多環(huán)芳烴降解菌的分離、鑒定及馴化研究

李榮峰+趙碧川+陳麗君+王愛芳

摘 要：該研究從百色大王嶺原始森林生態(tài)環(huán)境的土壤和水中采樣，進(jìn)行了多環(huán)芳烴降解菌的分離、鑒定及馴化分析。結(jié)果表明，試驗分離篩選出了能夠降解多環(huán)芳烴——萘的A、B 2種微生物菌種，其中，菌種A菌落形態(tài)為光滑，乳白色，邊緣整齊，呈乳狀微粘性菌落，顯微鏡下觀察為桿狀；菌種B菌落形態(tài)為發(fā)散毛狀，白色，顯微鏡下觀察為絲狀。并對篩選出的A、B2個菌種進(jìn)行了生理生化鑒定和優(yōu)化馴化試驗，最適生長代謝環(huán)境條件為：最適溫度25～28℃，最適轉(zhuǎn)速120～150r/min，最適多環(huán)芳烴萘的濃度為300～320mL/L，最適pH值6.0～7.0，最適降解菌接種量10～15mL/100mL無機(jī)鹽培養(yǎng)液，培養(yǎng)液體系中加入一定量的檸檬酸可提高降解速率。

關(guān)鍵詞：多環(huán)芳烴；降解菌；分離；鑒定

中圖分類號 X132 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2017）18-0013-04

Isolation and Identification of PAHs Degrading Bacteria

Li Rongfeng et al.

（College of Agriculture and Food Engineering，Baise College，Baise 533000，China）

Abstract：Isolation，identify and domestication about bacteria of degrading PAHs from the soil andwater sampling in Bise Dawangling virgin forest ecological environment had been studied.The results had separated A，B two microbial strains of degrading PAHs—naphthalene.And screened A，B two specieswere identified on physiological and biochemical and optimized on condition tests.The results showed that the optimum environmental conditions for growth and metabolism is the optimum temperature of 25 ～ 28 ℃，the optimum speed of 120 ～ 150 r/min，the optimum concentration on PAHs naphthalene of 300 ～ 320mL/L，optimum pH value of 6.0 to 7.0，the optimal degrading bacteria inoculation of 10 ～ 15mL/100mL mineral medium.Broth system by adding a certain amount of citric acid can increase the rate of degradation of PAHs.

Key words：PAHs；Bacteria of Degrading PAHs；Separation；Identify

多環(huán)芳烴（Polycyclic aromatic hydrocarbons，簡稱PAHs）是一類廣泛分布于海洋環(huán)境中的含有2個或2個以上苯環(huán)，以線狀、角狀或簇狀排列的稠環(huán)型有機(jī)污染化合物[1]。隨著苯環(huán)數(shù)量的增加，其在環(huán)境中存在的時間越長，遺傳毒性越高，現(xiàn)已成為全球重要的污染物之一，也是美國環(huán)保局制定的129種優(yōu)先污染物中的一類[2]。環(huán)境中的PAHs存在于各種土壤、污水中，是一類難于降解的有機(jī)污染物，在適宜的情況下可能遷移到其他環(huán)境介質(zhì)中，擴(kuò)大污染源。隨著現(xiàn)代化工業(yè)的發(fā)展，工廠廢水排放系統(tǒng)的不完善，大量的烴類物質(zhì)涌入江河湖海，嚴(yán)重威脅自然界的動植物以及人類的健康。如何治理及修復(fù)多環(huán)芳烴對環(huán)境造成的污染，已成為世界各國環(huán)境科學(xué)家研究的熱點?，F(xiàn)今，治理多環(huán)芳烴污染主要有物理、化學(xué)和生物幾種方法，而普通的物理和化學(xué)修復(fù)污染存在各種問題，操作不當(dāng)還會造成二次污染，而利用生物技術(shù)方法不僅可以消除烴類污染、凈化環(huán)境，而且投資少，耗能小，具有廣泛的經(jīng)濟(jì)價值，對人類社會來說也是利大于弊。目前，生物修復(fù)中土壤PAHs污染物生物治理的相關(guān)研究有較多報道[3～5]。土壤中有多種微生物可以利用PAHs作為碳源和能源或利用其他的物質(zhì)作為共代謝底物進(jìn)行多環(huán)芳烴的降解、礦化[6]。因此，篩選分離降解多環(huán)芳烴的優(yōu)勢菌種對于開展多環(huán)芳烴污染生態(tài)系統(tǒng)修復(fù)方面的研究工作具有非常重要的現(xiàn)實意義。

廣西百色市自然保護(hù)區(qū)大王嶺原始森林近年來作為主要以漂流著稱的重要旅游勝地，每年都有大量的游客前往，而森林中存在一定的污染物質(zhì)，特別是多環(huán)芳烴物污染逐漸嚴(yán)重，因此，研究原始森林中多環(huán)芳烴有機(jī)污染物的微生物降解顯得尤為重要。本文針對大王嶺原始森林的水質(zhì)和土質(zhì)進(jìn)行微生物檢測，篩選出能夠降解多環(huán)芳烴——萘的菌類，并對其進(jìn)行微生物形態(tài)學(xué)觀察和生理生化鑒定，能了解森林存在的降解菌類型和分布情況，以期為多環(huán)芳烴污染的生物修復(fù)和治理提供有力支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品采集 從百色大王嶺原始森林的土壤（未受污染區(qū)、受污染區(qū)的樣品）、水體（未受污染區(qū)、受污染區(qū)的樣品），分別采集到樣品4份，編號，冰箱保存待用。

1.1.2 培養(yǎng)基配制 （1）無機(jī)鹽培養(yǎng)基：（NH4）2SO4 1g，K2HPO4 2g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.1g，F(xiàn)eCl3 0.5g，CaCl2 0.5g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL。（2）萘-無機(jī)鹽培養(yǎng)基：萘丙酮濃度分別為200，250，280，300，320，350mL/L萘丙酮，液體培養(yǎng)基富集菌種時每200mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基液加入10mL萘丙酮溶液，固體篩選培養(yǎng)基則在使用之前于固體培養(yǎng)基上滴萘丙酮溶液。

1.1.3 主要儀器和試劑 （1）主要儀器：全溫振蕩器（JBQ-2D，常州普天儀器制造有限公司），人工氣候培養(yǎng)箱（LRH-300-GST，廣州滬瑞明儀器有限公司），超凈工作臺（SW-CJ-2FD，蘇凈集團(tuán)安泰公司），高壓蒸汽滅菌鍋（YXQ-LS-50S11，上海博迅實業(yè)有限公司），電子分析天平（FA2004，上海舜宇恒平科技儀器有限公司），數(shù)字式精密pH計（PHS-3C，上海精密科學(xué)儀器有限公司），雙目生物顯微鏡（B204LEDR，上海比目儀器有限公司），冷凍高速離心機(jī)（TGL-16M，湖南湘儀）。（2）主要藥品：萘，丙酮，葡萄糖，菲，檸檬酸，鄰苯二甲酸，聯(lián)苯，醋酸鈉，α-萘酚，醋酸鉛，二氯乙烷，無水硫酸鈉，十二烷基苯磺酸鈉，十二烷基硫酸鈉。所有藥品均為AR，分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 多環(huán)芳烴降解菌的富集培養(yǎng) 分離降解多環(huán)芳烴微生物采用單層平板劃線分離法[7]。在無菌操作條件下，將采集到的10g土樣和10mL水樣分別加入200mL萘-無機(jī)鹽培養(yǎng)液中（土樣中加數(shù)粒玻璃珠將大塊顆粒打碎），150r/min條件下震蕩培養(yǎng)，7d后按體積比10%的接種量接種到新的培養(yǎng)基中，反復(fù)繼代培養(yǎng)5次，以富集微生物生長菌。

1.2.2 多環(huán)芳烴降解菌的分離篩選 利用萘為唯一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基進(jìn)行微生物培養(yǎng)，使能利用萘的微生物存活下來，而其他微生物死亡的原理，從樣品中分離篩選出多環(huán)芳烴降解菌。將富集培養(yǎng)后的培養(yǎng)液用稀釋涂布法在萘-無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行分離，并進(jìn)一步反復(fù)劃線分離在此培養(yǎng)基上生長出來的菌種。對能在萘-無機(jī)鹽培養(yǎng)基上生長的微生物菌種進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，包括菌落、菌苔、生活習(xí)性、生長速度、對環(huán)境的適應(yīng)能力等，篩選出長勢較好的微生物菌種，此菌種即為多環(huán)芳烴降解菌。

1.2.3 多環(huán)芳烴降解菌的生理生化鑒定 對分離篩選出的菌種進(jìn)行生理生化實驗鑒定。鑒定方法包括革蘭氏染色、芽孢染色、莢膜染色、甲基紅試驗、乙酞甲基醇試驗、葡萄糖發(fā)酵試驗、過氧化氫酶試驗和檸檬酸鹽試驗等。

1.2.4 多環(huán)芳烴降解條件的優(yōu)化馴化

1.2.4.1 溫度對多環(huán)芳烴降解的影響 溫度是影響微生物生長代謝的重要因素，不同的溫度使微生物產(chǎn)生不同的生理生化反應(yīng)。分別移取10mL篩選出的2個菌種菌懸液至萘無機(jī)鹽固體平板上，進(jìn)行涂布無菌接種，置于分別設(shè)置為20℃、25℃、28℃、30℃、35℃和40℃6組培養(yǎng)溫度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，除溫度外其他培養(yǎng)條件相同，每組溫度每種菌種接種3個培養(yǎng)皿，經(jīng)培養(yǎng)7d后，觀察所有培養(yǎng)皿中接種菌種的生長情況。

1.2.4.2 轉(zhuǎn)速對多環(huán)芳烴降解的影響 實驗中多環(huán)芳烴降解體系為液相，在降解過程中振蕩培養(yǎng)能加速降解菌對多環(huán)芳烴的降解過程，不同的轉(zhuǎn)速下降解效果不同 [8]。分別移取10mL篩選出的2個菌種菌懸液至裝有100mL萘無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，置于分別設(shè)置轉(zhuǎn)速為60、90、120、150、180、210r/min的搖床上進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，除轉(zhuǎn)速外其他培養(yǎng)條件相同，培養(yǎng)7d后劃線接種于萘無機(jī)鹽固體平板上，培養(yǎng)5d，觀察降解菌的生長狀況。

1.2.4.3 多環(huán)芳烴濃度對降解的影響 多環(huán)芳烴萘作為降解物，為降解菌提供碳源，其濃度的大小對降解菌的生長代謝有著很大的影響。設(shè)置萘丙酮的濃度分別為200、250、280、300、320、350mL/L，分別移取10mL篩選出的2個菌種菌懸液至裝有100mL不同濃度萘無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，搖床振蕩培養(yǎng)7d后劃線接種于萘無機(jī)鹽培養(yǎng)基固體平板上，28℃培養(yǎng)5d，觀察降解菌的生長情況。

1.2.4.4 pH值對多環(huán)芳烴降解的影響 設(shè)置萘無機(jī)鹽培養(yǎng)液的pH值分別為5.0，6.0，7.0，7.5，8.0，9.0其6組梯度，分別移取10mL篩選出的2個菌種菌懸液至裝有100mL不同pH值萘無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，搖床振蕩培養(yǎng)7d后劃線接種于萘無機(jī)鹽培養(yǎng)基固體平板上，28℃培養(yǎng)5d，觀察降解菌的生長情況。

1.2.4.5 降解菌接種量對多環(huán)芳烴降解的影響 接種量的多少也會影響到整個降解體系的降解效率。移取接種量分別為5mL、10mL、15mL、20mL、25mL、30mL篩選出的2個菌種菌懸液至裝有100mL相同萘無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，搖床振蕩培養(yǎng)7d后劃線接種于萘無機(jī)鹽培養(yǎng)基固體平板上，28℃培養(yǎng)5d，觀察降解菌的生長情況。

1.2.4.6 多環(huán)芳烴與有機(jī)物的共代謝 分別將濃度為5g/L的葡萄糖、檸檬酸、蔗糖、酵母膏、醋酸鈉20mL加入100mL萘無機(jī)鹽培養(yǎng)液中，分別移取10mL篩選出的2個菌種菌懸液至裝有100mL加有不同有機(jī)物的萘無機(jī)鹽培養(yǎng)液的250mL三角瓶中，搖床振蕩培養(yǎng)7d后劃線接種于萘無機(jī)鹽培養(yǎng)基固體平板上，28℃培養(yǎng)5d，觀察降解菌的生長情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 多環(huán)芳烴降解菌的分離和篩選 通過對生活習(xí)性、生長速度、環(huán)境的適應(yīng)能力等形態(tài)學(xué)方面觀察，最終篩選得到2種多環(huán)芳烴降解菌種。2種菌種如圖1所示，其中一種為絲狀，命名為菌種A，另一種為桿狀，命名為菌種B。從圖1可以看出，A菌菌落形態(tài)為光滑，乳白色，邊緣整齊，呈乳狀微粘性菌落，顯微鏡下觀察為桿狀；B菌菌落形態(tài)為發(fā)散毛狀，白色，顯微鏡下觀察為絲狀。另外，實驗中為保持降解菌的降解萘的特性，平板培養(yǎng)均采用萘-無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，在此過程中，A菌種的長勢保持不變，生長良好，而B菌種在接種了多次之后出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，不能在萘-無機(jī)鹽培養(yǎng)基上長久存活，由此可判斷，A菌屬于較強(qiáng)的多環(huán)芳烴降解菌，出現(xiàn)這種實驗現(xiàn)象的原因可能與其生存的環(huán)境中多環(huán)芳烴的濃度較大有關(guān)，而B菌種可能是新變種，降解多環(huán)芳烴的能力還未成熟，需要有機(jī)碳源提供營養(yǎng)，才足以存活。由此可見，A菌株更適合作為環(huán)境污染治理的研究材料，其穩(wěn)定的降解多環(huán)芳烴的特性具有很大的潛在價值。

圖1 菌落形態(tài)特征

2.2 多環(huán)芳烴降解菌的生理生化鑒定 對微生物進(jìn)行生理生化鑒定是認(rèn)識了解微生物的途徑之一，能更多的了解其特性，也是各種研究的參考依據(jù)之一。試驗分別對分離篩選到的A、B2個多環(huán)芳烴降解菌種進(jìn)行了生理生化鑒定實驗，其鑒定結(jié)果見表2。從表2可看出，A、B 2個菌種進(jìn)行革蘭氏染色后，染色結(jié)果均為陽性，進(jìn)行芽孢染色、莢膜染色及葡萄糖發(fā)酵試驗，染色及試驗結(jié)果2個菌種均為陰性，而甲基紅試驗、乙酞甲基醇試驗、過氧化氫酶試驗以及檸檬酸鹽試驗，A、B2個菌種表現(xiàn)出不同的試驗結(jié)果，在甲基紅試驗、乙酞甲基醇試驗以及檸檬酸鹽試驗中，菌種A表現(xiàn)為試驗結(jié)果陽性，菌種B表現(xiàn)為試驗結(jié)果陰性；在過氧化氫酶試驗中菌種B表現(xiàn)為試驗結(jié)果陽性，菌種A表現(xiàn)為試驗結(jié)果陰性。這些結(jié)果說明A、B2個菌種都不能生長于葡萄糖蛋白胨水溶液中，不能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，即不能利用葡萄糖作為碳源。而菌種B能分解過氧化氫產(chǎn)生氣體，菌種A能利用檸檬酸鹽作為營養(yǎng)碳源，能在此培養(yǎng)基中很好的生長。

表1 生理生化鑒定結(jié)果

[實驗結(jié)果 A菌種 B菌種 革蘭氏染色 + + 芽孢染色 - - 莢膜染色 - - 甲基紅試驗 + - 乙酞甲基醇試驗 + - 葡萄糖發(fā)酵試驗 - - 過氧化氫酶試驗 - + 檸檬酸鹽試驗 + - ]

注：表中“+”表示結(jié)果≥90%屬于陽性，“-”表示結(jié)果≥90%屬于陰性。

2.3 多環(huán)芳烴降解條件的優(yōu)化馴化 為了加深對多環(huán)芳烴降解菌的降解能力的了解，實驗從溫度、轉(zhuǎn)速、多環(huán)芳烴萘的濃度、pH值、菌種接種量、多環(huán)芳烴與有機(jī)質(zhì)的共代謝6個方面分別對萘降解菌進(jìn)行優(yōu)化條件實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)25℃和28℃條件下降解菌的長勢最好，15℃，30℃，34℃，39℃溫度下長勢較差；在轉(zhuǎn)速為120～150r/min的條件下生長狀況最好，其他轉(zhuǎn)速下的生長狀況一般。300～320mL/L的萘濃度下降解菌的長勢最好，其余濃度下的長勢較差；接種量為10mL和15mL的實驗組降解菌的長勢較好，其他實驗組長勢較差。而在多環(huán)芳烴與有機(jī)質(zhì)的共代謝中，加入檸檬酸的實驗組長勢最好，其中加入葡萄糖的實驗組中出現(xiàn)了雜菌污染，其他實驗組長勢一般。

3 討論與結(jié)論

多環(huán)芳烴降解菌作為微生物治理的研究對象之一，有待深入的問題還有很多，比如生物表面活性劑產(chǎn)生的機(jī)理及其在實際處理中的應(yīng)用[9]，研究分子水平上降解菌的降解機(jī)制，與其他生物的共代謝降解機(jī)制，如何應(yīng)用于實際等。針對百色大王嶺原始森林而言，地方特色治理是環(huán)境治理的途徑之一，如何結(jié)合本地生態(tài)特征與微生物治理相結(jié)合形成治理方案，是最需要深入探討研究的問題。Geiselbrecht研究表明，許多細(xì)菌和真菌都具有降解多環(huán)芳烴的能力，一般來說，被污染的環(huán)境中多環(huán)芳烴降解菌的數(shù)量比未污染環(huán)境中多，且降解多環(huán)芳烴的能力也遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于未受污染區(qū)域[10]。在本試驗樣品的采集中，針對原始森林生態(tài)特點，分別采集了污染較小和污染較嚴(yán)重的兩種土壤，以及污染較小和污染較大的2種水樣，對4種樣品進(jìn)行降解菌的篩選分離，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4種樣品中均出現(xiàn)降解菌，說明四個環(huán)境中均或多或少的受到了多環(huán)芳烴有機(jī)污染物的污染，這與Geiselbrecht研究結(jié)果相一致。其次，在分離之前，對降解菌的富集馴化培養(yǎng)可提高分離的成功率[11]，在富集的過程中，由于富集培養(yǎng)基中的碳源物質(zhì)只有萘，故導(dǎo)致培養(yǎng)過程中不能利用萘的微生物死亡，能利用萘的微生物存活下來，并經(jīng)過多次富集使其數(shù)量增多，降解萘的能力提高，實驗中采用不同培養(yǎng)液用量震蕩培養(yǎng)的方法，用比較法篩選分離出長勢最佳的菌種。本實驗表明多環(huán)芳烴降解菌能夠在萘-無機(jī)鹽培養(yǎng)基中生存并降解萘，說明分離到的A、B2類菌種對環(huán)境的修復(fù)具有很高的潛在價值，將為多環(huán)芳烴污染的生物修復(fù)和治理提供有力支持。

另外，對萘降解菌進(jìn)行條件優(yōu)化馴化實驗可以深入把握降解菌的降解性能[12]，本實驗根據(jù)篩選出的不同菌種分別對4種環(huán)境下的降解條件進(jìn)行了分類研究，分別從溫度、轉(zhuǎn)速、多環(huán)芳烴萘的濃度、pH值、降解菌的接種量、多環(huán)芳烴與有機(jī)質(zhì)的共代謝等6個方面進(jìn)行了條件優(yōu)化篩選，從各條件下篩選出長勢最好的降解菌，則該條件即為最適生長條件。綜合以上所有優(yōu)化實驗，從百色大王嶺原始森林自然保護(hù)區(qū)中分離篩選出的的多環(huán)芳烴萘降解菌經(jīng)過條件優(yōu)化培養(yǎng)后，得出最適生長代謝環(huán)境條件參數(shù)，綜合為：最適溫度范圍為25～28℃，最適轉(zhuǎn)速范圍為120～150r/min，最適多環(huán)芳烴萘的濃度為300～320mL/L，最適pH值范圍為6.0～7.0，最適降解菌接種量為10～15mL/100mL萘無機(jī)鹽培養(yǎng)液。周樂等[13]在馴化培養(yǎng)基中添加另外一種氮源和碳源——酵母膏，以增加降解菌的數(shù)量和降解效果。Grosser等[14]在含芘無機(jī)鹽培養(yǎng)基中添加微量的酵母膏、蛋白胨和可溶性淀粉來馴化培養(yǎng)和保存多環(huán)芳烴降解菌。本實驗中主要對葡萄糖、檸檬酸、蔗糖、酵母膏、醋酸鈉這幾種有機(jī)物進(jìn)行多環(huán)芳烴共代謝研究，結(jié)果表明體系中加入一定量的檸檬酸可以使降解菌A的降解速率提高。

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