基于SSR標(biāo)記的黑龍江省綠豆品種遺傳多樣性分析及指紋圖譜構(gòu)建

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(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江大慶 163319;2.國家雜糧工程技術(shù)研究中心,黑龍江大慶 163319)

基于SSR標(biāo)記的黑龍江省綠豆品種遺傳多樣性分析及指紋圖譜構(gòu)建

趙雅楠1,王穎1,2,張東杰1,*

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江大慶 163319;2.國家雜糧工程技術(shù)研究中心,黑龍江大慶 163319)

目的：為明確黑龍江地區(qū)綠豆品種遺傳多樣性水平并構(gòu)建SSR指紋圖譜,為綠豆育種研究及品種鑒定奠定基礎(chǔ)。方法：基于SSR熒光標(biāo)記技術(shù),利用篩選得到的14對SSR引物對黑龍江地區(qū)35份綠豆品種進(jìn)行遺傳多樣性分析及SSR指紋圖譜構(gòu)建。結(jié)果：14對SSR引物在35個綠豆品種中共檢測到49個等位基因,每對引物檢測到2～7個,平均3.5個;多態(tài)性信息含量PIC值介于0.106～0.761之間,平均為0.398。參試品種遺傳相似系數(shù)變幅介于0.6966～1.0000之間,平均為0.894,其中在0.82～0.86之間的遺傳相似系數(shù)占全部數(shù)據(jù)的51.2%。在遺傳相似系數(shù)為0.83的閾值處可將參試材料分為三大類群。構(gòu)建了35份具有品種特異性的綠豆SSR指紋圖譜及分子身份證,具有唯一性,可用于綠豆品種鑒定。結(jié)論:黑龍江地區(qū)綠豆品種遺傳多樣性水平不夠豐富,SSR指紋圖譜具可應(yīng)用于綠豆品種真?zhèn)舞b定。

SSR分子標(biāo)記技術(shù),綠豆,遺傳多樣性分析,指紋圖譜構(gòu)建

綠豆(Vignaradiate(L.)Wilczek)是我國重要的糧食作物,富含蛋白質(zhì)、維生素等營養(yǎng)成分,同時還含有黃酮類、生物堿類等活性成分,具有清熱解毒、名目降壓等功效,是一種深受歡迎的藥食同源作物[1-2]。我國綠豆栽培已有2000多年歷史,產(chǎn)量及種植面積均居世界前列,主產(chǎn)區(qū)主要集中在黃淮流域及東北地區(qū),其中內(nèi)蒙古、吉林、安徽、黑龍江等地區(qū)種植較多。然而綠豆一直被視為小雜糧作物,研究基礎(chǔ)較薄弱,且在長期生產(chǎn)種植過程中優(yōu)良親本的頻繁交流導(dǎo)致遺傳基礎(chǔ)狹窄,品種間相似度較高。隨著人們對綠豆需求量的不斷增加,假冒偽劣產(chǎn)品層出不窮,使得綠豆品種鑒定、原產(chǎn)地保護(hù)及溯源研究面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[3]。

隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展,SSR分子標(biāo)記技術(shù)在農(nóng)作物遺傳多樣性分析及指紋圖譜構(gòu)建方面得到了長足的發(fā)展。Sonkar[4]等利用4對SSR引物對36個水稻品種進(jìn)行遺傳多樣性分析,將參試品種分為兩大主要類群,明確了各品種間的遺傳關(guān)系;Molla[5]等利用5對SSR引物對42份孟加拉綠豆品種進(jìn)行分析,證明SSR技術(shù)可為綠豆品種鑒定、遺傳多樣性分析提供理論基礎(chǔ);段艷鳳[6]等利用10對SSR引物構(gòu)建了88個通過審定的馬鈴薯品種的指紋圖譜,具有唯一性,可將參試品種完全區(qū)分。Kassahun[7]等利用39對SSR引物構(gòu)建了12份高粱品種的指紋圖譜;胡曉輝[8]等利用50對SSR引物構(gòu)建了山東省46份審定花生品種的指紋圖譜,為花生種質(zhì)資源管理及育種實踐奠定理論基礎(chǔ);薛建峰[9]等利用171對SSR引物構(gòu)建了國內(nèi)外31份具有品種特異性的蓖麻指紋圖譜,可用于品種區(qū)分鑒定。

黑龍江省是我國綠豆主產(chǎn)區(qū)之一,但目前關(guān)于該地區(qū)綠豆SSR遺傳多樣性分析及指紋圖譜構(gòu)建的研究鮮有報道。基于此,本研究利用14對多態(tài)性豐富的SSR引物對黑龍江地區(qū)35份綠豆品種樣品進(jìn)行遺傳多樣性分析并構(gòu)建了具有品種特異性的指紋圖譜,旨在初步明確黑龍江綠豆種質(zhì)的遺傳分化程度,建立一種高效、快速的綠豆品種鑒定方法,為綠豆新基因挖掘、育種創(chuàng)新及品種鑒定、溯源管理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

本研究選取黑龍江地區(qū)35個綠豆品種為材料,均取自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所 詳情見表1；選取NCBI數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih. gov/)和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)院研究所提供的100對SSR引物進(jìn)行初篩。普通引物由上海生工生物工程有限公司合成;熒光引物 由美國ABI公司合成。植物基因組DNA提取試劑盒、Taq酶、dNTPs、Buffer、Mg2+等 均購于北京天根生物技術(shù)有限公司。

ABI Prism 3730XL型基因分析儀 上海杰李生物技術(shù)有限公司;Applied Biosystems? PCR基因擴(kuò)增儀 北京昊諾斯科技有限公司;德國Retsch(萊馳)MM400冷凍混合研磨儀 弗爾德(上海)儀器設(shè)備有限公司;KL05R高速冷凍離心機(jī) 湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司;α1900S紫外可見分光光度計 上海譜元儀器有限公司;Alpha 凝膠成像系統(tǒng) 美國ProteinSimple公司;SW-CJ-1D超凈工作臺 上海皓莊儀器有限公司;LDZX-40B立式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋 河北藍(lán)夢生物醫(yī)藥科技有限公司。

表1 參試綠豆材料Table 1 Origin of mungbean resources

1.2實驗方法

1.2.1 綠豆基因組DNA提取及檢測 每個樣品取室溫下(22～25 ℃)種植15 d左右的新鮮嫩葉,液氮環(huán)境下在球磨儀中打碎,采用新型植物基因組提取試劑盒(DP320)提取DNA,利用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測,用紫外分光光度計測定濃度,將提取得到的DNA母液稀釋成25 ng/μL于4 ℃環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SSR-PCR擴(kuò)增及引物初篩 SSR-PCR總反應(yīng)體系為20 μL,包括ddH2O 7.2 μL,MIX 10 μL,引物0.6 μL,DNA模板2 μL,Taq酶0.2 μL。SSR-PCR擴(kuò)增程序:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,54 ℃復(fù)性35 s,72 ℃延伸40 s,共35個循環(huán);最終72 ℃延伸3 min。后于6%變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行垂直電泳分析,銀染后觀察。隨機(jī)挑選10份綠豆為模板,對100對引物進(jìn)行初篩,選取條帶穩(wěn)定、多態(tài)性豐富的引物用于大批量分析研究。

1.2.3 SSR熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳檢測及數(shù)據(jù)處理 用超純水稀釋熒光標(biāo)記PCR產(chǎn)物以確定進(jìn)樣濃度,純化稀釋后的PCR產(chǎn)物去除其中的蛋白質(zhì)、鹽分等雜質(zhì),將甲酰胺與分子量內(nèi)標(biāo)按100∶1體積比混勻,取15 μL加入上樣板中,再加入1 μL稀釋10倍的PCR產(chǎn)物。最后使用3730XL測序儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳,利用Genemarker軟件分析原始數(shù)據(jù),根據(jù)目標(biāo)峰位置與內(nèi)標(biāo)LIZ500進(jìn)行比較,讀出每個樣品在各個等位基因位點的片段大小。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 根據(jù)分析結(jié)果,利用POPGENE[10]軟件計算有效等位基因數(shù)(Ne)、期望雜合度(He)、觀察雜合度(Ho)、多態(tài)性信息含量(PIC)等遺傳參數(shù);基于遺傳相似系數(shù),采用UPGMA法[11]構(gòu)建參試個體的聚類圖進(jìn)行親緣關(guān)系分析。

表2 基于14個SSR分子標(biāo)記的黑龍江地區(qū)綠豆品種多態(tài)性信息Table 2 Genetic diversity of mungbean from Heilongjiang province based on 14 SSRs

2 結(jié)果與分析

2.1SSR引物的多態(tài)性分析

對100對綠豆SSR引物進(jìn)行初篩,最終選取14對多態(tài)性豐富、條帶穩(wěn)定單一的核心引物,用于全部參試樣品的遺傳多樣性分析及指紋圖譜構(gòu)建。部分引物篩選結(jié)果如圖1所示。14對SSR引物共擴(kuò)增出49個等位基因,每對引物擴(kuò)增出2～7個不等,平均為3.5個;有效等位基因數(shù)變幅介于1.1228～4.7206之間,平均為2.0646;期望雜合度變幅介于0.1110～0.7996之間,平均為0.4712;Nei’s基因多樣性指數(shù)變幅介于0.1094～0.7882之間,平均為0.4645。多態(tài)性信息含量PIC值變幅介于0.106～0.761之間,平均為0.398。其中引物X46、X55、X168為高度多態(tài)性位點(PIC>0.5),多態(tài)性豐富,GBssr-MB91、P3-627屬低度多態(tài)性位點(PIC<0.25),檢測能力較差,其余9對引物均為中度多態(tài)性位點(0.25

圖1 部分引物篩選結(jié)果Fig.1 The amplified results of some primer selection

2.2遺傳多樣性分析

依據(jù)14對SSR引物檢測到的49個等位基因,利用NTSYSpc2.0統(tǒng)計分析軟件按Nei’s的方法計算,共獲得遺傳相似系數(shù)595個,變幅介于0.6966～1.0000之間,平均為0.894。其中小綠豆(C0858)和3129(C0840)之間的遺傳相似系數(shù)最小(0.6966),說明二者遺傳相似度較低,親緣關(guān)系較遠(yuǎn),而3136(C0841)和大綠豆(C0845)之間的遺傳相似系數(shù)最大,為1.0000,14對核心引物并沒有將其區(qū)分開,表明其親緣關(guān)系較近,也可能是“同種異名”的情況。如圖2所示,以0.02為組距對595個遺傳相似系數(shù)進(jìn)行次數(shù)分布分析,35份參試綠豆品種的遺傳相似系數(shù)近似呈正態(tài)分布,主要集中在0.82～0.86之間,共分布了305個,占全部數(shù)據(jù)的51.26%。表明黑龍江地區(qū)綠豆資源遺傳相似度較高,沒有相互間遺傳差異較大的品種。

圖2 遺傳相似系數(shù)的次數(shù)分布Fig.2 The distribution of genetic similarity

圖3 黑龍江地區(qū)綠豆資源個體UPGMA聚類圖Fig.3 UPGMA dendrogram of mungbean individuals from Heilongjiang province

2.3聚類分析

通過UPGMA法利用遺傳相似系數(shù)對參試品種進(jìn)行聚類分析,在遺傳相似系數(shù)為0.83的閾值處可將參試個體分為三個組群。第一大類群包括黑龍江2號(C0368)、大綠豆(C0836)等10個品種;第二大類群包括黑龍江4號(C0370)、63綠20(C0857)等24個品種,3129(C0840)單獨聚為一類,為第三大類群,說明該品種與其他品種間的遺傳距離較大,親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。進(jìn)一步分析,在遺傳相似系數(shù)為0.88的閾值處,可將第二大類群分為三個亞類。第一亞群的遺傳多樣性水平相對較高,品種間親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn),而第二、三亞群品種間遺傳相似程度較高,特別是第三亞群中3136(C0841)和大綠豆(C0845),二者在遺傳相似系數(shù)為1.0的水平上聚為一類,說明它們的遺傳背景相同,但不排除“同種異名”的情況。雖然黑龍江地區(qū)綠豆品種可明顯的被分為三大類群,但參試材料間的遺傳相似系數(shù)大部分都在0.80以上,說明該地區(qū)綠豆品種相似度較高,在育種過程中親本材料間的遺傳背景比較窄。

2.4SSR指紋圖譜及分子身份證構(gòu)建

整理14對引物對黑龍江地區(qū)35份綠豆材料擴(kuò)增得到的電泳峰圖,在同一峰值處有帶記為1,無帶記為0,構(gòu)建參試綠豆品種在14個微衛(wèi)星標(biāo)記上的DNA指紋圖譜數(shù)據(jù)庫[12]。同時,按表2引物順序,對每對引物在35份參試綠豆品種中擴(kuò)增出的等位基因按片段大小升序排列,依次編號。將每個樣品在14對引物上的擴(kuò)增條帶數(shù)據(jù)串聯(lián)起來,即得到由至少14位數(shù)字(有雜合帶時則多于14位)組成的分子身份證。如黑龍江2號(C0368)的分子身份證為12223112173114,第一個數(shù)字是“1”,即黑龍江2號(C0368)在1號引物GBssr-MB87上擴(kuò)增出在片段排列中排位第1的片段,其余13位依此類推。黑龍江地區(qū)綠豆品種SSR指紋數(shù)據(jù)及分子身份證詳情見表3。

表3 黑龍江地區(qū)綠豆品種SSR指紋數(shù)據(jù)及分子身份證Table 3 Fingerprint date and molecular identification of 35 mungbean varieties at 14 SSR loci

3 討論

分子生物學(xué)的不斷發(fā)展為作物遺傳多樣性分析及指紋圖譜構(gòu)建提供了新的途徑,尤其是SSR標(biāo)記技術(shù)因其多態(tài)性豐富、穩(wěn)定性強、操作簡便等特點更加適用于遺傳分析研究[13-15]。以往傳統(tǒng)的SSR標(biāo)記技術(shù)都是利用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測,耗時費力,效率較低,檢測結(jié)果易受環(huán)境和操作影響,且銀染顯影后無法確定片段大小,因此在不同批次分析中易產(chǎn)生誤差,降低檢測的精確性[16-17]。而SSR熒光標(biāo)記技術(shù)以DNA測序儀為平臺,利用熒光染料標(biāo)記SSR擴(kuò)增產(chǎn)物,可精確檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的片段長度,具有靈敏度高、檢測結(jié)果準(zhǔn)確、可實現(xiàn)自動化等特點[19]。許鯤[19]、王瑞[20]、程本義[21]等分別利用SSR熒光標(biāo)記毛細(xì)管檢測技術(shù)對油菜、高粱及稻米進(jìn)行遺傳多樣性分析及SSR指紋圖譜構(gòu)建,均得出上述結(jié)論。本研究基于SSR熒光標(biāo)記技術(shù)對黑龍江地區(qū)綠豆品種進(jìn)行檢測,直接讀取片段大小,研究結(jié)果更加客觀可靠。

本研究利用SSR熒光標(biāo)記技術(shù),以14對SSR引物對黑龍江地區(qū)35份綠豆品種進(jìn)行分析,共檢測到49個等位基因,每對引物檢測到2～7個,平均為3.5個;多態(tài)性信息含量變幅介于0.106～0.761之間,平均為0.398,這與劉巖[22]等利用40對引物分析全國272份綠豆資源得到平均等位基因數(shù)為3.1、平均PIC值為0.35的結(jié)果基本一致,但與其他豇豆屬作物研究相比結(jié)果略低,宮慧慧[23]等利用18對SSR引物對國內(nèi)外80份小豆品種進(jìn)行分析,每對引物檢測到的等位基因數(shù)為3～13個,平均為5.2個,PIC值介于0.23～0.83之間,平均為0.64。這一方面可能是由于綠豆基因組結(jié)構(gòu)決定其多態(tài)性水平較低,另一方面與研究者所用參試材料的遺傳背景、數(shù)量及對選用引物檢測到的位點數(shù)目及共顯性位點有效性等因素有密切聯(lián)系。同時,本研究選用的引物中X45和X55的PIC值(0.761,0.696)和等位基因數(shù)(7,7)均高于前人研究,多態(tài)性較豐富,可作為綠豆資源研究的骨干引物。

遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn),黑龍江地區(qū)綠豆品種的遺傳相似系數(shù)介于0.6966～1.0000之間,平均為0.894,大部分集中在0.82～0.86之間,表明參試品種間遺傳相似度較高,親緣關(guān)系較近。這可能是因為本研究材料均取自黑龍江地區(qū),在長期種植過程中優(yōu)良親本頻繁利用,導(dǎo)致其在DNA水平上相似度較高,整體表現(xiàn)為該地區(qū)遺傳背景比較狹窄。同時,品種3136(C0841)和大綠豆(C0845)在遺傳相似系數(shù)為1.0的水平上聚為一類,考慮二者之間的親緣關(guān)系較近,甚至可能是“同種異名”情況。聚類分析結(jié)果顯示,在遺傳相似系數(shù)為0.83處,可將參試品種分為3個類群,其中3129(C0840)單獨聚為一類,與其他品種的遺傳距離較大,考慮其可能來自黑龍江以外的其他地區(qū)。同時黑龍江2號(C0368)來源未知,根據(jù)聚類圖分析其可能與大綠豆(C0836)親緣關(guān)系較近,推測其可能與綠豆(C0836)一樣均來自海林縣或其附近地區(qū)。

傳統(tǒng)的品種鑒定主要是依靠田間種植鑒定,耗時長,易受環(huán)境影響。因此,建立品種DNA指紋圖譜,快速、準(zhǔn)確鑒定品種的真實性及種子純度具有重要意義。本研究基于SSR熒光標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建了黑龍江地區(qū)35份綠豆品種的SSR指紋數(shù)據(jù)庫及分子身份證,可將33個品種完全區(qū)分,數(shù)據(jù)具有特異性和唯一性,可為綠豆品種真?zhèn)舞b定提供依據(jù)。特別是分子身份證的構(gòu)建,將指紋數(shù)據(jù)數(shù)字化,更加直觀,方便。同時,分子身份證也可為品種親緣關(guān)系判定提供參考。如小綠豆(C0837)和小粒綠豆(C0838)的分子身份證分別為“22123222753134”和“22123222753133”,相似度較高,而二者之間的遺傳相似系數(shù)也較大,為0.988(文中未體現(xiàn)),表明其親緣關(guān)系較近,遺傳背景相似。

4 結(jié)論

本研究基于SSR技術(shù)對黑龍江地區(qū)35個綠豆品種進(jìn)行遺傳多樣性分析,從分子水平上揭示了黑龍江地區(qū)綠豆品種的遺傳多樣性水平。研究發(fā)現(xiàn),該地區(qū)綠豆品種遺傳多樣性不夠豐富,遺傳背景狹窄,今后應(yīng)在保護(hù)優(yōu)質(zhì)資源的同時著力引進(jìn)國內(nèi)外綠豆資源豐富地區(qū)的種質(zhì)以拓展該地區(qū)遺傳背景。同時,指紋圖譜及分子身份證的構(gòu)建為品種鑒定提供了新的思路和途徑,為名優(yōu)品種保護(hù)、品種真?zhèn)舞b定及原產(chǎn)地溯源研究提供重要依據(jù)。

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GeneticdiversityanalysisandDNAfingerprintsconstructionbasedonfluorescentlabeledSSRMarkersformungbeanvarieties(VignaradiateL.)fromheilongjiangprovince

ZHAOYa-nan1,WANGYing1,2,ZHANGDong-jie1,*

(1.College of Food Science,Heilongjiang Bayi Agricultural University,Daqing 163319,China;2.National Coarse Cereals Engineering Research Center,Daqing 163319,China)

Objective:The project of this study was to analysis the genetic diversity and establish SSR fingerprinting database of mungbean varieties from Heilongjiang province to lay the foundation for breeding and variety identification of mung bean.Methods:The 35 mungbean varieties were used as materials to analyze the genetic diversity and construct DNA fingerprint maps by 14 SSRs.Results:By using 14 pairs of SSR primers,49 alleles were detected out from 35 mungbean varieties,and each pair of primers detected out 2～7 alleles with an average of 3.5.The polymorphic information content values(PIC)ranged from 0.106 to 0.761,with a mean of 0.298. The genetic diversity coefficient among 35 mungbean varieties varied from 0.6966～1.0000 with an average of 0.83,and the genetic similarity coefficient of 51.2% tested materials ranged from 0.82 to 0.86. UPGMA clustering results showed that 35 mungbean varieties were clustered into 3 groups at 0.83 of genetic similarity coefficient. Establishing the SSR fingerprinting database and molecular identification of 35 mungbean cultivars from Heilongjiang province,providing reference for variety identification.Conclusion:The genetic background of mung bean varieties in Heilongjiang was narrow,and the level of genetic diversity was low.SSR fingerprints and molecular identification were constructed using SSR marker technique,which was of great significance for genetic authenticity,identity validation,traceability management and protection of origin of mungbean varieties.

SSR Markers;mungbean varieties;genetic diversity analysis;fingerprints construction

TS201.3

A

1002-0306(2017)19-0148-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.19.028

2017-03-29

趙雅楠(1993-)，女，碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程，E-mail：zyn658@163.com。

*通訊作者:張東杰(1966-)，男，博士，教授，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程，E-mail：byndzdj@126.com。

黑龍江省應(yīng)用技術(shù)與開發(fā)重大項目(GA14B104)；大慶科技局創(chuàng)新項目《雜糧及其深加工分析測試技術(shù)平臺建設(shè)》(sjh-2013-65)；黑龍江省研究生創(chuàng)新科研項目資金(YJSCX2017-Y50)。