黑果腺肋花楸原花青素的純化及表兒茶素和原花青素B2含量測定

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(北京林業(yè)大學生物科學與技術學院,食品加工與安全北京市重點實驗室,北京 100083)

黑果腺肋花楸原花青素的純化及表兒茶素和原花青素B2含量測定

朱月,張海平+,侯亞男,安建輝,封曉茹,溫馨亞,李騰,孫愛東*

(北京林業(yè)大學生物科學與技術學院,食品加工與安全北京市重點實驗室,北京 100083)

本文研究AB-8型大孔樹脂對黑果腺肋花楸原花青素粗提物的吸附和解吸特性,并利用高效液相色譜法測定原花青素純化物中表兒茶素和原花青素B2含量。結果表明，上樣溶液濃度4 mg/mL,吸附流速2 BV/h,解吸液乙醇濃度為50%,得到純化物中原花青素含量為14.29%;高效液相色譜法采用Aglient Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),以甲醇(A)-水(B)為流動相梯度洗脫(0～10 min,10% A-30% A;10～20 min,30% A-70% A;20～30 min,70% A-100% A),流速1 mL/min,檢測波長280 nm，表兒茶素和原花青素B2質(zhì)量濃度在0.025～0.2 mg/mL內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關系,兩種成分的加樣回收率分別為105.5%和99.8%;經(jīng)測定黑果腺肋花楸純化物中表兒茶素和原花青素B2含量分別為14.26 mg/g和22.45 mg/g。

黑果腺肋花楸,AB-8大孔樹脂,原花青素,高效液相色譜(HPLC),表兒茶素,原花青素B2

黑果腺肋花楸(Aorniamealnocarpa Elliot)為薔薇科(Roseeeae)腺肋花楸屬多年生落葉灌木,原產(chǎn)于美國東北部,我國對黑果腺肋花楸的相關研究起步較晚。自20世紀90年代初,遼寧省干旱地區(qū)造林研究所最先開始了我國腺肋花楸引種栽培和果實加工利用的實驗研究工作[1]。黑果腺肋花楸富含豐富的多酚類物質(zhì),研究表明,黑果腺肋花楸的多酚含量和抗氧化活性顯著高于藍莓、蔓越莓和越橘等漿果[2]。其中原花青素含量占總酚的41.9%～59.1%[3]。可見黑果腺肋花楸酚類物質(zhì)中原花青素含量最高,對黑果腺肋花楸的生物活性起著至關重要的作用。原花青素又稱縮合單寧,按聚合度的不同可分為單倍體、低聚體和多聚體[4]。單倍體是原花青素基本的結構單元,一般指兒茶素和表兒茶素,也有其它單倍體如表沒食子兒茶素和表阿夫兒茶精等;低聚體由2～4個單倍體縮合而成;多聚體則是由5個以上單倍體縮合而成。原花青素低聚體的生物活性研究最為活躍,其中二聚體分布最廣,研究最多,是最重要的一類原花青素[5]。

AB-8大孔樹脂具有吸附量大、解吸率高、性質(zhì)穩(wěn)定等特點,被廣泛應用于原花青素的分離純化[6]。本文對黑果腺肋花楸原花青素在AB-8大孔樹脂上的吸附和解吸條件進行探討,并選擇高效液相色譜法(HPLC)測定純化后的黑果腺肋花楸原花青素中單倍體表兒茶素和二聚體原花青素B2含量,為黑果腺肋花楸原花青素的深度開發(fā)和綜合利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

黑果腺肋花楸果實，放置于-80 ℃低溫冰箱冷凍備用 黑龍江;AB-8大孔樹脂 上海阿拉丁生化科技有限公司;無水甲醇、無水乙醇、鹽酸 分析純，國藥集團化學試劑有限公司;香草醛 上海阿拉丁生化科技有限公司;表兒茶素(HPLC>98%)、原花青素B2標品(HPLC>98%) 上海源葉生物科技有限公司;無水甲醇、乙腈 色譜純,西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司。

JYL-C010打漿機 九陽股份有限公司;UV-6100紫外分光光度儀 上海元析儀器有限公司;KQ-100DE超聲破碎儀 數(shù)控超聲波清洗器;L3660D低速離心機 上海知信實驗儀器有限公司;FD-18冷凍干燥機 北京德天佑科技發(fā)展有限公司;LQ-A 30002電子天平 瑞安市樂祺貿(mào)易有限公司;HL-2S恒流泵 上海青浦滬西儀器廠;色譜柱Agilent Eclipse XDB-C18,4.6×250 mm Agilent Technologies,Inc.;LC-20AD高分離度快速液相色譜系統(tǒng) SHIMADZU公司。

1.2實驗方法

1.2.1 黑果腺肋花楸原花青素粗提物制備 取40 g黑果腺肋花楸勻漿(預處理的花楸鮮果于打漿機中打漿3 min),在液料比25∶1、提取時間60 min、提取溫度70 ℃、60%乙醇濃度條件下提取原花青素;將提取得到的原花青素粗提物真空濃縮,冷凍干燥得紫黑色膏狀物質(zhì),放置于-20 ℃冰箱中,待用[7]。

1.2.2 AB-8 大孔樹脂預處理 AB-8大孔樹脂用無水乙醇浸泡24 h,充分溶脹后,去離子水洗至無醇;加入5% HCl溶液浸泡12 h后,去離子水洗至中性;加入5% NaOH溶液浸泡12 h后,去離子水洗至中性;抽濾吸干樹脂表面水分,待用[8]。

1.2.3 AB-8大孔樹脂對黑果腺肋花楸原花青素的靜態(tài)吸附解吸實驗

1.2.3.1 AB-8大孔樹脂靜態(tài)吸附與解吸實驗 稱取0.3 g干樹脂,加入20 mL約為5.24 mg/mL的原花青素粗提液,置搖床上30 ℃、120 r/min振蕩24 h,充分吸附后過濾,用鹽酸-香草醛法[9]測濾液中原花青素含量;然后將吸至飽和的樹脂用50 mL、95%的乙醇洗脫,測定洗脫液中原花青素含量,計算吸附量和解吸率[10]。

1.2.3.2 AB-8大孔樹脂靜態(tài)吸附動力學研究 步驟同1.2.3.1,但需在30 ℃搖床中以120 r/min振蕩;每30 min測定一次原花青素提取液濃度的變化。

1.2.3.3 AB-8大孔樹脂吸附等溫線測定 準確稱取預處理的大孔樹脂5份,每份0.5 g,置于50 mL三角瓶中,加入不同質(zhì)量濃度的原花青素溶液,置于振蕩器上30 ℃、120 r/min振蕩12 h,待吸附平衡后測定溶液的質(zhì)量濃度,并計算吸附量,以吸附量對平衡時質(zhì)量濃度作圖,繪制吸附等溫曲線[11]。

1.2.4 AB-8大孔樹脂對黑果腺肋花楸原花青素的動態(tài)吸附解吸實驗

1.2.4.1 上樣流速對AB-8大孔樹脂吸附效果的影響 取一定量的樹脂濕法裝柱,配制4 mg/mL的原花青素粗提物溶液,分別采用2、4、6 BV/h的流速流經(jīng)AB-8樹脂柱,2 mL/管收集餾分并測定原花青素濃度,當流出液中原花青素濃度達到上樣量的1/10時,AB-8大孔樹脂達到吸附通量,停止上樣,繪制穿透曲線,以泄漏點最遲出現(xiàn)的吸附流速為宜。

1.2.4.2 上樣濃度對AB-8大孔樹脂吸附效果的影響 取一定量的樹脂濕法裝柱,分別配制2、3、4 mg/mL的原花青素粗提物溶液,以2 BV/h的流速流經(jīng)AB-8樹脂柱,2 mL/管收集餾分并測定原花青素濃度,當流出液中原花青素濃度達到上樣量的1/10時,AB-8大孔樹脂達到吸附通量,停止上樣,繪制穿透曲線,以泄露點最遲出現(xiàn)的上樣濃度為宜。

1.2.4.3 乙醇濃度對AB-8大孔樹脂解吸效果的影響 取一定量的樹脂濕法裝柱,配制4 mg/mL的原花青素粗提物溶液,以2 BV/h的流速流經(jīng)AB-8樹脂柱,達到吸附通量后,以30%,50%,70%的乙醇溶液分別進行洗脫,2 mL/管收集餾分,以流出液體積為橫坐標,原花青素濃度為縱坐標繪圖,選擇合適的乙醇洗脫濃度。

1.2.5 HPLC測定兒茶素、表兒茶素和原花青素B2含量

1.2.5.1 HPLC分析條件 色譜儀為SHIMADZU的LC-20AT,檢測器為PDA檢測器。Aglient Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相A:色譜級甲醇,流動相B:去離子水;采用梯度洗脫方式,程序如下:0～10 min,10%～30% A;10～20 min,30%～70% A;20～30 min,70%～100% A。進樣量:20 μL;檢測波長:280 nm;柱溫:30 ℃;流速:1 mL/min;時間:30 min。

1.2.5.2 溶液配制 標準品溶液:準確稱取表兒茶素和原花青素B2各5 mg,用25 mL甲醇溶液溶解,配制成0.2 mg/mL的標準溶液。再精密移取1、2、4、6、8 mL標準溶液用甲醇定容至8 mL,分別配制為0.025、0.05、0.1、0.15、0.2 mg/mL表兒茶素和原花青素B2標準溶液。再取適量的兩種標準溶液混合,得到混合標準品溶液。用0.45 μm微孔濾膜將所有標準品溶液過濾,進樣分析;以濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標繪圖,得到線性回歸方程,結果見圖9。

供試品溶液:稱取0.05 g經(jīng)AB-8大孔樹脂純化的原花青素樣品,溶于20%甲醇中,用0.45 μm微孔濾膜過濾,待用。

2 結果與分析

2.1AB-8大孔樹脂靜態(tài)吸附與解吸結果

2.1.1 AB-8大孔樹脂的靜態(tài)吸附量和解吸率 由于原花青素為極性化合物,且其分子結構中帶有酚羥基,形成氫鍵的能力較強,因此很容易被極性樹脂和弱極性樹脂所吸附。弱極性AB-8大孔吸附樹脂,粒徑0.3～1.25 mm,比表面積480～520 m2/g,平均孔徑13.0～14.0 nm,外觀乳白色小球,孔容0.73～0.77 mL/g,對原花青素具有較好的吸附和解吸效果[12]。經(jīng)計算,AB-8大孔樹脂對黑果腺肋花楸原花青素的吸附量為225.8 mg/g,解吸率為91.597%。

2.1.2 AB-8大孔樹脂靜態(tài)吸附動力學特性 由圖1可知,AB-8大孔樹脂起始吸附量較大,此后吸附量增加較慢,在8 h 后基本可以達到平衡,平衡吸附量較大。

圖1 AB-8大孔樹脂靜態(tài)吸附動力學曲線Fig.1 Statie absorptiondynamicscurves of AB-8 macroporousresin

2.1.3 AB-8大孔樹脂吸附等溫線 目前,普遍將大孔吸附樹脂的吸附作用機制歸結為Langmuir或Freundich模式。Langmuir 等溫方程為單層分子吸附理論,其方程式如下:

式中，qm:飽和吸附量(mg/g);KL:Langmuir等溫方程參數(shù);qe:吸附量(mg/g);Ce:平衡濃度(mg/L)。

圖2 AB-8大孔樹脂吸附等溫線Fig.2 Adsorptionisothcrrn of AB-8 macroporous resins

以1/Ce為橫坐標,1/qe為縱坐標進行Langmuir 等溫方程擬合曲線,截距為1/qm,斜率為1/(qmKL),根據(jù)實驗數(shù)據(jù),即可求得qm、KL,并計算出相應的R2[13]。

由qm=378.8;R2=0.99152;據(jù)此可以認為,在所研究的濃度范圍內(nèi),AB-8大孔樹脂對原花青素的吸附為單層吸附[14-15];理論上AB-8大孔樹脂的飽和吸附量比實際實驗中求得的飽和吸附量數(shù)值更高;另外由吸附等溫線可以看出樹脂的吸附量隨原花青素濃度的增高而升高,所以適量增加原花青素濃度可以提高AB-8大孔樹脂的吸附量。

圖3 Langmuir等溫方程擬合曲線Fig.3 Fitting curve of Langmuir isotherm formula

2.2AB-8大孔樹脂動態(tài)吸附與解吸結果

2.2.1 吸附流速對AB-8大孔樹脂吸附效果的影響 由圖4可知,AB-8大孔樹脂的吸附通量隨吸附流速的增高而降低。上樣流速為2、4、6 BV/h時樹脂的吸附通量分別為180、120、100 mL。結果表明隨著吸附流速的降低,樹脂的吸附通量增大,泄漏點出現(xiàn)時間延長,能夠吸附更多的原花青素,所以選擇2 BV/h的吸附流速為宜。

圖4 上樣流速對AB-8大孔樹脂吸附效果的影響Fig.4 Effect of flow rate on adsorption ofAB-8 macroporous resins

2.2.2 上樣濃度對AB-8大孔樹脂吸附效果的影響 由圖5可知,在不同的上樣濃度下,AB-8大孔樹脂達到吸附通量時進樣量相似,均在90管(180 mL)左右達到吸附通量,但上樣濃度為4 mg/mL時樹脂的吸附量最大。所以為了充分利用AB-8大孔樹脂,選擇4 mg/mL為最佳上樣濃度。

圖5 上樣濃度對AB-8大孔樹脂吸附效果的影響Fig.5 Effect of concentration on adsorption ofAB-8 macroporous resins

2.2.3 乙醇濃度對AB-8大孔樹脂解吸效果的影響 由圖6可知,隨著乙醇濃度的增加,AB-8大孔樹脂的解吸速率逐漸加快。80 mL 30%的乙醇溶液可以將原花青素完全洗脫,但是存在拖尾現(xiàn)象;60 mL左右的50%乙醇溶液和70%乙醇溶液可以將原花青素完全洗脫,洗脫效果相似,洗脫峰集中。但是一些非黃烷三醇類雜質(zhì)也可能被70%的乙醇洗脫,所以為了得到較高純度的原花青素,選擇50%乙醇溶液作為洗脫溶劑。

圖6 乙醇濃度對AB-8大孔樹脂解吸效果的影響Fig.6 Effect of ethanol concentrationon the desorption of AB-8 macroporous resins

通過上述實驗結果可知,上樣溶液濃度4 mg/mL,吸附流速2 BV/h,解吸液乙醇濃度50%時,AB-8大孔樹脂對黑果腺肋花楸原花青素的動態(tài)吸附和解吸能力最佳。經(jīng)AB-8大孔樹脂純化,得到黑果腺肋花楸原花青素含量為14.29%。

2.3HPLC分析

2.3.1 線性關系考察 分別精密吸取各標準溶液,進樣并測定峰面積值。以標準液濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標,繪制標準曲線,結果如圖7所示。表兒茶素、原花青素B2的線性回歸方程分別為:y=2×107x-173065,R2=0.9974;y=1×107x-101750,R2=0.9985。

圖7 表兒茶素和原花青素B2標準曲線Fig.7 Standard curve of epicatechin and procyanidins B2

2.3.2 精密度實驗 取混合標準品溶液連續(xù)進樣五次,測定表兒茶素和原花青素B2的峰面積,求出峰面積平均值,并得出RSD值,結果見表1。表兒茶素、原花青素B2的峰面積RSD值分別是1.08%和2.07%,表明儀器精密度較好。

2.3.3 穩(wěn)定性實驗 取原花青素純化物0.05 g,按照1.2.5.2方法制備供試品溶液,分別于0、3、6、9、12 h重復進樣6次,測定表兒茶素和原花青素B2的峰面積及RSD值,測定結果見表2。表兒茶素、原花青素B2的峰面積均值分別是1107328.2和580784.6,峰面積RSD值分別是0.37%和1.16%,表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表1 精密度實驗Table 1 Precision experiment

表2 穩(wěn)定性實驗Table 2 Stability experiment

2.3.4 加樣回收率實驗 取已知表兒茶素和原花青素B2含量的原花青素純化物5份,分別加入一定量的表兒茶素和原花青素B2標準品,按1.2.5.2制備供試品溶液,按前述方法測定表兒茶素和原花青素B2的含量,并計算回收率,結果如表3[16-17]。

表3 加樣回收實驗Table 3 Sample recoveries rate experiment

2.3.5 樣品含量測定 按照1.2.5.2 準確配制供試品溶液,在1.5.2.1色譜條件下進行分析,連續(xù)進樣三次,按外標法進行計算,測得黑果腺肋花楸純化物中表兒茶素和原花青素B2含量分別為14.26 mg/g和22.45 mg/g。

圖8 混合對照品(A)與供試品溶液(B)Fig.8 HPLC chromatograms of mixed referencesubstances(A)and procyanidinssample(B)注：1. 原花青素B2(Procyanidins B2);2. 表兒茶素(Epicatechin)。

3 結論

本文首次應用AB-8大孔樹脂純化黑果腺肋花楸原花青素,并通過高效液相色譜法測定原花青素純化物中表兒茶素和原花青素B2含量,為黑果腺肋花楸原花青素的深度開發(fā)和綜合利用提供科學依據(jù)。但從原花青素純化物的高效液相色譜圖可以看出,純化物中物質(zhì)種類仍然較多,除了包含原花青素低聚體和多聚體,還可能含有花青素、酚酸等多酚類物質(zhì),有待進一步的研究鑒定[18-19]。

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PurificationofblackchokeberryprocyanidinsanddeterminationofepicatechinandprocyanidinsB2byHPLC

ZHUYue,ZHANGHai-ping+,HOUYa-nan,ANJian-hui,FENGXiao-ru,WENXin-ya,LITeng,SUNAi-dong*

(Key Loboratory of Forestry Food Processing Security,College ofBiological Sciences and Biotechnology,Beijing Forestry University,Beijing 100083,China)

The adsorption and desorption properties of procyanidins from black chokeberry with AB-8 macroporous resins was studied. And the HPLC method was used to determine the content of epicatechin and procyanidins B2in procyanidins purification. The results showed that,procyanidins concentration of the sample solution was 4.0 mg/mL,adsorption flow rate was 2 BV/h,the desorption concentration of ethanol was 50%. Under the proposed conditions,the purity of procyanidins content from black chokeberry was 14.29%. Chromatographic separation was performed on the Aglient Eclipse XDB-C18,4.6 mm×250 mm.The mobile phase was methanol(A)-water(B)with the gradient elution(0～10 min,10% A-30% A;10～20 min,30% A-70% A;20～30 min,70% A-100% A). The flow rate was 1.0 mL/min and the detective wavelength was set at 280 nm.The linear ranges of epicatechin and procyanidins B2concentration were 0.025～0.2 mg/mL. The sample recoveries rate of the two components were 105.5% and 99.8% respectively. The content of epicatechin and procyanidins B2in black chokeberry procyanidins purification were 14.26 mg/g and 22.45 mg/g,respectively.

black chokeberry;AB-8 macroporous resins;procyanidins;high performance liquid chromatography;epicatechin;procyanidins B2

TS207.3

A

1002-0306(2017)19-0240-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.19.044

2017-04-14 +并列第一作者

朱月(1993-),女,在讀碩士研究生,研究方向:天然產(chǎn)物與功能性食品,E-mail:zhuyue1109@ 163.com。

張海平(1992-),男，在讀碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物與功能性食品，E-mail:624571440@qq.com。

*

孫愛東(1968-),女,博士，教授,研究方向:天然產(chǎn)物生理活性物質(zhì)的開發(fā)與利用,E-mail:adsun68@ 163.com。

國家自然科學基金(31471593);國家重點研發(fā)計劃(2016YFD0400302-4)。