不同栽培年限亳芍多糖與微量元素動態(tài)積累規(guī)律研究

姚厚軍， 陳乃東,3， 陳乃富， 郭 旭， 劉路靜, 司華陽

(1. 皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院， 六安 237012; 2. 皖西中藥與天然藥物工程技術(shù)研究中心， 六安 237012;3. 安徽醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院， 合肥 230032； 4. 中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)士官學(xué)校，石家莊050081)

不同栽培年限亳芍多糖與微量元素動態(tài)積累規(guī)律研究

姚厚軍1,2， 陳乃東1,2,3， 陳乃富1,2， 郭 旭4， 劉路靜1, 司華陽1

(1. 皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院， 六安 237012; 2. 皖西中藥與天然藥物工程技術(shù)研究中心， 六安 237012;3. 安徽醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院， 合肥 230032； 4. 中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)士官學(xué)校，石家莊050081)

對采自安徽亳州地區(qū)人工栽培1～7年亳芍樣品，水提醇沉法提取多糖，蒽酮-硫酸法和原子吸收光譜法(FAAS)分別測定樣品中多糖及微量元素含量，探討多糖、微量元素在亳芍中的動態(tài)積累規(guī)律，為亳芍采收、品質(zhì)評價與規(guī)范化栽培提供依據(jù)。結(jié)果表明，栽培年限對亳芍多糖和微量元素的積累有顯著影響: 株齡1～7年的亳芍，多糖的含量分別為(2.06±0.12)%、(3.59±0.17)%、(4.66±0.26)%、(3.14±0.19)%、(2.44±0.03)%、(2.49±0.12)%和(2.32±0.20)%；株齡1～7年的亳芍銅元素、鉛元素、鉻元素、鎂元素、鈣元素、鈉元素、鋅元素和鋇元素的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為(3.28±0.63)、(3.16±0.63)、(1.69±0.09)、(300.17±13.64)、(1476.66±57.49)、(71.88±2.26)、(8.58±0.56)和(369.51±26.68) mg/kg (DW)；3種有害微量元素含量未超過5.0 mg/kg (DW)限量指標(biāo)，均在規(guī)定限度范圍內(nèi)。上述結(jié)果顯示，株齡3年亳芍多糖含量最高，亳芍中含豐富的人體必需微量元素，重金屬限量指標(biāo)整體上是安全的，微量元素的含量與多糖的含量存在相關(guān)性。

亳芍；多糖；微量元素；規(guī)范化栽培

AbstractThe contents of the total polysaccharide and the 8 trace elements of 1-7 years-old Bozhou Peony were detected by anthracenone-concentrated-sulfuric-acid colorimetry and AAS, respectively, to explore the dynamic accumulation of polysaccharides and 8 trace elements in Bozhou PeonyPaeonialactiflora, and to provide scientific basis for the optimum harvesting age, quality evaluation and standardized cultivation of Bozhou Peony. The results indicated that cultivating ages would significantly impact the accumulation of polysaccharide and trace elements. The average contents of polysaccharides of Bozhou Peony (from 1 to 7 years) were:(2.06±0.12)%, (3.59±0.17)%, (4.66±0.26)%, (3.14±0.19)%, (2.44±0.03)%, (2.49±0.12)% and (2.94±0.20)%; the mass fractions of Cu, Pb, Cr ,Mg, Ca, Na, Zn and Ba were (4.14±0.39), (5.02±0.87), (1.69±0.07), (300.17±13.64), (1476.66±57.49), (71.88±2.26), (8.58±0.56) and (369.51±26.68) mg/kg(DW), respectively, and all the mental elements were in limits except Pd content in the samples exceeded the standard limit 0.89 mg kg(DW). Our experimental suggested that the Bozhou Peony cultivated for 3 years obtained the highest polysaccharide. There were rich essential mental elements in Bozhou Peony and the contents of heavy mental elements were lower than the limited. There might exist correlation between the trace elements contents and the accumulation of polysaccharide in Bozhou Peony.

KeywordsBozhou PeonyPaeonialactiflora; polysaccharides; trace element; standardized cultivation

亳芍(Bozhou PeonyPaeonialactiflora)，即亳州白芍，是芍藥科植物芍藥(Paeonialactiflora)的根，作為安徽道地藥材之一，主產(chǎn)安徽省亳州地區(qū)。具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗氧化、抗驚厥、護(hù)肝等作用，對胃腸道疾病和心血管疾病也有一定的療效[1]。

截至目前，有關(guān)亳芍的化學(xué)成分，主要依據(jù)白芍的化學(xué)成分推論而來。作為安徽道地藥材之一，尚未見對亳芍化學(xué)成分的系統(tǒng)研究報道。本課題組在前期研究中，發(fā)現(xiàn)并首次報道亳芍中存在微量生物堿類物質(zhì)[2]，作為亳芍化學(xué)成分系統(tǒng)研究工作之一，本文擬對不同生長年限亳芍的多糖及微量元素含量變化規(guī)律進(jìn)行研究，為探討中藥亳芍的最佳藥材采收時期、質(zhì)量評價及規(guī)范化種植提供依據(jù)。

1 儀器和試劑

1.1 儀器

AA-6800型原子吸收光譜儀(日本島津公司)；L2433型銅、鉛、鉻、鎂、鈣、鈉、鋅、鋇空心陰極燈(日本島津公司)；YGH-500S/BS型遠(yuǎn)紅外快速恒溫干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)；DK-8D型數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市杰瑞爾電器有限公司)；RE-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海洪旋實驗儀器有限公司)；XB-120A型電子分析天平(瑞士普利賽斯公司)；雙光束紫外分光光度計(TU-1901型，北京普析通用儀器有限公司)。

1.2 試劑

無水乙醇、氯仿、濃硫酸、濃鹽酸、α-萘酚、標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖、蒽酮、丙酮、正丁醇和氫氧化鈉等。以上試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 材料

實驗材料亳芍2013年8月采自亳芍道地產(chǎn)區(qū)安徽省亳州市5個不同的亳芍種植基地，品種經(jīng)皖西中藥與天然藥物工程技術(shù)研究中心陳乃東博士鑒定為毛茛科植物芍藥(PaeonialactifloraPall.)干燥的根。

5個不同栽培基地分別挖取栽培1～7年的亳芍，共35個樣品，以采自5個基地的15個樣品測定的多糖和微量元素平均含量作為該株齡亳芍多糖及重金屬的含量。新鮮的亳芍，洗凈，去皮，晾干，備用。

2 實驗方法

2.1 亳芍多糖含量測定

2.1.1 多糖的提取純化

亳芍樣品60℃干燥至恒重，粉碎，精密稱取100 g，無水乙醇索氏提取至回流液無色，殘渣揮盡溶劑，以料液比1∶5(V∶V)加入雙蒸水，85℃下水浴回流提取，每次3 h，提取3次，過濾，合并提取液，減壓濃縮至有明顯沉淀，按濃縮液∶無水乙醇=24∶76(V∶V)加入無水乙醇，4℃冰箱過夜，以5000 r/min冷凍離心(離心半徑15 cm)15 min，沉淀加適量的去離子水溶解，反復(fù)用乙醇沉淀，合并沉淀，加入適量蒸餾水，按照粗多糖溶液∶萃取劑(V∶V)=4∶1加入Sevage試劑[3～6](氯仿∶正丁醇=4∶1)除去蛋白。收集上層水相，濃縮，蒸干得精制多糖。

以蒽酮-硫酸比色法[7-9]測定含量，實驗設(shè)3次重復(fù)。

2.1.2 線性關(guān)系考察

精確配制0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)母液，精密量取0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL和1.0 mL于7支帶塞刻度試管中，分別加雙蒸水至體積為1.0 mL，搖勻，于冰水浴中緩慢滴加4.0 mL 0.2%蒽酮-硫酸溶液，搖勻，冷卻后，100.0℃水浴10.0 min后取出，冷卻至室溫，以雙蒸水為空白對照，于620 nm下測吸光度值，得吸光度與濃度的回歸方程A=8.2567C+0.0262，R2=0.9901，在0～0.1 mg，吸光度(A)與濃度(C)呈良好的線性關(guān)系。

2.1.3 穩(wěn)定性試驗

精取樣品液0.2 mL，按2.1.2所述操作，在620 nm處分別于0、30、60、120、240和360 min測定吸光度。結(jié)果顯示該顯色在6.0 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.4 精密度試驗

精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2 mL，按2.1.2操作，測定5 次。結(jié)果顯示，RSD=2.3%。

2.1.5 換算因子的測定

精密稱取精制多糖10.0 mg，配制成0.1 mg/mL的多糖溶液，精密吸取1.0 mL，按2.1.2操作測定其吸光度，按下式算得換算因子(F)：

F=W/(C×D)

其中：

W：精制多糖質(zhì)量(mg)；C：多糖液中所含葡萄糖的濃度(mg/mL)；D：稀釋因素。

2.1.6 多糖含量測定

精密稱取亳芍粗多糖各10.0 mg，配制成0.1 mg/mL的多糖溶液，按2.1.2操作測定其吸光度，按下式算得亳芍多糖含量：

藥材中多糖含量(%)=C×D×F×V/W×Y×100%

其中：

C：為樣品液中折合葡萄糖的濃度(mg/mL)；D為樣品溶液的稀釋因素；F為換算因子；V為樣品溶液體積(mL)；W為樣品質(zhì)量(mg)；Y為粗多糖得率。

根據(jù)上式分別計算出1～7生長年限亳芍總多糖的含量并進(jìn)行比較。

2.1.7 重現(xiàn)性試驗

取同一樣品5份，按2.1.6所述操作，測定多糖含量。結(jié)果顯示，RSD=2.95%，表明該方法重現(xiàn)性好。

2.2 亳芍金屬含量的測定

2.2.1 樣品處理

取粉碎機(jī)粉碎后的亳芍藥材粉末適量，103℃烘干至恒重，精確稱取粉末1.0 g，于瓷坩堝中經(jīng)電爐低溫炭化至無煙，移入馬弗爐中500℃至完全灰化(約5～7 h)，冷卻后取出，加10.0 mL 10%硝酸溶液溶解，溶液移至50.0 mL容量瓶中，用雙蒸水洗滌容器，合并洗滌液于容量瓶，雙蒸水定容至50.0 mL，搖勻。同法同時制備試劑空白溶液。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制與測定

按陳乃東等[10]所述方法制備各微量元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過原子吸收分光光度計考察其線性關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定各金屬的含量，不同金屬的儀器操作條件如表1。各金屬標(biāo)準(zhǔn)曲線如表2所示，各金屬標(biāo)準(zhǔn)溶液在0～1.0 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 原子吸收光譜法測鉛、銅、鉻、鈣、鎂、鈉、鋇、鋅的工作參數(shù)

2.2.3 樣品中微量元素含量測定

將2.2.1制備的樣品，按照2.2.3所述操作測定吸光值，代入回歸方程，求得樣品中微量元素含量。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗

取2.2.1制備的樣品液，按2.2.3所述操作，分別于0、4、8、12、16、20和24 h測定吸光度，結(jié)果顯示各微量元素的測定結(jié)果的RSD均小于5%，在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

表2 各微量元素回歸方程和線性范圍

2.2.5 精密度試驗

取2.2.1制備的樣品液，按2.2.3所述操作，測定5 次。結(jié)果顯示各微量元素的測定結(jié)果的RSD均小于5%。

2.2.6 加樣回收率實驗

在亳芍藥材粉末(1.0 g)中添加適量的銅、鉛、鉻、鎂、鈣、鈉、鋅、鋇標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定其回收率。測得元素的加樣回收率均在96%～99%，RSD值(n=5)在1.2%～3.7%之間，說明采用火焰原子吸收光譜法測定這8種元素穩(wěn)定性良好，精確度較好、精密度較高、達(dá)到定量分析需求。

2.3 分析方法

應(yīng)用SPSS統(tǒng)計軟件對不同株齡亳芍多糖及金屬含量進(jìn)行描述性統(tǒng)計分析；偏相關(guān)分析亳芍營養(yǎng)元素與多糖含量間的偏相關(guān)系數(shù)，篩選影響多糖含量的主要營養(yǎng)元素。

3 結(jié)果與分析

3.1 多糖含量測定結(jié)果

在本實驗條件下，測得株齡1～7年亳芍多糖含量為(圖1)：(2.06±0.12)%、(3.1±0.23)%、(4.66±0.26)%、(2.9±0.33)%、(2.3±0.23)%、(2.4±0.10)%、(2.3±0.07)%。

3.2 不同株齡亳芍微量元素含量測定結(jié)果

不同栽培年限亳芍的銅、鉛、鉻、鎂、鈣、鈉、鋅、鋇含量測定結(jié)果如表3所示。栽培1～7年的亳芍銅、鉛、鉻、鎂、鈣、鈉、鋅、鋇平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為(3.28±0.63)、(3.16±0.63)、(1.69±0.09)、(300.17±13.64)、 (1476.66±57.49)、(71.88± 2.26)、(8.58±0.56)和(369.51±26.68) mg/kg(DW)。從元素的分布來看，鋇、鈣、鎂的含量最高，銅、鉛、鉻3種重微量元素含量未超過5.0 mg/kg(DW)，均在規(guī)定限度范圍內(nèi)[11]。

圖1 不同株齡的亳芍總多糖含量測定結(jié)果(n=3)

亳芍樣品微量元素含量與生理年齡顯著相關(guān)。供試的安徽道地藥材亳芍，對比分析1～7年株齡樣品的銅、鉛、鉻、鎂、鈣、鈉、鋅、鋇含量平均值，銅、鉛和鋅含量隨著株齡的增長而增長；鎂、鈣、鈉含量隨株齡增長變化不大；鋇在3年時含量最低，5年時含量最高。這種變化可能與亳芍生理生化作用有關(guān)，鋅和銅參與植物體氧化還原反應(yīng)，這可能與亳芍抗氧化有效成分隨著株齡增加而積累增加有關(guān)。鈣參與細(xì)胞壁的合成，一旦形成后不易移動或轉(zhuǎn)化，因此受株齡影響較小。

3.3 多糖含量與微量元素含量相關(guān)性研究結(jié)果

通過SPSS 17.0分析采自同一栽培基地1～7年生亳芍，多糖與必需元素之間的相關(guān)性，結(jié)果見表5。分析結(jié)果表明，銅含量與亳芍多糖含量具有顯著相關(guān)性，鋅含量與多糖含量存在正相關(guān)，與斯金平等研究結(jié)果一致[12]。多糖含量與鋇、鉻的含量呈負(fù)相關(guān)，與鈣的含量沒有相關(guān)性。

表3 不同生長年限的亳芍銅、鉛、鎂、鈣、鈉、鋅、鋇、鉻質(zhì)量分?jǐn)?shù)

表4 多糖與微量元素間的相關(guān)性

“*”在 0.05水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)；“**”在0.01水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)

4 討論與結(jié)論

栽培年限對亳芍多糖的含量存在顯著影響：1～3年株齡的亳芍，多糖含量逐年增高，1年株齡的亳芍多糖含量最低(占藥材干重2.06%±0.12%)，3年株齡的亳芍多糖含量最高，達(dá)藥材干重的(4.66±0.26)%，栽培 3年以上，隨著株齡增加，多糖含量下降。可能的原因在于，栽培的前3年，亳芍生長旺盛，多糖的積累量增加，3年后，植株逐漸衰老導(dǎo)致光合用積累多糖的能力下降，植株需消耗自身積累的多糖維持正常的生命活動，因此，亳芍多糖積累規(guī)律表現(xiàn)為先增加(栽培1～3年)、達(dá)到峰值后逐年下降，從多糖含量考慮，以栽培3年的亳芍藥材品質(zhì)較好。研究結(jié)果為安徽道地藥材亳芍的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)，為后續(xù)研究亳芍藥材的最佳采收時期及規(guī)范化種植奠定前期研究基礎(chǔ)。

栽培時間對亳芍中各微量元素含量影響各有差異，可能與其所承擔(dān)的生化作用有關(guān)。因此，在栽培中可根據(jù)亳芍生理需求補(bǔ)充相應(yīng)的微量元素，以利亳芍生長。此外，多糖的含量與微量元素Cu、Zn、Na、Ba和Cr的含量具相關(guān)性，且與Cu、Zn、Na呈正相關(guān)，與Ba、Cr呈負(fù)相關(guān)。中藥材中這些必需元素之間可能通過相互協(xié)同作用，從而對植株的次生代謝產(chǎn)生一定的影響。

有益微量元素是衡量藥材內(nèi)在質(zhì)量指標(biāo)因素之一，藥材的療效不但與其所含有機(jī)成分相關(guān)，還與其所含有的微量元素緊密相關(guān)。中藥材中微量元素的種類與含量受其植物來源、產(chǎn)地、栽培條件及氣候等條件的影響，是其道地性的重要成因，通過結(jié)合有機(jī)成分與無機(jī)必需元素的研究可望為解釋中藥有效成分關(guān)系及指導(dǎo)地道藥材栽培提供理論指導(dǎo)。

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The dynamic accumulation of polysaccharide and trace elements from Bozhou PeonyPaeonialactiflorawithdifferentharvestingages

YAOHou-jun1,2,CHENNai-dong1,2,3,CHENNai-fu1,2,GUOXu4,LIULu-jing1,SIHua-yang1

(1. College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering, West Anhui University, Lu′an 237012; 2.West Anhui Biotechnology Research Center of Natural Medicine and Traditional Chinese Medicine, West Anhui University, Lu′an 237012; 3. School of Pharmacy, Anhui Medical University, Hefei 230032; 4.Academy School, Military Medical University of the People′s Liberation Army of China， Shijiazhuang 050081, China)

Q949.95;R284.1;R282

A

2095-1736(2017)05-0066-04

2017-06-07；

2017-07-28

國家自然科學(xué)基金(81573536)；中國博士后基金特批資助(第9批)(2016T90559)；中國博士后研究面上項目(2014M551791)；安徽省人事廳博士后研究項目；安徽省自然基金面上項目(1608085 MH221)

姚厚軍，副研究員，主要從事中藥資源保護(hù)與利用研究, E-mail:yhj02000022@126.com

陳乃東，博士，教授，主要從事天然藥物活性成分分離鑒定、中藥與天然藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與質(zhì)量控制研究，E-mail: 2004cnd@163.com

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.05.066