辣椒種質資源TMV抗性的鑒定與評價

秦 蕾 梁 燕默 寧 張 洋 趙貴葉

辣椒種質資源TMV抗性的鑒定與評價

秦 蕾 梁 燕*默 寧 張 洋 趙貴葉

（西北農林科技大學園藝學院，陜西楊凌 712100）

對來源于國家蔬菜種質資源中期庫的51份辣椒種質資源進行煙草花葉病毒（TMV）的田間抗性調查。結果顯示，各種質病情指數在17.04～75.56之間，有14份種質田間表現出了TMV抗性。各種質抗性分布基本符合正態(tài)分布，略向感病區(qū)域偏離。將篩選出的14份抗病材料和7份感病材料進行TMV苗期人工接種抗性鑒定，21份種質的病情指數在6.28～65.48之間，獲得抗病材料15份。相關分析結果表明，TMV田間成株自然發(fā)病病情指數與苗期人工接種鑒定病情指數的相關系數r=0.789，呈極顯著相關。結合田間抗性調查和人工接種抗性鑒定結果，利用12對與L基因連鎖的分子標記對13份TMV抗病種質進行分子鑒定，6份材料中共檢測到6個抗性分子標記。抗TMV辣椒種質的主要農藝性狀表現出一定的多樣性。

辣椒；種質資源；TMV抗性；鑒定

辣椒（Capsicum annuum L.）為茄科辣椒屬一年生或多年生植物，在全國20多個省、市、自治區(qū)都有栽培。病毒病一直是威脅辣椒生產的重要因秦蕾，女，博士研究生，主要從事辣椒TMV抗性基因挖掘與功能研究，E-mail：qinlei@nwsuaf.edu.cn

常引起辣椒葉片壞死、枯斑、褪綠，植株矮化，落花、落果，對辣椒生產造成嚴重損失。目前，世界各地鑒定出侵染辣椒的病毒有30余種，其中煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）是威脅辣椒生產的主要病毒。

TMV在世界范圍內普遍發(fā)生，尤其易感染煙草、番茄、辣椒等茄科作物。TMV主要通過植物種子和汁液摩擦傳毒，通過植物的維管組織，迅速侵染植株幼嫩組織，在葉片上產生淺綠或深綠色的病斑，影響植物的生長發(fā)育（程秉銓和彭湘儒，1994；Cheng et al.，2000；李明福 等，2012）。辣椒TMV抗性主要由L基因控制，L基因也是辣椒對煙草花葉病毒屬最有效的抗病基因之一（Lefebvre et al.，1995）。Tomita等（2011）通過圖位克隆獲得L3基因，并利用同源克隆的方法獲得了L的其他 6 個等位基因：L1、L1a、L1c、L2、L2b、L4，但是高效L基因主要存在于辣椒野生種當中。選育抗病品種是防治辣椒TMV最有效的措施之一。本試驗對51份辣椒種質進行田間TMV抗性調查及苗期抗性評價，并利用L基因的相關分子標記對辣椒種質進行TMV抗性基因鑒定，以期為辣椒抗性遺傳改良及抗病品種選育提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試辣椒種質來自國家蔬菜種質資源中期庫，選取51份經初步純化的種質作為供試材料，材料名稱和來源地詳見表1。TMV鑒定毒源TMV-U1株系由西北農林科技大學園藝學院番茄種質資源課題組提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 辣椒田間TMV抗性鑒定及農藝性狀調查試驗于2015～2016年在西北農林科技大學園藝學院蔬菜基地進行。1月播種，4月上旬定植。每份材料種植30株，隨機區(qū)組排列，株距35 cm，行距50 cm。定植30 d后，采集感病材料疑似發(fā)病葉片，液氮速凍，提取葉片總RNA，利用TMVCP特異引物（F：TCTTGTCATCAGCGTGGGC；R：AACAGTGCTGTGACTAGCGGGT）對田間疑似發(fā)病葉片進行PCR鑒定，確定辣椒田間病害為TMV。農藝性狀調查項目根據《辣椒種質資源描述規(guī)范和數據標準》進行（李錫香和張寶璽，2006），試驗數據取兩年數據的平均值。

表1 參試辣椒種質名稱及來源

1.2.2 TMV苗期人工接種抗性鑒定 從田間TMV調查結果進一步篩選21份辣椒種質進行苗期人工接種抗性鑒定，以七井燈開椒為感病對照。2016年7月15日將辣椒種子在55 ℃下溫湯浸種催芽，播種于10 cm×10 cm 的育苗缽中，放置于人工氣候箱培養(yǎng)。育苗期間控制白天溫度25 ℃，夜間溫度 23 ℃。

辣椒幼苗4葉期進行人工摩擦接種，每個材料3次重復，每重復15株。TMV-U1株系接種20 d后采摘TMV發(fā)病葉片，加入10倍于鮮葉質量的0.01 mol·L-1磷酸緩沖液（PBS，pH=7.0）中，搗碎后用雙層紗布過濾，濾液立即用于接種。接種后，將幼苗置于20～28 ℃光照培養(yǎng)箱中誘發(fā)病害。接種5 d后調查局部癥狀，20 d后調查系統(tǒng)癥狀，記錄病株數及病級。計算病情指數，進行抗性分類。TMV抗性調查的病情指數計算及抗性級別的劃分均依據《辣椒種質資源描述規(guī)范和數據標準》（李錫香和張寶璽，2006）。

病情指數（DI）=Σ（病級數值×該病級株數）/（病級最高值×調查總株數）×100

1.2.3 TMV抗性的分子標記鑒定 利用已報道的12對與L基因連鎖的分子標記（表2）對TMV抗病種質進行分子鑒定。采用CTAB法提取植物基因組DNA，采用1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計測定DNA的質量和濃度，并將濃度稀釋至100 ng·μL-1，于-20 ℃冰箱內保存?zhèn)溆茫⊿un et al.，2012）。PCR 反應體系為 20 μL：PCR-mix（2×Es Taq MasterMix）10 μL，模板 DNA 1.0 μL，引物（10 μmol·L-1）0.8 μL，ddH2O 補 齊 至 20μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 min，52 ℃退火40 s，72 ℃延伸2 min，共進行35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

表2 試驗所用引物

1.2.4 相關性分析 利用SPSS軟件對試驗數據進行Pearson相關性分析及構建回歸方程。利用ORIGIN軟件進行次數分布圖的繪制。

圖1 辣椒植株的TMV鑒定結果

2 結果與分析

2.1 辣椒種質TMV抗性的田間鑒定結果

經TMV-CP特異性引物擴增，田間發(fā)病植株感染了TMV（圖1）。田間成株自然發(fā)病抗病性調查結果顯示（表3），供試51份材料病情指數為17.04～75.56。其中抗病材料3份，占5.88%，這3份材料的葉片僅有輕微的花葉或無癥狀；中抗材料11份，占21.57%，表現為植株少部分葉片呈現花葉，部分植株心葉微皺；感病材料31份，占60.78%，植株多數葉片花葉，心葉皺縮；高感材料6份，占11.76%，葉片表現為嚴重花葉和心葉畸形、皺縮，植株矮化；根據材料抗性分級，51份辣椒種質抗性分級符合正態(tài)分布，峰值向感病材料偏離（圖 2）。

表3 辣椒種質TMV抗性田間鑒定結果

表4 辣椒種質TMV抗性人工接種鑒定結果

圖2 辣椒種質對TMV抗性級別的次數分布

2.2 辣椒種質TMV抗性的人工接種鑒定

根據田間TMV抗性調查結果（表3），共篩選出抗病辣椒種質14份，另選5份感病材料、2份高感材料，進行苗期人工接種抗性鑒定。結果顯示（表4），參試材料的病情指數分布在6.28～65.48之間。其中高抗材料2份、抗病材料7份、中抗材料6份、感病材料6份。對TMV田間鑒定病情指數與苗期人工接種鑒定病情指數進行抗病性相關分析，結果表明，二者的相關系數r=0.789，達到極顯著水平，說明苗期抗性鑒定可以反映該種質的田間成株抗性水平。以各種質苗期鑒定病情指數為X，以田間成株自然發(fā)病病情指數為y，回歸方程為y=19.176+0.575X。依據該回歸方程可以預測各種質田間自然發(fā)病的病情指數（表4）。

2.3 辣椒種質TMV抗性的分子標記鑒定

利用12對已報道的辣椒TMV抗性基因相關的分子標記對16份材料進行鑒定，包括田間及人工接種鑒定篩選出的13份抗病種質CA05、CA06、CA08、CA12、CA14、CA20、CA21、CA34、CA43、CA75、CA79、CA80、CA165和3份感病種質CA18、CA42、CA56。結果表明（圖3），CA06具有3、6、12號抗病分子標記；CA14具有12號抗病分子標記；CA34具有4號抗病分子標記；CA79具有1、3、4號抗病分子標記；CA80具有3、4、9號抗病分子標記；CA165具有4號抗病分子標記。其余7份種質在以上12對分子標記中未表現抗性；參試的16份種質均不含有2、5、7、8、10、11號分子標記（圖3）。

2.4 抗TMV辣椒種質的主要農藝性狀

基于田間抗性調查和苗期人工接種鑒定結果，從51份供試辣椒材料中篩選獲得抗病材料13份，其中3份來自四川、2份來自云南，陜西、江蘇、湖北、河南、湖南、安徽、山東、廣東各1份，主要集中在我國中、西部地區(qū)?？筎MV辣椒種質的主要農藝性狀表現出一定的多樣性（表5），始花節(jié)位為第8～18節(jié)；果形包括線形2份、羊角形4份、錐形1份、牛角形3份、指形3份；單果質量最小為2.60 g，最大為30.80 g；株型主要為半直立，2份直立，無開展株型；7份材料分枝性中等，2份分枝性強，4份分枝性弱，抗病種質較感病材料株型緊湊。

圖3 辣椒種質TMV抗性分子標記篩選結果

表5 抗TMV辣椒種質資源的主要農藝性狀

3 結論與討論

本試驗通過田間抗性調查和苗期人工接種抗性鑒定，在51份辣椒種質中篩選出TMV抗病種質13份，這些抗病資源可以為今后的TMV抗性品種選育提供種質基礎。黃啟中等（2004）對280份辣椒種質進行了TMV和黃瓜花葉病毒（CMV）的田間調查和人工抗病性鑒定，獲得3份抗原材料；王述彬等（2001）從154份辣椒種質資源中鑒定出5份抗TMV材料、11份抗CMV材料。吳躍勇和崔德祥（2007）對貴州地區(qū)的辣椒種質進行了TMV抗性鑒定，鑒定出的抗病材料僅占測試材料的7.6%；王飛等（2010）在74份泰國辣椒種質中篩選出7份TMV抗性材料；姚明華等（2012）在引進的42份非洲辣椒材料中篩選出9份TMV抗性材料。以往研究篩選到的抗原材料相對較少，所包含的抗病基因也不明確。本試驗對51份辣椒種質進行田間抗性鑒定，結果表明，TMV的抗性分級向感病偏移，人工接種鑒定到的抗病材料也大多表現為抗病及中抗，無免疫材料。目前，辣椒TMV抗性基因L已被克隆，本試驗利用已報道的12對與L基因連鎖的分子標記對13份抗病種質進行評價，結果有6份種質含有抗病分子標記，但是，這12對分子標記均無法有效區(qū)分抗病材料與感病材料，這種現象可能是由于12對分子標記來源于L基因的不同等位基因，導致不同抗病材料的分子標記結果不同，而未篩選出標記的抗病材料可能含有其他TMV抗性相關基因，其抗病機制有待進一步研 究（Kim et al.，2008；Tomita et al.，2008；Yang et al.，2009；?zkaynak et al.，2014）。

辣椒TMV抗性與農藝性狀的相關性分析結果顯示，辣椒TMV抗性與其他農藝性狀之間并不存在顯著的相關性（數據未列出）。本試驗中，13份抗病辣椒材料株型主要為半直立，2份直立，無開展株型；7份材料分枝性中等，2份分枝性強，抗病材料較感病材料株型緊湊。此外，抗病材料始花節(jié)位大多高于11，高于感病材料，即花期較晚的材料中，抗病性強的比率較高。耿廣東等（2009a，2009b）研究表明，植株性狀（側芽個數、株高、葉片縱橫比、莖粗）、果實性狀（果皮厚度、單果質量）與辣椒白粉病抗性相關。鄒學校等（2004）利用灰色關聯方法分析了40份湖南地方辣椒品種和12個雜交組合，結果表明辣椒TMV抗性與始花節(jié)位、株高、開展度、分枝數等植株性狀的關系較近。本試驗也發(fā)現辣椒對TMV的抗性強于甜椒，但是抗性是否與辣椒素含量相關還有待進一步研究。除了進行苗期人工接種鑒定外，開發(fā)有效的分子標記對于辣椒TMV抗性材料的篩選具有重要意義。目前辣椒TMV抗性相關分子標記主要來自L基因，未來的工作需要挖掘鑒定其他TMV抗性基因，開發(fā)來源更廣泛的分子標記用于辣椒TMV種質的篩選。

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Abstract：Fifty-one pepper（Capsicum annuum L.）local varieties were selected as experimental material for identifying their resistance to TMV in fields. The result showed that 14 collections were resistant to TMV and the disease index of each collection was 17.04-75.56. The resistance distribution of various varieties was normal with a little deviation from the disease infectious area. Resistance identification in TMV seedling stage by artificial inoculation was carried out on these 14 disease resistant material and 7 susceptible material. The disease indexes of 21 varieties were 6.28-65.48，and 15 of them were disease resistant. The results of correlation analysis indicated that the correlation coefficient between TMV field plant natural disease occurrance index and artificial inoculation identification disease index was r=0.789，a significant positive correlation. Twelve molecular markers from TMV resistant gene L were used to identify the 13 selected pepper germplasm resources. Six resistant molecular markers were detected from 6 TMV resistant germplasm resources. The major agronomic traits of TMV resistant pepper germplasm resources showed certain diversity.

Key words：Pepper；Germplasm resources；TMV resistance；Identification

Identif i cation and Evaluation of Resistance to TMV in Pepper（Capsicum annuum L.）Germplasm Resources

QIN Lei，LIANG Yan*，MO Ning，ZHANG Yang，ZHAO Gui-ye
（College of Horticulture，Northwest A&F University，Yangling 712100，Shaanxi，China）

*通訊作者（Corresponding author）：梁燕，教授，博士生導師，主要從事番茄遺傳育種及蔬菜種質資源研究，E-mail：liangyan@nwsuaf.edu.cn

2017-03-13；接受日期：2017-08-14

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2013BAD01B04-14）