紫娟茶提取物對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶、α-淀粉酶和胰脂肪酶的體外抑制作用

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(華東理工大學(xué),生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，發(fā)酵工業(yè)分離提取技術(shù)研發(fā)中心,上海 200237)

紫娟茶提取物對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶、α-淀粉酶和胰脂肪酶的體外抑制作用

趙瑜,周家春,張靖?jìng)?張宛昕,趙黎明*,蔣麗華*

(華東理工大學(xué),生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，發(fā)酵工業(yè)分離提取技術(shù)研發(fā)中心,上海 200237)

目的:探究紫娟茶提取物是否具有一定潛在的降血壓、降血糖和減肥功效,并分析紫娟茶提取物中茶多酚和花色苷在其中起到的作用。方法:對(duì)紫娟茶進(jìn)行提取,將紫娟茶粗提物(ZTE1)再分離為花色苷的粗提物(ZTE2)與茶多酚的粗提物(ZTE3),將ZTE2進(jìn)一步純化分離出兩種純化花色苷——飛燕草-3-O-β-D-(6-(E)-對(duì)香豆酸)吡喃半乳糖苷(delphinidin-3-O-β-D-(6-(E)-p-coumaroyl)galactopyranoside,AN3)和矢車菊-3-O-β-D-(6-(E)-對(duì)香豆酸)吡喃半乳糖苷(cyanidin-3-O-β-D-(6-(E)-p-coumaroyl)galactopyranoside,AN4);分別評(píng)價(jià)ZTE1、ZTE2、ZTE3、AN3和AN4對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(Angiotensin converting enzyme,ACE)、α-淀粉酶和胰脂肪酶的體外抑制作用,并與表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechin gallate,EGCG)進(jìn)行比較,評(píng)價(jià)了AN3和AN4對(duì)三種酶的抑制類型。結(jié)果:ZTE1、ZTE2、ZTE3、AN3和AN4對(duì)三種酶均有一定的抑制作用,粗提取物中,ZTE3對(duì)三種酶、ZTE1對(duì)α-淀粉酶和胰脂肪酶、ZTE2對(duì)α-淀粉酶的抑制超過或相當(dāng)于EGCG的效果,其中ZTE3對(duì)ACE、ZTE2對(duì)α-淀粉酶、ZTE1對(duì)胰脂肪酶的抑制效果最強(qiáng);純化花色苷中,AN3對(duì)α-淀粉酶的抑制效果較好,與EGCG無顯著性差異,AN3對(duì)三種酶的抑制效果均優(yōu)于AN4;此外,AN3和AN4對(duì)三種酶均為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制,抑制常數(shù)Ki分別為:0.33、0.37 mmol/L;0.39、0.41 mg/mL;0.22、0.78 mg/mL。結(jié)論:紫娟茶對(duì)高血壓、高血糖和肥胖癥有一定的潛在功效。

紫娟茶提取物,總酚,花色苷,茶多酚,血管緊張素轉(zhuǎn)換酶,α-淀粉酶,胰脂肪酶

代謝綜合癥,包括高血壓、高血糖、高血脂和肥胖癥等,已經(jīng)在世界各地迅速蔓延,嚴(yán)重威脅了人類的健康。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(Angiotensin converting enzyme,ACE)是參與維持血管張力過程中的重要酶[1],抑制這種酶被認(rèn)為是一個(gè)控制高血壓患者血壓的有效治療方法,而ACE抑制模型被證明是一個(gè)有效篩選抗高血壓藥物和功能食品的方法。α-淀粉酶抑制劑可以減緩高血糖或糖尿病患者碳水化合物的消化,導(dǎo)致葡萄糖吸收速度的降低,從而減弱餐后血糖的上升[2]。脂肪酶對(duì)脂肪在生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)移發(fā)揮著重要的作用,抑制胰脂肪酶在肥胖治療中一直被作為靶標(biāo)使用[3]。

許多研究已經(jīng)證明,一些天然產(chǎn)物對(duì)高血壓、高血糖和肥胖具有預(yù)防或治療的效果,茶就是其中之一。紫娟茶,山茶科(Theaceae)山茶屬(Camellia)茶組植物(Camelliasinensis(L.)O. Kuntze)茶種(Camelliasinensis)中的普洱茶變種(C.sinensisvar.assamica),源于云南大葉群體國(guó)家級(jí)茶樹良種——勐海大葉茶中單株培育而成[4]。紫娟茶富含多酚成分,特別是茶多酚和花色苷,已被學(xué)者們所關(guān)注。在前期研究中,本實(shí)驗(yàn)室利用高分辨率飛行時(shí)間質(zhì)譜(highresolution time of flight mass spectrometry HRTOF-MS)和核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)分離鑒定出紫娟茶中的四種花色苷,分別是飛燕草-3-O-β-半乳糖苷(delphinidin-3-O-β-D-galactoside,AN1)、矢車菊-3-O-β-半乳糖苷(cyanidin-3-O-β-D-galactoside,AN2)、飛燕草-3-O-β-D-(6-(E)-對(duì)香豆酸)吡喃半乳糖苷(delphinidin-3-O-β-D-(6-(E)-p-coumaroyl)galactopyranoside,AN3)和矢車菊-3-O-β-D-(6-(E)-對(duì)香豆酸)吡喃半乳糖苷(cyanidin-3-O-β-D-(6-(E)-p-coumaroyl)galactopyranoside,AN4),后兩種花色苷占到了紫娟茶花色苷總量的75%,并且僅在三種茶樹品種中發(fā)現(xiàn),被證實(shí)具有良好的清除自由基能力,并且優(yōu)于合成的抗氧化劑2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol,BHT)[5]。

雖然我們對(duì)紫娟茶進(jìn)行了部分研究,但對(duì)它的生理活性,特別是降血壓、降血糖和抗肥胖特性等都還不清楚。本研究提取并量化了紫娟茶中的總酚、花色苷和茶多酚,探究了紫娟茶提取物對(duì)ACE、α-淀粉酶和胰脂肪酶的抑制作用,通過比較紫娟茶的粗提取物、純化花色苷AN3和AN4、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechin gallate,EGCG)對(duì)三種酶的抑制作用,探尋紫娟茶中對(duì)降血壓、降血糖和抗肥胖起重要作用的關(guān)鍵組分。并且針對(duì)AN3和AN4對(duì)三種酶的抑制類型、抑制常數(shù)等也進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)探討。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

紫娟茶葉 市售;Amberlite XAD-7HP大孔吸附樹脂 美國(guó)羅門哈斯公司;Silica gel 60 C18樹脂(45～63 μm) 德國(guó)默克公司;三氟乙酸(Trifluoroacetic acid,TFA) 阿拉丁化學(xué)試劑有限公司;沒食子酸(Gallic acid,GA)、(+)-兒茶素(Catechin,C)、(-)-兒茶素沒食子酸酯(Catechin gallate,CG)、(-)-表兒茶素(Epicatechin,EC)、(-)-表兒茶素沒食子酸酯(Epicatechin gallate,ECG)、(-)-表沒食子兒茶素(Epigallocatechin,EGC)、(-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechin gallate,EGCG)、(-)-沒食子兒茶素(Gallocatechin,GC)、(-)-沒食子兒茶素沒食子酸酯(Gallocatechin gallate,GCG)、矢車菊-3-O-β-D-葡萄糖苷、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶-來源于兔肺(ACE)(EC 3.4.15.1)、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸水合物(N-Benzoyl-Gly-His-Leu,HHL)、豬胰腺α-淀粉酶(EC 3.2.1.1) Sigma-Aldrich(中國(guó))貿(mào)易有限公司;甲醇、乙醚、氯仿、乙酸乙酯、乙腈(HPLC級(jí))、鹽酸(HCl)、三羥甲基氨基甲烷(Tris(hydroxymethyl)methyl aminomethane,Tris)、氯化鈉(NaCl)、可溶性淀粉、麥芽糖、月桂酸4-硝基苯酯(4-Nitrophenyl laurate,p-PNL)、醋酸鈉、豬胰腺脂肪酶(EC 3.1.1.3)、聚乙二醇辛基苯基醚(曲拉通X-100) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;3,5-二硝基水楊酸(3,5-Dinitrosalicylic acid,DNS) 上?？曝S實(shí)業(yè)有限公司;氫氧化鈉(NaOH)、酒石酸鉀鈉、苯酚、無水亞硫酸鈉(Na2SO3)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、磷酸二氫鈉(NaH2PO4) 上海凌峰化學(xué)試劑有限公司;其中化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或色譜純。

CP214C電子天平 奧豪斯儀器(上海)有限公司;循環(huán)水式多用真空泵 上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司;BT-100SD定時(shí)恒流泵 上海滬西儀器有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申生科技有限公司;自流柱(Φ25 mm×600 mm) 上海華美實(shí)驗(yàn)儀器廠;真空冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠;磁力攪拌機(jī) 上海精科實(shí)業(yè)有限公司;移液槍 Dragon Lab;超聲波清洗器 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司;島津10A高效液相色譜儀 島津有限公司;FE20精密pH計(jì) 梅特勒托利多儀器(上海)有限公司;HHS-21-4孔型電熱恒溫水浴鍋 上海醫(yī)療機(jī)械五廠;高速離心機(jī) Thermo Fisher;UV-2000紫外可見分光光度計(jì) 尤尼克(上海)儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紫娟茶的提取 紫娟茶提取物(Zijuan tea extract,ZTE)的制備參照實(shí)驗(yàn)室已總結(jié)的方法[5]:利用含0.1%三氟乙酸(TFA)的85%甲醇溶液提取干燥的紫娟茶葉,然后用乙醚和氯仿分別萃取。將濃縮水溶液緩慢滴入已處理好的Amberlite XAD-7HP層析柱中,先用去離子水洗滌,再用含0.1%TFA的100%甲醇溶液洗脫,直至無有色物質(zhì)洗脫下來為止,收集甲醇洗脫液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,冷凍干燥,得到紫娟茶粗提物(ZTE1)。隨后,將ZTE1粉末用乙酸乙酯萃取,得到不溶物——花色苷的粗提物(ZTE2)和可溶物——茶多酚的粗提物(ZTE3),分別旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),冷凍干燥待用。

1.2.2 花色苷的分離和純化 將ZTE2用5%甲醇溶液溶解后緩慢滴入經(jīng)過預(yù)處理的Silica gel 60 C18柱中,依次用0%、10%、20%、30%、40%和50%的甲醇溶液(含0.1% TFA,分別使用1 L洗脫液)進(jìn)行梯度洗脫。得到四段紅色組分,分別定義為AN1、AN2、AN3和AN4,分段回收,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),冷凍干燥。

1.2.3 總酚含量的測(cè)定 分別配制1 mg/mL的ZTE1、ZTE2和ZTE3溶液測(cè)定其總酚含量,總酚的含量利用Folin-Ciocalteu法進(jìn)行測(cè)定[6],結(jié)果以沒食子酸當(dāng)量表示。

1.2.4 茶多酚的定性和定量測(cè)定 配制不同濃度的GA、C、CG、EC、ECG、EGC、EGCG、GC和GCG的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液,制備所需濃度梯度后,進(jìn)行HPLC分析,以峰面積對(duì)其相應(yīng)濃度進(jìn)行線性回歸計(jì)算。定性和定量測(cè)定1 mg/mL的ZTE1、ZTE2和ZTE3溶液中的茶多酚。

1.2.5 花色苷的含量測(cè)定 配制不同濃度的矢車菊-3-O-β-D-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液,進(jìn)行HPLC分析,以峰面積對(duì)其相應(yīng)濃度進(jìn)行線性回歸計(jì)算,結(jié)果以矢車菊-3-O-β-D-葡萄糖苷當(dāng)量表示。

1.2.6 HPLC-DAD分析 所有樣品,包括ZTE1、ZTE2、ZTE3、AN1、AN2、AN3、AN4和矢車菊-3-O-β-D-葡萄糖苷、GA、GC、EGC、C、EC、EGCG、GCG、ECG、CG的標(biāo)準(zhǔn)品,均使用如下檢測(cè)條件:

色譜柱:Inertsil/Wondasil ODS色譜(250 mm×4.6 mm;i.d.:5 μm)；

檢測(cè)波長(zhǎng):280 nm和520 nm;柱溫:28 ℃;進(jìn)樣量:10 μL;流速:0.8 mL/min;

流動(dòng)相條件:流動(dòng)相A:10%乙腈溶液(含0.1% TFA);

流動(dòng)相B:50%乙腈溶液(含0.1% TFA);

梯度洗脫:0～45 min,B相0～75%;45～50 min,B相75%～75%。

每個(gè)樣品進(jìn)樣前需經(jīng)過0.22 μm微孔濾膜去除雜質(zhì)。

1.2.7 ACE、α-淀粉酶和胰脂肪酶的抑制實(shí)驗(yàn) 紫娟茶提取物ZTE1、ZTE2和ZTE3,純化花色苷AN3和AN4,以及EGCG標(biāo)準(zhǔn)品均被作為三種酶的抑制劑樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。AN3和AN4作為花色苷的典型代表,EGCG作為兒茶素的代表,分別進(jìn)行測(cè)試比較。

1.2.7.1 ACE的抑制實(shí)驗(yàn) ACE活性的測(cè)定參照Actis-Goretta等人的方法[7]并稍加改動(dòng),以馬尿酰-組氨酰-亮氨酸水合物(HHL)作為底物,與ACE反應(yīng)后測(cè)定其生成的馬尿酸含量,生成的馬尿酸通過比對(duì)馬尿酸標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC譜圖來定性和定量。

色譜條件：色譜柱:WondaSil C18(250 mm×4.6 mm;i.d.:5 μm);檢測(cè)波長(zhǎng):228 nm;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:20 μL;流速:1 mL/min;流動(dòng)相:超純水(含0.1% TFA)和100%乙腈;洗脫條件:75%/25%(v/v)等度洗脫。

每個(gè)樣品進(jìn)樣前經(jīng)過0.22 μm微孔濾膜去除雜質(zhì)。

取20 μL ACE溶液(0.1 U/mL),加入100 μL樣品,37 ℃水浴30 min,加入100 μL已預(yù)熱的HHL溶液(5.0 mmol/L),再在37 ℃水浴中反應(yīng)60 min,加入300 μL 1 mol/L HCl終止反應(yīng),過0.22 μm濾膜,進(jìn)HPLC分析馬尿酸的生成量。以不加樣品作為對(duì)照組,不加樣品和ACE作為空白組。因?yàn)樽暇瓴杼崛∥锞哂蓄伾?對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能有影響,因而以加樣品不加ACE作為實(shí)驗(yàn)空白組以除去抑制劑本身顏色可能引起的影響。

表1 ACE抑制率體外測(cè)定方法Table 1 Determination of the inhibition rate of ACE in vitro

樣品對(duì)ACE的抑制率按如下公式計(jì)算:

式(1)

式中:A表示實(shí)驗(yàn)組的峰面積,B表示實(shí)驗(yàn)空白組的峰面積,C表示對(duì)照組的峰面積,D表示空白組的峰面積。

計(jì)算出各樣品的抑制率后,使用半數(shù)抑制濃度(IC50)計(jì)算軟件——藥物抑制濃度計(jì)算軟件(LOGIT法,版本1.0.0)計(jì)算各樣品對(duì)ACE的半數(shù)抑制濃度。

1.2.7.2 紫娟茶提取物和EGCG對(duì)α-淀粉酶的抑制作用 抑制α-淀粉酶活性的檢測(cè)參照Marcia等人的方法[8]并稍加改動(dòng)。取0.5 mLα-淀粉酶溶液,加入0.5 mL樣品,25 ℃水浴10 min,加入0.5 mL已預(yù)熱10 min的1%淀粉溶液,再在25 ℃水浴中反應(yīng)10 min,加入1 mL DNS顯色劑,沸水浴10 min,迅速流水冷卻,加入15 mL去離子水稀釋,混勻后以緩沖液為參比液,使用紫外-可見分光光度計(jì)在540 nm下測(cè)定其吸光度,制作麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線以計(jì)算麥芽糖的生成量。以不加樣品作為對(duì)照組,不加樣品和α-淀粉酶作為空白組,加樣品不加α-淀粉酶作為實(shí)驗(yàn)空白組。

表2 α-淀粉酶抑制率體外測(cè)定方法Table 2 Determination of the inhibitionrate of α-amylase in vitro

樣品對(duì)α-淀粉酶的抑制率及半數(shù)抑制濃度(IC50)的計(jì)算同1.2.7.1。

1.2.7.3 紫娟茶提取物和EGCG對(duì)胰脂肪酶的抑制作用 抑制胰脂肪酶活性的檢測(cè)參照McDougall等人的方法[9]并稍加改動(dòng)。取0.5 mL 胰脂肪酶溶液,加入0.5 mL待測(cè)樣品和3 mL 0.1 mol/L pH8.2的Tris-HCl緩沖液,37 ℃水浴10 min后,加入1.5 mL已預(yù)熱10 min的p-PNL溶液,繼續(xù)在37 ℃水浴中反應(yīng)2 h,4 ℃、16000 r/min離心2.5 min后取上清,以緩沖液為參比液,使用紫外-可見分光光度計(jì)在400 nm下測(cè)定其吸光度。以不加樣品作為對(duì)照組,不加樣品和胰脂肪酶作為空白組,加樣品不加胰脂肪酶作為實(shí)驗(yàn)空白組。

表3 胰脂肪酶抑制率體外測(cè)定方法Table 3 Determination of the inhibition rate ofpancreatic lipase in vitro

樣品對(duì)胰脂肪酶的抑制率及半數(shù)抑制濃度(IC50)的計(jì)算同1.2.7.1。

1.2.8 血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)、α-淀粉酶和胰脂肪酶的酶動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

1.2.8.1 紫娟茶中花色苷單體AN3和AN4對(duì)ACE作用的動(dòng)力學(xué)研究 分別配制3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mmol/L的HHL底物溶液,0、0.4、0.6 mg/mL的AN3和0、0.5、1.0 mg/mL的AN4樣品溶液,分別在不同底物濃度和不同樣品濃度的條件下按1.2.7.1的方法僅反應(yīng)10 min即終止,通過HPLC譜圖測(cè)定ACE的反應(yīng)速率,采用雙倒數(shù)作圖法(Lineweawer-Burk),以底物濃度的倒數(shù)為橫坐標(biāo),相應(yīng)的反應(yīng)速率的倒數(shù)為縱坐標(biāo),繪制動(dòng)力學(xué)曲線。AN3和AN4對(duì)ACE的抑制類型可根據(jù)圖來判斷:直線相交于X軸為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制,直線相交于Y軸為競(jìng)爭(zhēng)性抑制,直線相交在象限內(nèi)為混合型抑制,直線平行不相交的則為反競(jìng)爭(zhēng)性抑制。所得直線的縱坐標(biāo)截距為1/Vmax,橫坐標(biāo)截距即為-1/Km。

1.2.8.2 紫娟茶中花色苷單體AN3和AN4對(duì)α-淀粉酶作用的動(dòng)力學(xué)研究 分別配制0.5%、0.75%、1.0%、1.25%和1.5%的淀粉溶液,0、0.8、1.6 mg/mL的AN3和0、1.2、2.0 mg/mL的AN4樣品溶液作為抑制劑,分別在不同底物濃度和不同抑制劑濃度的條件下按1.2.7.2的方法反應(yīng)5 min即終止,測(cè)定α-淀粉酶的反應(yīng)速率,采用雙倒數(shù)作圖法(Lineweawer-Burk),以底物濃度的倒數(shù)為橫坐標(biāo),相應(yīng)的反應(yīng)速率的倒數(shù)為縱坐標(biāo),繪制動(dòng)力學(xué)曲線。同1.2.8.1,根據(jù)圖判斷AN3和AN4對(duì)α-淀粉酶的抑制類型。

1.2.8.3 紫娟茶中花色苷單體AN3和AN4對(duì)胰脂肪酶作用的動(dòng)力學(xué)研究 分別配制0.06%、0.07%、0.08%、0.09%、0.10%的p-PNL底物溶液,0、0.4、0.6 mg/mL的AN3和0、0.5、1.0 mg/mL的AN4樣品溶液作為抑制劑,分別在不同底物濃度和不同抑制劑濃度的條件下按1.2.7.3的方法反應(yīng)30 min即終止,測(cè)定胰脂肪酶的反應(yīng)速率,采用雙倒數(shù)作圖法(Lineweawer-Burk),以底物濃度的倒數(shù)為橫坐標(biāo),相應(yīng)的反應(yīng)速率的倒數(shù)為縱坐標(biāo),繪制動(dòng)力學(xué)曲線。根據(jù)圖判斷AN3和AN4對(duì)胰脂肪酶的抑制類型。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SigmaPlot 10.0作圖,SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間比較采用單因素方差分析。進(jìn)一步進(jìn)行組間兩兩比較,若方差齊時(shí),采用LSD檢驗(yàn);若方差不齊,采用Tamhane’s檢驗(yàn),差異顯著水平為p<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1紫娟茶提取物中的總酚、茶多酚和花色苷

300 g紫娟茶經(jīng)過提取后得到31.2 g ZTE1,20 g ZTE1經(jīng)乙酸乙酯萃取后得到4.3 g ZTE2和14.6 g ZTE3,分別占21.5%和73%。1 mg/mL的ZTE1、ZTE2和ZTE3中總酚含量分別為(1.65±0.27)、(0.74±0.21)和(0.98±0.29) mg/mg(以沒食子酸為當(dāng)量)。圖1為GA、C、CG、EC、ECG、EGC、EGCG、GC和GCG的混標(biāo)HPLC圖譜,比對(duì)該混標(biāo)圖譜及實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)花色苷的鑒定,得到圖2所示的三種提取物在280 nm和520 nm下的HPLC譜圖。從280 nm的譜圖中可見,ZTE1中除了幾種常見的茶多酚外,還有一些其他尚未鑒定的酚類物質(zhì)。

圖1 混標(biāo)高效液相色譜圖(280 nm)Fig.1 The HPLC profile determined at 280 nm

圖2 紫娟茶提取物ZTE1,ZTE2,ZTE3高效液相色譜圖(280 nm和520 nm)Fig.2 The HPLC profile of ZTE1,ZTE2,and ZTE3(determined at 280 nm and 520 nm)

幾種主要的茶多酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程如表4所示,所有曲線在一定的范圍內(nèi)均呈現(xiàn)了良好的線性關(guān)系。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到三種紫娟茶提取物中各個(gè)茶多酚的含量如表5所示。ZTE3中的茶多酚總量最多,是ZTE2的7倍多,可知紫娟茶中的茶多酚經(jīng)過乙酸乙酯的洗滌大多被分配到了ZTE3中。酯型兒茶素(EGCG、ECG、GCG和CG)的總量在三種提取物的茶多酚中各占69%、28%和83%。最重要的茶多酚——EGCG,在ZTE3中的含量是ZTE2中的約20倍,在三種提取物的茶多酚中分別占到了46%、18%和49%;ECG在ZTE3中的含量是ZTE2中的100倍以上;而GCG和CG在ZTE2和ZTE3中差異不大。非酯型兒茶素(C、EC、GC和EGC)的總量在ZTE2((33.15±1.23) mg/g)和ZTE3((57.47±2.56) mg/g)中也有顯著性差異。

表4 茶多酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Table 4 The calibration curve equations of catechins

注:*:x單位μg;y單位×105。

本實(shí)驗(yàn)室前期工作已鑒定出ZTE2分離純化后得到的4種紅色組分——AN1、AN2、AN3和AN4分別為飛燕草-3-O-β-半乳糖苷、矢車菊-3-O-β-半乳糖苷、飛燕草-3-O-β-D-(6-(E)-對(duì)香豆酸)吡喃半乳糖苷和矢車菊-3-O-β-D-(6-(E)-對(duì)香豆酸)吡喃半乳糖苷[5],ZTE1和ZTE2中花色苷總量分別為(5.11±0.13)、(17.12±0.41) mg/g(以矢車菊-3-O-葡萄糖苷為當(dāng)量),ZTE3中未檢出花色苷。可見,紫娟茶中的花色苷經(jīng)過乙酸乙酯的洗滌已基本完全轉(zhuǎn)移到ZTE2中,這也證實(shí)了M??tt?-Riihinen等人的研究:乙酸乙酯可以有效地分離花色苷和大多數(shù)的兒茶素[10]。

分別觀察通過1.2.1～1.2.2制備得到的AN3和AN4在280、520 nm的HPLC譜圖(圖3和圖4),二者分別在兩種波長(zhǎng)下的峰型幾乎重合,可得知樣品中無其他酚類物質(zhì),證明該制備方法可以很好的將AN3和AN4從紫娟茶中分離出來,純度分別達(dá)到96.7%和98.4%。而AN1和AN2在280 nm的HPLC譜圖中,除了在與520 nm的HPLC譜圖相同的保留時(shí)間處出峰外,還有其他雜峰的產(chǎn)生。并且,AN3和AN4占據(jù)了紫娟茶中花色苷總量的約75%[5],因而二者被應(yīng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)中。

表5 茶多酚在紫娟茶提取物(ZTE1,ZTE2和ZTE3)中的含量Table 5 The contents of catechins in Zijuan tea extracts(ZTE1,ZTE2,and ZTE3)

圖3 紫娟茶中花色苷單體AN3的高效液相色譜圖Fig.3 The HPLC profile of AN3

圖4 紫娟茶中花色苷單體AN4的高效液相色譜圖Fig.4 The HPLC profile of AN4

2.2ZTE1、ZTE2、ZTE3、AN3、AN4和EGCG對(duì)ACE酶、α-淀粉酶和胰脂肪酶的抑制作用和動(dòng)力學(xué)研究

2.2.1 對(duì)ACE酶的抑制作用和動(dòng)力學(xué)研究 ZTE1、ZTE2和ZTE3對(duì)ACE的抑制效果如圖5所示。三種提取物中,ZTE3對(duì)ACE的抑制效果最強(qiáng),其次是ZTE1,最后是ZTE2。樣品在0.025～0.4 mg/mL的濃度范圍內(nèi)對(duì)ACE的抑制效果隨著濃度的升高而有所增加,在0.4 mg/mL的濃度下,三種提取物對(duì)ACE的抑制效果均超過了70%,其中ZTE1和ZTE3甚至超過了90%。

圖5 ZTE1、ZTE2和ZTE3對(duì)ACE的抑制作用Fig.5 ACE inhibitory activities ofZTE1,ZTE2 and ZTE3

AN3和AN4對(duì)ACE的抑制效果如圖6所示。由圖中可看出,在0.4～1.2 mg/mL的濃度范圍內(nèi),AN3對(duì)ACE的抑制效果明顯強(qiáng)于AN4。在1.2 mg/mL的濃度下,AN4對(duì)ACE的抑制率略高于50%,而AN3對(duì)ACE的抑制率則超過了80%。

圖6 AN3和AN4對(duì)ACE的抑制作用Fig.6 ACE inhibitory activities of AN3 and AN4

圖7 EGCG對(duì)ACE的抑制作用Fig.7 ACE inhibitory activity of EGCG

EGCG對(duì)ACE的抑制效果如圖7所示。由圖可知,在0.02～0.30 mg/mL的濃度范圍內(nèi),EGCG對(duì)ACE的抑制效果隨著濃度的升高而增強(qiáng)。EGCG對(duì)ACE的抑制效果在濃度為0.02～0.05 mg/mL時(shí)有一顯著升高,而在0.05～0.20 mg/mL抑制效果趨于在平緩中小幅度增加,而在0.30 mg/mL的濃度下,其對(duì)ACE的抑制率已接近90%。Hara等人[11]早在1987年即報(bào)道了EGCG對(duì)ACE的抑制效果在主要的幾種茶多酚中是最強(qiáng)的,所以我們選擇EGCG作為陽(yáng)性對(duì)照,將紫娟茶提取物的ACE抑制效果與EGCG相比較。由圖6和圖7可看出,紫娟茶中的兩種花色苷單體AN3和AN4對(duì)ACE的抑制效果明顯低于EGCG,可知AN3和AN4在紫娟茶的降壓效果中并未起到主要的作用。

紫娟茶提取物和純化花色苷,包括ZTE1、ZTE2、ZTE3、AN3和AN4,以及EGCG對(duì)ACE的IC50值如圖8所示。提取物中,ZTE3對(duì)ACE的抑制效果最強(qiáng),ZTE1、EGCG均與其沒有顯著性差異(p>0.05),而ZTE2則遜色于二者(p<0.05)。純化花色苷單體AN3和AN4對(duì)ACE的IC50值明顯高于EGCG,尤其是AN4((1.17±0.03) mg/mL),是EGCG((0.04±0.00) mg/mL)的近30倍。提取物ZTE2和單體AN3、AN4對(duì)ACE較弱的抑制效果、含大量茶多酚的ZTE3對(duì)ACE最強(qiáng)的抑制效果表明,紫娟茶的降血壓功效可能由茶多酚引起。

圖8 ZTE1、ZTE2、ZTE3、AN3、AN4和EGCG對(duì)ACE的半數(shù)抑制濃度Fig.8 ACE IC50 of ZTE1、ZTE2、ZTE3、AN3、AN4 and EGCG注：標(biāo)注不同字母表示數(shù)據(jù)有顯著差異(p<0.05)，圖12、圖18同。

根據(jù)酶動(dòng)力學(xué)理論,以底物濃度的倒數(shù)為橫坐標(biāo),反應(yīng)速率的倒數(shù)為縱坐標(biāo)繪制雙倒數(shù)曲線圖(Lineweaver-Burk)。如圖9和圖10所示,由直線分別相交于X軸負(fù)半軸上——即米氏常數(shù)Km不變,反應(yīng)速率隨著抑制劑濃度的升高而降低——即表觀最大反應(yīng)速率降低可知,紫娟茶提取物中的花色苷AN3和AN4對(duì)ACE的抑制類型為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制,即抑制劑、底物能同時(shí)與ACE結(jié)合,但此復(fù)合物不能進(jìn)一步分解為產(chǎn)物。根據(jù)酶動(dòng)力學(xué)理論,AN3和AN4對(duì)ACE的抑制常數(shù)Ki分別為0.33、0.37 mmol/L。抑制常數(shù)Ki也就是酶與抑制劑復(fù)合物的解離常數(shù),其倒數(shù)1/Ki反映了抑制劑與酶的親和力,Ki值越小,其親和力越大,因此AN3對(duì)ACE的親和力大于AN4可能是AN3的抑制作用強(qiáng)于AN4的原因之一。盡管AN3和AN4的Ki值遠(yuǎn)大于典型的ACE抑制劑型化學(xué)合成降壓藥物——卡托普利的Ki值(1.4 nmol/L)[12],但作為一種天然產(chǎn)物,其效果仍然值得關(guān)注。

圖9 AN3對(duì)ACE的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線Fig.9 Lineweaver-Burk of AN3 on ACE

圖10 AN4對(duì)ACE的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線Fig.10 Lineweaver-Burk of AN4 on ACE

2.2.2 對(duì)α-淀粉酶的抑制作用和動(dòng)力學(xué)研究 紫娟茶提取物、純化花色苷和EGCG對(duì)α-淀粉酶的抑制效果如圖11所示。所有樣品的抑制率都隨著濃度的增加而增加。粗提物中,與ZTE1和ZTE3相比,ZTE2展現(xiàn)出明顯優(yōu)于其他樣品的抑制效果(p<0.05)。而純化的花色苷AN3和AN4相比,AN3具有更好的抑制α-淀粉酶的效果。EGCG抑制α-淀粉酶的效果與AN3相當(dāng)。含有主要花色苷的粗提物組分ZTE2具有最強(qiáng)的抑制α-淀粉酶的效果,且單體花色苷AN3的效果與EGCG相當(dāng),可推測(cè)紫娟茶的降血糖功效主要由花色苷引起。

圖11 ZTE1、ZTE2、ZTE3、AN3、AN4和EGCG對(duì)α-淀粉酶的抑制作用Fig.11 α-Amylase inhibitory activities ofZTE1,ZTE2,ZTE3,AN3,AN4 and EGCG

如圖12所示,ZTE1、ZTE2、ZTE3、AN3、AN4和EGCG對(duì)α-淀粉酶的IC50值分別為(0.89±0.01)、(0.65±0.01)、(1.18±0.03)、(1.57±0.02)、(1.98±0.01)、(1.54±0.01) mg/mL。Hara等人研究了茶多酚抑制人體唾液α-淀粉酶,其中EGCG的IC50為260 μmol/L(0.12 mg/mL)[13];Matsui等人研究了一些花色苷對(duì)人體唾液α-淀粉酶的抑制作用[14]。二者同本實(shí)驗(yàn)一樣,均使用淀粉作為反應(yīng)底物。而Tadera等人使用一種合成底物——BPNPG7進(jìn)行反應(yīng),該實(shí)驗(yàn)中EGCG和矢車菊素對(duì)豬胰腺α-淀粉酶的抑制作用較弱。但隨后他們又使用水溶性淀粉作為底物探討EGCG和矢車菊素對(duì)豬胰腺α-淀粉酶的抑制效果,結(jié)果顯示EGCG和矢車菊素對(duì)豬胰腺α-淀粉酶的IC50值分別為400、80 μmol/L(0.18、0023 mg/mL)[15]。由此可見,不同的檢測(cè)方法中因使用的底物和酶的濃度及用量不同會(huì)產(chǎn)生不同的結(jié)果。但本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與Tadera等人證實(shí)的花色苷對(duì)豬胰腺α-淀粉酶的抑制效果優(yōu)于茶多酚保持一致。

圖12 ZTE1、ZTE2、ZTE3、AN3、AN4和EGCG對(duì)α-淀粉酶的半數(shù)抑制濃度Fig.12 α-Amylase IC50 ofZTE1,ZTE2,ZTE3,AN3,AN4 and EGCG

根據(jù)酶動(dòng)力學(xué)理論,以底物濃度的倒數(shù)為橫坐標(biāo),反應(yīng)速率的倒數(shù)為縱坐標(biāo)繪制雙倒數(shù)曲線圖。如圖13和圖14所示,紫娟茶提取物中的花色苷AN3和AN4對(duì)α-淀粉酶的抑制類型為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制,AN3和AN4對(duì)α-淀粉酶的抑制常數(shù)Ki分別為0.39、0.41 mg/mL。AN3的抑制常數(shù)Ki小于AN4,即AN3對(duì)α-淀粉酶的親和力比AN4大,因此AN3對(duì)α-淀粉酶的親和力大于AN4可能是AN3的抑制作用強(qiáng)于AN4的原因之一。

圖13 AN3對(duì)α-淀粉酶的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線Fig.13 Lineweaver-Burk ofAN3 on α-amylase

圖14 AN4對(duì)α-淀粉酶的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線Fig.14 Lineweaver-Burk of AN4 on α-amylase

2.2.3 對(duì)胰脂肪酶的抑制作用和動(dòng)力學(xué)研究 ZTE1、ZTE2和ZTE3對(duì)胰脂肪酶的抑制效果如圖15所示。從圖中可看出,各樣品在0.2～1.0 mg/mL的濃度范圍內(nèi)對(duì)胰脂肪酶的抑制效果隨著濃度的升高而有所增加,然而在不同的濃度下三種粗提物對(duì)胰脂肪酶抑制效果的強(qiáng)弱卻明顯不同——在高濃度(1.0 mg/mL)下,樣品的抑制效果由強(qiáng)到弱依次是ZTE3>ZTE1>ZTE2,而在低濃度(0.2 mg/mL)下,樣品對(duì)胰脂肪酶的抑制效果的順序完全相反。可看出在此濃度變化范圍內(nèi),ZTE2隨著濃度的降低對(duì)胰脂肪酶抑制效果的降低程度最小,在低濃度下也能維持一定的抑制率。

圖15 ZTE1、ZTE2和ZTE3對(duì)胰脂肪酶的抑制作用Fig.15 Pancreatic lipase inhibitory activities ofZTE1,ZTE2 and ZTE3

從圖16中可看出兩種紫娟茶花色苷單體AN3和AN4在0.2～1.8 mg/mL的濃度范圍內(nèi)隨著濃度的增加對(duì)胰脂肪酶的抑制率有所增加,且AN3對(duì)胰脂肪酶的抑制效果明顯強(qiáng)于AN4。

圖16 AN3和AN4對(duì)胰脂肪酶的抑制作用Fig.16 Pancreatic lipase inhibitory activities of AN3 and AN4

EGCG對(duì)胰脂肪酶的抑制效果如圖17所示。由圖中可知,EGCG對(duì)胰脂肪酶的抑制效果與濃度存在接近線性的依存性,且其效果明顯強(qiáng)于紫娟茶純化花色苷單體AN3和AN4。

圖17 EGCG對(duì)胰脂肪酶的抑制作用Fig.17 Pancreatic lipase inhibitory activities of EGCG

紫娟茶提取物,包括ZTE1、ZTE2、ZTE3、AN3和AN4,以及EGCG對(duì)胰脂肪酶的IC50值如圖18所示。粗提物中,ZTE1對(duì)胰脂肪酶的抑制效果最強(qiáng),ZTE3、EGCG與其均無顯著性差異(p>0.05),ZTE2的效果最弱(p<0.05)。而純化的花色苷AN4對(duì)胰脂肪酶的IC50值(2.47±0.13)mg/mL明顯高于AN3和EGCG,是EGCG(0.55±0.02)mg/mL的約4.5倍。

圖18 ZTE1、ZTE2、ZTE3、AN3、AN4和EGCG對(duì)胰脂肪酶的半數(shù)抑制濃度Fig.18 Pancreatic lipase IC50 ofZTE1,ZTE2,ZTE3,AN3,AN4 and EGCG

ZTE1和ZTE3對(duì)胰脂肪酶的抑制效果略強(qiáng)于EGCG，符合Koo & Noh[16]所研究的綠茶提取物的降脂效果強(qiáng)于單一的EGCG這一結(jié)論。Ikeda等人[17]提出,沒食子酸酯型兒茶素更有益于膽固醇的吸收,紫娟茶粗提物ZTE1、ZTE2和ZTE3中酯型兒茶素含量的總和分別為(143.22±2.97)、(12.85±2.45)、(278.61±12.01) mg/g,可以為解釋ZTE1和ZTE3對(duì)胰脂肪酶的抑制效果提供一定的依據(jù)。

粗提物ZTE1對(duì)胰脂肪酶最強(qiáng)的抑制效果、含大量茶多酚的ZTE3和花色苷單體AN3對(duì)胰脂肪酶較強(qiáng)的抑制效果表明,紫娟茶中的茶多酚和花色苷對(duì)胰脂肪酶的抑制具有一定的協(xié)同作用,其減肥功效由多酚類化合物共同引起,且酯型兒茶素可能具有重大貢獻(xiàn)。

根據(jù)酶動(dòng)力學(xué)理論,以底物濃度的倒數(shù)為橫坐標(biāo),反應(yīng)速率的倒數(shù)為縱坐標(biāo)繪制雙倒數(shù)曲線圖(Lineweaver-Burk)。如圖19和圖20所示,紫娟茶提取物中的花色苷AN3和AN4對(duì)胰脂肪酶的抑制類型為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制,AN3和AN4對(duì)胰脂肪酶的抑制常數(shù)Ki分別為0.22、0.78 mg/mL。AN3的抑制常數(shù)Ki遠(yuǎn)小于AN4,即AN3對(duì)胰脂肪酶的親和力比AN4大,因此AN3對(duì)胰脂肪酶的親和力大于AN4可能是AN3的抑制作用強(qiáng)于AN4的原因之一。

圖19 AN3對(duì)胰脂肪酶的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線Fig.19 Lineweaver-Burk of AN3 on pancreatic lipase

圖20 AN4對(duì)胰脂肪酶的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線Fig.20 Lineweaver-Burk of AN4 on pancreatic lipase

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過考察ZTE1、ZTE2、ZTE3、AN3、AN4和EGCG對(duì)ACE酶、α-淀粉酶和胰脂肪酶的體外抑制作用,證實(shí)了長(zhǎng)期飲用紫娟茶可能具有潛在的降血壓、降血糖和減肥效果。AN3和AN4對(duì)三種酶的抑制作用均為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制,且均為AN3強(qiáng)于AN4,這可能與它在B環(huán)3′、4′、5′位上的三羥基結(jié)構(gòu)有關(guān)[18]。本研究對(duì)后期探索紫娟茶在體內(nèi)對(duì)代謝綜合癥的影響具有一定的借鑒作用,并對(duì)茶葉的功能性研究具有一定的意義。

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InhibitoryeffectsofZijuantea(Camelliasinensisvar.kitamura)extractsonangiotensinconvertingenzyme,α-amylaseandpancreaticlipaseinvitro

ZHAOYu,ZHOUJia-chun,ZHANGJing-wei,ZHANGWan-xin,ZHAOLi-ming*,JIANGLi-hua*

(State Key Laboratory of Bioreactor Engineering,R&D Center of Separation and Extraction Technology inFermentation Industry,East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China)

Objective:To explore whether the extracts of Zijuan tea has the potential to anti-hypertensive,anti-hyperglycemic and anti-obesity. Methods:The crude polyphenol fraction(defined as ZTE1)was extracted from Zijuan tea. ZTE1was then separated to the precipitated(defined as ZTE2)and the soluble(defined as ZTE3)with ethyl acetate. Subsequently,delphinidin-3-O-β-D-(6-(E)-p-coumaroyl)galactopyranoside(AN3)and cyanidin-3-O-β-D-(6-(E)-p-coumaroyl)galactopyranoside(AN4)were purified from ZTE2. The inhibitory activities of the three crude fractions and two anthocyanins towards angiotensin converting enzyme(ACE),α-amylase and pancreatic lipase were evaluated comparing with epigallocatechin gallate(EGCG). The inhibitory type of AN3and AN4towards ACE,α-amylase and pancreatic lipase was also explored. Results:All the Zijuan tea extracts had inhibitory activities towards the three enzymes. The inhibitory activities of ZTE3towards the three enzymes,ZTE1towardsα-amylase and pancreatic lipase,ZTE2towardsα-amylase were stronger than EGCG. Furthermore,ZTE3had the highest inhibitory acitivity against ACE,whereas ZTE2and ZTE1had the highest inhibitory acitivity againstα-amylase and pancreatic lipase,respectively. And the inhibitory activity of AN3towardsα-amylase was not significantly different to EGCG. The inhibitory activity of AN3was higher than AN4towards all the three enzymes. In addition,AN3and AN4were noncompetitive inhibitors of ACE,α-amylase and pancreatic lipase withKivalues of 0.33,0.37 mmol/L,0.39,0.41 mg/mL and 0.22,0.78 mg/mL. Conclusion:The extracts of Zijuan tea has the potential to anti-hypertensive,anti-hyperglycemic and anti-obesity.

Zijuan tea extracts;total phenols;anthocyanin;tea polyphenol;angiotensin converting enzyme;α-amylase;pancreatic lipase

TS201.2

A

1002-0306(2017)19-0012-10

10.13386/j.issn1002-0306.2017.19.003

2017-03-08

趙瑜(1989-)，女，碩士，研究方向：天然產(chǎn)物的分離提取和應(yīng)用,E-mail：rita_yu_zhao@163.com。

*通訊作者:趙黎明(1977-)，男，博士，教授，研究方向：食品加工技術(shù),E-mail:zhaoliming@ecust.edu.cn。

蔣麗華(1970-)，女，博士，副教授，研究方向：天然產(chǎn)物的分離提取和應(yīng)用,E-mail：lhjiang@ecust.edu.cn。