響應(yīng)面法優(yōu)化石榴葉總酚的亞臨界水提取工藝

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(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所,國(guó)家林業(yè)局林產(chǎn)化學(xué)工程重點(diǎn)開放性實(shí)驗(yàn)室,江蘇南京 210042)

響應(yīng)面法優(yōu)化石榴葉總酚的亞臨界水提取工藝

閆林林,鄭光耀*,韋朝寬

(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所,國(guó)家林業(yè)局林產(chǎn)化學(xué)工程重點(diǎn)開放性實(shí)驗(yàn)室,江蘇南京 210042)

本研究采用亞臨界水萃取法提取石榴葉總酚,并通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化其提取工藝參數(shù)。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,根據(jù)響應(yīng)面Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,采用三因素三水平的分析法,選取提取溫度、提取時(shí)間、液料比為自變量,考察其對(duì)石榴葉提取物中總酚含量的影響,并通過(guò)方差分析優(yōu)化其工藝。結(jié)果表明,回歸方程對(duì)實(shí)驗(yàn)擬合較好,可以對(duì)石榴葉中總酚含量進(jìn)行很好的分析和預(yù)測(cè);優(yōu)化后的最佳工藝條件為:提取溫度134 ℃、提取時(shí)間31 min、液料比52∶1 mL/g。在該條件下,石榴葉總酚含量為169.24 mg GAE/g,與預(yù)測(cè)值173.31 mg GAE/g基本一致。通過(guò)與溶劑加熱回流法相比較,亞臨界水提取可明顯提高石榴葉總酚的含量,并縮短提取時(shí)間。

石榴葉,總酚,亞臨界水提取,響應(yīng)面法

石榴葉為石榴科(Punicaceae)石榴屬(Punica)植物石榴(PunicagranatumL.)的葉,據(jù)《圖經(jīng)本草》記載“榴葉者,去咽喉燥渴,止下痢漏精,消食祛火之功效”[1]。研究表明,石榴葉含有豐富的多酚及黃酮類活性物質(zhì),如鞣花酸、沒(méi)食子酸、短葉蘇木酚、熊果酸等,具有抗氧化、抗腫瘤、收斂止血等功效[2-5],是潛在的天然抗氧化劑的來(lái)源。目前,石榴葉已被開發(fā)為石榴茶,具有健脾、防暑、爽心明目、抗氧化等保健作用[6]。然而,絕大部分石榴葉資源還是被作為廢棄物丟棄,造成了資源的浪費(fèi)。因此,對(duì)石榴葉中酚類物質(zhì)的研究對(duì)于石榴資源的充分開發(fā)和利用具有重要意義。

目前,對(duì)石榴葉中酚類物質(zhì)的提取,一般多采用有機(jī)溶劑或熱水浸泡提取、加熱回流提取、超聲提取等技術(shù),存在著耗時(shí)長(zhǎng)、提取率低、提取溶劑污染環(huán)境等問(wèn)題[1,7-9]。亞臨界水提取技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新興的提取技術(shù),具有提取時(shí)間短、高效率、綠色環(huán)保等優(yōu)勢(shì),已被廣泛應(yīng)用于多種植物材料中酚類物質(zhì)的提取[10-11]。有研究表明亞臨界水萃取可以提高石榴籽中多酚的提取率[12],但是針對(duì)亞臨界水提取石榴葉總酚及其工藝優(yōu)化的研究尚缺乏。因此,本研究首次采用亞臨界水提取法,以石榴葉提取物中總酚含量為指標(biāo),選取提取溫度、提取時(shí)間、液料比為自變量,結(jié)合響應(yīng)面Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,優(yōu)化石榴葉總酚的提取工藝,旨在為石榴葉中多酚的開發(fā)和利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

石榴葉 采集于2016年10月,于南京市玄武區(qū)鎖金北路，將采集的石榴葉用清水洗凈后放置于烘箱40 ℃下干燥后,用中藥粉碎機(jī)粉碎,過(guò)60目篩后,將石榴葉粉末置于-20 ℃冰箱備用；福林酚試劑(Folin-Ciocalteu reagent) 美國(guó)Sigma公司;沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度>90%)、鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98%) 南京春秋生物工程有限公司;乙腈和甲酸 色譜級(jí),默克公司;碳酸鈉、無(wú)水甲醇等 均為分析級(jí),國(guó)藥集團(tuán)。

LC-20AT HPLC-PAD液相色譜工作站 配有自動(dòng)進(jìn)樣器(SIL-20A)、PDA檢測(cè)器(SPD-20A)、柱溫箱(CTO-10AS) 日本島津;UV-2102 PC型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 尤尼克(上海)儀器有限公司;TGL-16C型高速臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;亞臨界水萃取裝置(自制),如圖1所示。

圖1 亞臨界水萃取裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of the subcritical water system注：1:加熱裝置;2:物料籃;3:氮?dú)馄?4:萃取釜;5:冷卻器;6:收集器;P:壓力表;T:溫度指示器;M:電機(jī);A、B:調(diào)節(jié)閥。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 亞臨界水提取單因素實(shí)驗(yàn) 精確稱取一定量的石榴葉粉末,置于亞臨界萃取裝置的萃取罐中,在不同提取溫度(100～200 ℃)、提取時(shí)間(10～100 min)和液料比(20∶1～60∶1 mL/g)的條件下提取,重復(fù)提取兩次后合并提取液,將所得到的提取液以4000 r/min的速度離心10 min后,取上清液定容至一定體積,備用。具體為:考察一系列提取溫度(100～200 ℃)對(duì)石榴葉提取物中總酚含量及其抗氧化活性的影響,在固定提取時(shí)間為20 min,液料比為50∶1 mL/g的前提下,對(duì)石榴葉總酚進(jìn)行亞臨界水提取;考察一系列提取時(shí)間(10～100 min)對(duì)石榴葉提取物中總酚含量的影響,在固定提取溫度為130 ℃,液料比為50∶1 mL/g條件下,對(duì)石榴葉總酚進(jìn)行亞臨界水提取;考察一系列液料比(20∶1～60∶1 mL/g)對(duì)石榴葉提取物中總酚含量的影響,在固定提取溫度為130 ℃,提取時(shí)間為30 min的條件下,對(duì)石榴葉總酚進(jìn)行亞臨界水提取。

1.2.2 加熱回流提取 參照文獻(xiàn)[1]中的方法,稱取一定量的石榴葉粉末,置于圓底燒瓶中,分別按照液料比50∶1 mL/g加入純水和75%乙醇水溶液,在80 ℃的水浴中回流提取2 h,將得到的提取液以4000 r/min的速度離心10 min后取上清液,殘?jiān)侔瓷鲜鰲l件重復(fù)提取一次,分別合并兩次的提取液,定容至一定體積,備用。

1.2.3 福林酚法測(cè)定石榴葉提取物中總酚含量 采用福林酚比色法測(cè)定石榴葉提取物中總酚的含量[8]。首先制作標(biāo)準(zhǔn)曲線:精確稱取沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品0.0050 g,用蒸餾水溶解并定容于50 mL容量瓶中,配制成濃度為0.1 mg/mL的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)液。將標(biāo)準(zhǔn)液稀釋至一系列濃度后,精確量取一定體積,分別加入5 mL棕色容量瓶中,向其中各加3 mL蒸餾水,振蕩搖勻,再加入0.25 mL 福林酚試劑,充分搖勻。靜置1 min后,加入20% 碳酸鈉溶液0.75 mL,混勻后定容至5 mL,避光靜置90 min,于760 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。石榴葉中總酚含量的測(cè)定按上述方法進(jìn)行,將樣品測(cè)得的吸光值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算得出的石榴葉總酚含量用mg GAE(gallic acid equivalent)/g表示。

1.2.4 HPLC法測(cè)定石榴葉提取物中鞣花酸含量 石榴葉中含有豐富的酚類物質(zhì),其中包括大量鞣花酸[8],本研究中采用高效液相色譜(HPLC)法對(duì)石榴葉提取物中鞣花酸的含量進(jìn)行測(cè)定和比較,具體色譜條件和方法參考相關(guān)文獻(xiàn)并作改進(jìn)[8]。色譜柱:Diamonsil RP-C18色譜柱(250 mm,4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相:0.2%甲酸水(A):乙腈(B)=80%:20%;等濃度洗脫;流速為1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm;柱溫為30 ℃;運(yùn)行時(shí)間為20 min。

鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:精密稱取一定量的鞣花酸標(biāo)品10.0 mg,配制成濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)母液,依次用甲醇稀釋成一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品工作液,分別進(jìn)HPLC分析。

1.2.5 石榴葉提取物的抗氧化活性評(píng)價(jià) 石榴葉提取物的抗氧化活性評(píng)價(jià)參照文獻(xiàn)中的DPPH自由基和ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn)進(jìn)行[8],具體如下。

DPPH自由基清除力測(cè)定:分別取0.1 mL待測(cè)樣品溶液加入5 mL離心管中,再分別向各管中依次加入0.25 mL新鮮配制的DPPH·甲醇溶液(濃度為1 mmol/L)和2 mL甲醇。將上述反應(yīng)液混勻后,于室溫下避光放置20 min,以純甲醇作空白對(duì)照,于517 nm測(cè)定吸光值。DPPH自由基清除率(%)按以下公式計(jì)算,即RSA(%)=100×(A0-As)/A0,其中,A0表示0.25 mL DPPH·溶液加入2.1 mL甲醇在517 nm處的吸光值;As表示0.25 mL DPPH·溶液加入0.1 mL樣品溶液和2 mL甲醇在517 nm處的吸光值。

ABTS自由基清除力測(cè)定:分別取0.15 mL待測(cè)樣品溶液加入5 mL玻璃試管中,再分別向各試管中加入2.85 mL用甲醇新鮮配制的ABTS+·工作液,將上述反應(yīng)液混勻后,室溫下避光放置10 min,最后于734 nm處測(cè)定吸光值。ABTS+·自由基清除率按照公式計(jì)算,即RSA(%)=100×(A0-As)/A0,其中,A0表示0.15 mL甲醇加入2.85 mL ABTS+·工作液在734 nm處的吸光值;As表示0.15 mL 樣品溶液加入2.85 mL ABTS+·工作液在734 nm處的吸光值。

為了對(duì)石榴葉提取物的抗氧化活性進(jìn)行統(tǒng)一比較,首先通過(guò)測(cè)定一系列濃度的抗壞血酸(Ascorbic acid)對(duì)DPPH和ABTS自由基的清除率,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到其線性回歸方程(DPPH:y=462.41x+2.6803,R2=0.9996;ABTS:y=1337.4x-3.1569,R2=0.9998);再將測(cè)得的石榴葉提取物的自由基清除率(%)代入標(biāo)準(zhǔn)曲線,從而得出石榴葉總酚提取物清除DPPH和ABTS自由基能力的抗壞血酸當(dāng)量(mg Ascorbic acid/g干物質(zhì)樣品)。

1.2.6 響應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選取提取溫度、提取時(shí)間、液料比這三個(gè)因素,以總酚含量為指標(biāo),按照Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,設(shè)計(jì)3因素3水平實(shí)驗(yàn)(見(jiàn)表1),根據(jù)回歸模型分析確定各因素的影響,以總酚含量為響應(yīng)值(Y)作等值線圖與響應(yīng)曲面圖,分析優(yōu)化最佳提取條件,從而對(duì)石榴葉總酚的提取方法進(jìn)行工藝優(yōu)化。

表1 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)因素與水平表Table 1 Factors and levels Table of response surface analysis

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析,并進(jìn)行方差分析和多重比較,每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件下,均進(jìn)行3次平行操作,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示。響應(yīng)面分析采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行,并進(jìn)行模型優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1石榴葉提取物中總酚含量、鞣花酸含量標(biāo)曲的繪制

以沒(méi)食子酸濃度為橫坐標(biāo)(x),吸光值(OD)為縱坐標(biāo)(y),建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到福林酚法測(cè)定石榴葉提取物中總酚含量的線性回歸方程:y=104.42x+0.0283,R2=0.9991,沒(méi)食子酸在濃度范圍0.005～0.030 mg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好。

以鞣花酸濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)(x),以峰面積(mV)為縱坐標(biāo)(y)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到HPLC法測(cè)定石榴葉提取物中鞣花酸含量的回歸方程:y=240390x-4612.9,R2=0.9994,鞣花酸在濃度范圍為0.01～2.00 μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好。圖2是鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)品及石榴葉提取物的高效液相色譜圖。

圖2 鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)品及石榴葉提取物的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of ellagic acidand pomegranate leaves extracts注:A:鞣花酸標(biāo)品;B:石榴葉提取物。

2.2單因素實(shí)驗(yàn)

據(jù)文獻(xiàn)[13]報(bào)道,提取壓力在亞臨界水提取過(guò)程中對(duì)提取效率的影響不大,因此本實(shí)驗(yàn)中暫未考慮壓力變化對(duì)石榴葉總酚提取效果的影響,固定提取壓力為3.0 MPa,研究提取溫度、提取時(shí)間和液料比這3個(gè)因素對(duì)石榴葉中總酚含量及其抗氧化活性的影響。

2.2.1 提取溫度的影響 由圖3A可知,隨著提取溫度的升高,總酚含量逐漸升高,在100～130 ℃升高趨勢(shì)較為明顯,但超過(guò)130 ℃后再繼續(xù)升高溫度,總酚含量有明顯下降的趨勢(shì)。在亞臨界水提取過(guò)程中,提取溫度起著重要的作用,溫度的升高可以提高亞臨界水對(duì)提取材料中酚類物質(zhì)的溶解性,可以加速分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng),達(dá)到類似于有機(jī)溶劑的效果;但是過(guò)高的提取溫度也會(huì)造成其中某些熱不穩(wěn)定酚類物質(zhì)的降解,從而導(dǎo)致總酚含量降低[14-15]。通過(guò)對(duì)石榴葉提取物中鞣花酸含量的測(cè)定發(fā)現(xiàn),隨著溫度的升高(100～200 ℃),鞣花酸含量不斷增加。這可能是因?yàn)槭袢~中含有的大量鞣花單寧,在高溫條件下不穩(wěn)定,易降解形成小分子物質(zhì)如鞣花酸等[16-17],而鞣花酸在較高溫度下相對(duì)穩(wěn)定。但由于本實(shí)驗(yàn)中最高提取溫度為200 ℃,溫度超過(guò)200 ℃之后鞣花酸的變化趨勢(shì)還有待進(jìn)一步探究。為了篩選出最佳提取溫度,并得到具有潛在抗氧化活性的石榴葉提取物,本研究通過(guò)DPPH自由基和ABTS自由基清除力實(shí)驗(yàn)比較了不同溫度下石榴葉提取物的抗氧化活性(見(jiàn)圖3B)發(fā)現(xiàn),隨提取溫度的變化,抗氧化活性的強(qiáng)弱趨勢(shì)與總酚含量的變化趨勢(shì)有一定的相似性,而與鞣花酸含量的相關(guān)性不大,這與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相似[16]。因此,本實(shí)驗(yàn)選取130 ℃作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中的亞臨界水提取石榴葉總酚的提取溫度。

圖3 提取溫度對(duì)石榴葉總酚、鞣花酸含量(A)及其抗氧化活性(B)的影響Fig.3 Effects of extraction temperatureon the contents of total phenolic and ellagic acid(A),and antioxidant activities(B)of pomegranate leaves

2.2.2 提取時(shí)間的影響 由圖4A可知,在10～30 min內(nèi),石榴葉總酚含量會(huì)隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而增加;但是超過(guò)30 min后,再繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間,總酚含量有明顯降低的趨勢(shì)。據(jù)文獻(xiàn)[14-15]報(bào)道,亞臨界水萃取植物中活性成分的過(guò)程是分子擴(kuò)散達(dá)到固液平衡的過(guò)程,在一定提取時(shí)間內(nèi)隨時(shí)間的延長(zhǎng)所溶解的活性物質(zhì)不斷增加;但是在萃取過(guò)程達(dá)到平衡后,隨著時(shí)間的延長(zhǎng)萃取物質(zhì)的得率不會(huì)再增加,相反其中某些不穩(wěn)定的物質(zhì)還會(huì)發(fā)生降解,從而造成其含量的降低。通過(guò)對(duì)石榴葉提取物中鞣花酸含量的測(cè)定發(fā)現(xiàn),鞣花酸含量在10～50 min內(nèi),呈逐漸升高的趨勢(shì),在超過(guò)50 min后有下降趨勢(shì)。又因?yàn)槭袢~提取物的抗氧化活性與其總酚含量有正相關(guān)的關(guān)系,而與鞣花酸含量關(guān)系不大,故經(jīng)綜合考慮將所得到的總酚含量為最高的時(shí)間點(diǎn)(30 min)選為亞臨界水萃取的最佳提取時(shí)間。綜上,亞臨界水提取石榴葉總酚不適宜采用過(guò)長(zhǎng)的時(shí)間,在本實(shí)驗(yàn)中30 min為亞臨界水提取石榴葉總酚的最佳提取時(shí)間。

圖4 提取時(shí)間對(duì)石榴葉總酚、鞣花酸含量(A)及抗氧化活性(B)的影響Fig.4 Effects of extraction time on the contents oftotal phenolic and ellagic acid(A),and antioxidant activities(B)of pomegranate leaves

圖5 液料比對(duì)石榴葉總酚、鞣花酸含量(A)及抗氧化活性(B)的影響Fig.5 Effects of solvent/solid ratio on the contents oftotal phenolic and ellagic acid(A),and antioxidantactivities(B)of pomegranate leaves

2.2.3 液料比的影響 由圖5可知,總酚和鞣花酸的含量均隨液料比的增大而增加,當(dāng)液料比從20∶1 mL/g增加到50∶1 mL/g,總酚和鞣花酸含量也增加較快;在50∶1 mL/g 時(shí)總酚達(dá)到最高,但繼續(xù)增加液料比,總酚含量不會(huì)再繼續(xù)增加,但鞣花酸的含量繼續(xù)增加。在前人的研究中有報(bào)道稱,適度增加液料比,有利于加快介質(zhì)傳遞過(guò)程,提高多酚提取率;但是過(guò)多的溶劑量也會(huì)造成資源浪費(fèi)并增加后續(xù)去溶劑過(guò)程的工作量[18]。故經(jīng)綜合考慮,50∶1 mL/g為本研究中石榴葉總酚亞臨界水提取的最佳液料比。

2.3響應(yīng)面分析法優(yōu)化亞臨界提取工藝參數(shù)

2.3.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 綜合上述單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,應(yīng)用Design-Expert 8.0.6 軟件中的Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,以石榴葉提取物的總酚含量為響應(yīng)值(Y),以提取溫度(A)、提取時(shí)間(B)及液料比(C)3個(gè)因素為自變量,進(jìn)行3因子3水平的Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn),具體實(shí)驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1,響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案和結(jié)果見(jiàn)表2。

表3 擬合回歸方程的模型方差分析Table 3 Analysis variance for response surface quadratic model

注:*p<0.05表示影響顯著;**p<0.01表示影響極顯著。

表2 響應(yīng)面Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2 Box-Behnken experiment designand results of response surface methodology

2.3.2 模型的建立及其顯著性分析 運(yùn)用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表2的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,得到石榴葉總酚含量(Y)對(duì)提取溫度(A)、提取時(shí)間(B)和液料比(C)的回歸模型方程為:

Y=-2714.96+31.55 A+12.95B+22.28C+0.02AB+0.05AC+0.02BC-0.13A2-0.28B2-0.29C2。

2.3.3 各因子對(duì)石榴葉中總酚含量影響的等高線圖和響應(yīng)面直觀圖 根據(jù)回歸方程得到的響應(yīng)值(Y,總酚含量)對(duì)應(yīng)于自變量A(提取溫度)、B(提取時(shí)間)和C(液料比)構(gòu)成的二維平面等高線圖和三維空間曲面圖,分別見(jiàn)圖6～圖8,響應(yīng)曲面的形狀可直觀反映各因素之間的交互作用及其對(duì)響應(yīng)值的影響[21]。

由圖6中的可以看出,固定液料比不變,提取溫度和提取時(shí)間對(duì)總酚含量的影響都比較顯著,交互作用顯著,且提取溫度比時(shí)間對(duì)總酚含量的影響更為顯著,其響應(yīng)曲面彎曲程度較大,曲線較為陡峭。石榴葉中總酚含量隨著提取溫度的增加而增加,在達(dá)到最大之后有下降趨勢(shì),該極大值存在于響應(yīng)面的頂部,也是等高線的最小橢圓的中心點(diǎn)。

圖6 提取溫度(A)及提取時(shí)間(B)影響石榴葉總酚含量的等高線圖和響應(yīng)曲面圖Fig.6 Contour plot and response surface showingthe effects of extraction temperature and extraction timeon the total phenolics from pomegranate leaves

圖7反映了固定提取溫度后,提取時(shí)間和液料比之間的交互作用對(duì)石榴葉中總酚含量的影響,可見(jiàn)固定其中一個(gè)因素提取溫度后,總酚含量會(huì)隨著另外兩個(gè)因素的增加而呈現(xiàn)出先增高后降低的趨勢(shì),在合適的條件下總酚含量達(dá)到最大值。

圖7 提取時(shí)間(B)及液料比(C)影響石榴葉中總酚含量的響應(yīng)曲面圖和等高線圖Fig.7 Contour plot and response surface showingthe effects of extraction time and solvent/solid ratioon the total phenolics from pomegranate leaves

圖8反映了固定提取時(shí)間不變,提取溫度和液料比對(duì)于石榴葉總酚含量的影響及其交互作用,由圖8可知石榴葉總酚含量會(huì)隨著提取溫度和液料比的增加均呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì),曲面陡峭;換言之,總酚含量在一定的提取溫度和液料比下有極大值,即響應(yīng)曲面的頂點(diǎn)和等高線中最小橢圓的中心點(diǎn)。

綜上所述,圖6～圖8直觀地反映了亞臨界萃取過(guò)程中各因素交互作用對(duì)石榴葉總酚含量的影響。通過(guò)對(duì)圖6～圖8的綜合比較并結(jié)合表3結(jié)果可知,3個(gè)因子對(duì)石榴葉中總酚含量的影響均達(dá)到極顯著水平(p<0.01),提取溫度(A)與提取時(shí)間(B)和液料比(C)之間的交互作用均達(dá)到了顯著水平(p<0.05),曲面較為陡峭;而提取時(shí)間和液料比的交互作用未達(dá)到顯著水平。由表3的F值可知,亞臨界水提取過(guò)程中各因素對(duì)石榴葉總酚含量的影響大小順序依次為:液料比>提取溫度>提取時(shí)間。

2.3.4 最佳條件的優(yōu)化和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 在本實(shí)驗(yàn)中采用響應(yīng)面軟件中Optimization的優(yōu)化功能,根據(jù)建立的模型進(jìn)行優(yōu)化,可以得到亞臨界水萃取石榴葉總酚的理論最佳條件為:提取溫度為133.63 ℃、提取時(shí)間為31.01 min、液料比52.00∶1 mL/g,在該條件下石榴葉總酚含量的理論預(yù)測(cè)值為173.31 mg GAE/g。為檢驗(yàn)響應(yīng)面法優(yōu)化的可靠性,根據(jù)預(yù)測(cè)參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),考慮到操作的便利性在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中將各因素調(diào)整為提取溫度為134 ℃、提取時(shí)間為31 min,液料比為52∶1 mL/g,在該條件下測(cè)得石榴葉總酚含量為169.24 mg GAE/g,基本和預(yù)測(cè)值保持一致,說(shuō)明響應(yīng)面法可適用于對(duì)石榴葉總酚的亞臨界水提取工藝進(jìn)行回歸分析和參數(shù)優(yōu)化,且具有較高的實(shí)用價(jià)值。

表4 亞臨界水提取與熱回流法提取石榴葉總酚含量的比較Table 4 Comparison of total phenolics contents from pomegranate leaves obtained by subcritical water and hot reflux extraction methods

注：同一列中不同小寫字母上標(biāo)表示差異具有顯著性(p<0.05)。

2.4亞臨界水提取法與熱回流提取法的比較

從表4可知,采用加熱回流法使用75%乙醇和水作為溶劑提取的石榴葉提取物的總酚含量均顯著低于亞臨界水萃取法,且提取過(guò)程中耗時(shí)更長(zhǎng)。而邱濤濤等[1]用有機(jī)溶劑提取的石榴葉總酚粗提物得率為16.63%,雖與本研究中亞臨界水提取得到的總酚含量相差不大,但是提取過(guò)程耗時(shí)較長(zhǎng)且耗費(fèi)有機(jī)溶劑。因此可知,亞臨界水提取作為一種環(huán)保、有效的提取法,可明顯提高石榴葉提取物中總酚含量,可減少有機(jī)溶劑的使用且大大縮短其提取時(shí)間。

3 結(jié)論

采用亞臨界水提取法提取石榴葉中的總酚,通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)影響總酚含量的幾個(gè)主要因素如提取溫度、提取時(shí)間和液料比進(jìn)行了研究,并在此基礎(chǔ)上采用三因素三水平響應(yīng)面分析法進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。通過(guò)優(yōu)化分析得到亞臨界水提取石榴葉中總酚的最佳工藝條件為:提取溫度為134 ℃、提取時(shí)間為31 min、液料比為52∶1 mL/g,在此條件下,亞臨界水提取得到的石榴葉中總酚含量為169.24 mg GAE/g。比較亞臨界水提取和傳統(tǒng)加熱回流提取法得到的總酚含量,發(fā)現(xiàn)亞臨界水提取法可明顯提高石榴葉總酚含量,并且大大縮短提取時(shí)間,是一項(xiàng)非常綠色環(huán)保、有效的石榴葉總酚的提取技術(shù),具有較好的開發(fā)前景。

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Optimizationofsubcriticalwaterextractionfortotalphenolicsfrompomegranate(PunicagranatumL.)leavesbyresponsesurfacemethodology

YANLin-lin,ZHENGGuang-yao*,WEIChao-kuan

(Institute of Chemical Industry of Forest Products,CAF,Key and Open Lab.on Forest Chemical Engineering,SFA,Nanjing 210042,China)

The aim of this study was to optimize the technology parameters of subcritical water extraction for extracting total phenolics from pomegranate leaves by response surface methodology. On the basis of single-factor experiments,three-factors and three-level response surface methodology was applied to investigate the effects of extraction temperature,extraction time and solvent/solid ratio on the total phenolics contents. The results showed that model regression was significant,and the established regression equation for phenolics contents had an excellent of fit. The optimized extraction temperature was 134 ℃,extracting time was 31 minutes,and solvent/solid ratio was 52∶1 mL/g. Under the optimized conditions,the total phenolics content was 169.24 mg GAE/g,which was consistent with the predictive value of 173.31 mg GAE/g. In addition,the total phenolic content of the optimized extracts was higher than the reflux extraction using aqueous-organic solvent,and the time was shortened.

pomegranate leaves;total phenolics;subcritical water extraction;response surface methodology

TS209

B

1002-0306(2017)19-0184-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.19.034

2017-04-14

閆林林(1986-)，女，博士，助理研究員，研究方向：植物資源提取分離與開發(fā)利用，E-mail：yanlinlin155@163.com。

*通訊作者:鄭光耀(1964-)，男，本科，副研究員，研究方向：植物資源提取分離與開發(fā)利用，E-mail：zhguya@sina.com。

中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所研究團(tuán)隊(duì)建設(shè)創(chuàng)新工程項(xiàng)目(LHSXKQ4)。