實驗要求。

表2 不同飲料中NHDC的加標回收率實驗(n=6)Table 2 The spiked recovery tests ofNHDC in beverages(n=6)

注：ND:not detection。

2.5穩(wěn)定性

取同一樣品溶液,分別放置0、2、4、8、16、24 h后,在優(yōu)化的色譜條件下進行分析。新橙皮苷二氫查耳酮的峰面積RSD為1.52%,表明其提取液在24 h內穩(wěn)定性良好。

2.6樣品的測定

應用所建立的方法對蛋白飲料、非蛋白飲料、固體飲料等18批次的飲料進行檢測,其中有1批次樣品檢出有新橙皮苷二氫查耳酮,含量為46.5 mg/kg,其余均未檢出。

3 結論

本研究建立了飲料中新橙皮苷二氫查耳酮的高效液相色譜測定方法,該方法簡單快速,準確度高,精密度高。為飲料中新橙皮苷二氫查耳酮的日常分析和質量控制提供了一種穩(wěn)定、靈敏、選擇性好的分析方法,具有較好的實際應用前景。

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Determinationofneohesperidindihydrochalconeinbeveragesbyreversedphasehighperformanceliquidchromatography

ZHANGJian1,2,CAIHan-qing2,YANGJie2,GAIShi-ying1,ZHAOYan3,RANLiang-ji4

(1.Analytical and Metrical Center of Sichuan Province,Chengdu 610023,China;2.Sichuan Sainasi Analysis and Testing Service Co.,Ltd.,Chengdu 610023,China;3.College of Science,Xihua University,Chengdu 610039,China;4.Chengdu Application Lab of Thermo Fisher Scientific,Chengdu 610023,China)

A method of reversed phase high performance liquid chromatography was established for the determination of neohesperidin dihydrochalcone in beverages. The extraction method,precipitant and chromatography conditions were optimized. The separation was performed on an Accucore C18(2.6 μm,4.6 mm×100 mm)with methanol and water(45∶55,v/v)isocratic elution as the mobile phase at a flow rate of 1.0 mL/min and 25 ℃.The detection wavelength was at 283 nm and the sample injection volume was 10 μL. Neohesperidin dihydrochalcone was isolated with satisfactory resolution within 10 min. The concentration of neohesperidin dihydrochalcone in the range of 0.5～50 mg/L was linearly correlated to the peak area,with correlation coefficients higher than 0.999 and detection limit of 0.15 mg/L. The recoveries of neohesperidin dihydrochalcone at three spiked levels(10,40,80 mg/kg)were in the range of 90.2%～103.5% and the relative standard deviations(RSDs)were in the range of 1.96%～7.59%(n=6). The method is specific,sensitive,simple and sui
Table for the determination of neohesperidin dihydrochalcone in beverages.

neohesperidin dihydrochalcone;HPLC;beverage;sweeteners

TS207.3

A

1002-0306(2017)19-0256-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.19.047

2017-03-08

張劍(1984-)，男，碩士研究生，工程師,研究方向：食品分析，E-mail:1765113632@qq.com。

四川省科技服務業(yè)示范項目(2016GFW0182)。