圓紅冬孢酵母類胡蘿卜素合成突變菌株的篩選

張 超 蕾， 張 素 芳， 劉 冰 南， 王 際 輝

( 1.大連工業(yè)大學 食品學院, 遼寧 大連 116034；2.中國科學院大連化學物理研究所 生物技術部， 遼寧 大連 116023 )

圓紅冬孢酵母類胡蘿卜素合成突變菌株的篩選

張 超 蕾1,2， 張 素 芳2， 劉 冰 南1， 王 際 輝1

( 1.大連工業(yè)大學 食品學院, 遼寧 大連 116034；2.中國科學院大連化學物理研究所 生物技術部， 遼寧 大連 116023 )

利用等離子體誘變與亞硝基胍誘變的方法，構建油脂合成缺陷型菌株或類胡蘿卜素合成突變菌株。通過乙酰輔酶A流量的分配，驗證油脂合成途徑是否為乙酰輔酶A節(jié)點處優(yōu)勢分支途徑。利用等離子體與亞硝基胍進行復合誘變，等離子體誘變的致死率為95%，亞硝基胍誘變的致死率為90%時，篩選得到圓紅冬孢酵母顏色突變株XP-1、XO-3、XY-4和XR-2。突變株的油脂含量、脂肪酸的成分和類胡蘿卜素的含量測定結果顯示，XP-1、XO-3、XY-4等3個菌株的類胡蘿卜含量低于出發(fā)菌株NP11，類胡蘿卜素的代謝途徑受到一定破壞，但類胡蘿卜素的降低并沒有促進油脂合成的增加。XR-2菌株的油脂含量下降，類胡蘿卜素含量相應升高，最高達到0.77 μg/g。結果表明，乙酰輔酶A是一個弱剛性節(jié)點，油脂合成途徑為此節(jié)點的優(yōu)勢分支途徑，其產(chǎn)物的減少可有效增加類胡蘿卜素合成的增加。

圓紅冬孢酵母；等離子誘變；亞硝基胍誘變；油脂；類胡蘿卜素；弱剛性節(jié)點

Abstract: A mutant strain of oil synthesis, defective strain or carotenoid was constructed by mutagenesis of plasma and guanidine. It is determined that the pathway of lipid synthesis is the dominant branching pathway of acetyl coenzyme A node through the distribution of acetyl coenzyme A flux.Compound mutagenesis was carried out using plasma and nitroso guanidine. XP-1, XO-3, XY-4 and XR-2 mutants were screened out through ARTP and NTG mutagenesis with 95% and 90% lethal rate. The ability of producing lipid,composition of fatty acid and content of carotenoid determination results showed that the carotenoid contents of XP-1, XO-3, XY-4 and other three strains were lower than that in strain NP11, the metabolic pathway of carotenoids have been destroyed, but the decreasing of carotenoid could not promote the increasing of lipid synthesis. The carotenoid content increased with the decreasing of lipid content in strain XR-2, which could reached to 0.77 μg/g. The results indicated that acetyle-CoA is a weakly rigid node, and the pathway of lipid synthesis is the dominant branch of the pathway. The reduction of its products can increase the production of carotenoid synthesis.

Keywords:Rhodosporidiumtoruloides; plasma mutation; nitrosoguanidine mutation; lipid; carotenoid; weakly rigid node

0 引 言

在代謝工程中，把弱剛性節(jié)點處占主導地位的分支途徑稱為優(yōu)勢分支途徑，其他分支則稱為從屬分支[1-2]。阻斷從屬分支途徑，優(yōu)勢途徑的末端產(chǎn)物含量也常無顯著增加[3-4]。反之，如果要增加從屬分支途徑產(chǎn)物的產(chǎn)率，則必須通過弱化優(yōu)勢分支途徑來實現(xiàn)。圓紅冬孢酵母中，乙酰輔酶A作為關鍵代謝節(jié)點，是油脂合成與萜類化合物合成的共同前體[5-6]。在限氮的條件下，乙酰輔酶A更多的流向油脂合成的分支途徑，只有少部分流向類胡蘿卜素合成途徑[7-8]。受限于遺傳操作，產(chǎn)油酵母中油脂合成途徑是否為乙酰輔酶A代謝節(jié)點處的優(yōu)勢分支途徑，萜類合成途徑是否為從屬分支途徑，一直沒有確切定論。

由于類胡蘿卜素含量變化會導致菌株顏色差異，本實驗綜合利用等離子誘變與亞硝基胍兩種誘變方法[9-10]，對菌株進行快速誘變，并高通量篩選顏色突變菌株，分析突變菌株的油脂含量、脂肪酸成分和類胡蘿卜素含量，以期判斷油脂合成途徑是否為乙酰輔酶A節(jié)點處的優(yōu)勢分支途徑。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 體

圓紅冬孢酵母單倍體(Rhodosporidiumtoruloides)菌株 NP11，由本實驗室分離鑒定并保藏在4 ℃ YEPD斜面。

1.1.2 培養(yǎng)基

YEPD培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨10，酵母粉10；pH 6.0。

限氮培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 50，硫酸銨 0.1，酵母粉 0.75，KH2PO40.4，MgSO4·7H2O 1.5；pH 6.0。補加10 mL痕量元素溶液，每升痕量元素溶液包含：CaCl2·2H2O 4.0 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.55 g，ZnSO4·7H2O 0.10 g，MnSO4·H2O 0.076 g，18 mol/L H2SO4100 μL。

1.1.3 主要試劑

亞硝基胍(NTG)，Sigma公司；酵母粉、蛋白胨，北京奧博星生物技術有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 方 法

1.2.1 亞硝基胍誘變與等離子體誘變

1.2.1.1 亞硝基胍誘變致死率曲線

取對數(shù)期時的圓紅冬孢酵母菌液4.5 mL，用無菌水洗滌2次。離心后加入pH 6的磷酸鉀緩沖溶液4.5 mL，取5 mg的NTG溶于少量的丙酮溶液中，加入磷酸鉀緩沖溶液至1 mL，配制成NTG溶液。取4.5 mL菌體加入0.5 mL的NTG，使NTG的終濃度為500 μg/mL，處理時間分別為15、30、45、60 min，用硫代硫酸鈉終止反應，再用無菌水洗滌2遍后，稀釋涂于YEPD培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。

1.2.1.2 等離子體誘變致死率曲線

采用無錫思清源生物科技生產(chǎn)的常壓室溫等離子體進行誘變。誘變過程：用對數(shù)期的菌體進行誘變。取10 μL菌懸液均勻涂于10 mm錠子上，進行等離子體誘變。對誘變的儀器進行參數(shù)設置。誘變的氣體主要為He，距離2 mm，功率115 W，體積流量12 L/min，時間分別為20、30、40、50、60、70、90 s。根據(jù)存活的菌體數(shù)目計算致死率曲線。

1.2.2 突變株的篩選

將NP11培養(yǎng)至對數(shù)期后，先經(jīng)過亞硝基胍處理，再進行等離子體誘變。將處理后的菌體在YEPD中培養(yǎng)6 h。將菌液適當稀釋后涂于YEPD平板上，挑選出不同顏色的表型突變菌株。

1.2.3 細胞生物量測定

取30 mL菌液，6 000g離心收集細胞后用等體積蒸餾水洗滌2次，濕細胞于105 ℃烘至恒重，以g/L表示細胞生物量。

1.2.4 油脂抽提

將發(fā)酵14 d的菌液6 000g離心5 min，細胞用蒸餾水洗滌2次，用酸熱法提取[11]。按每克濕細胞加10 mL 4 mol/L HCl，于78 ℃水浴處理1.5 h，冷卻后，加入10 mL甲醇振蕩2 min。甲醇與氯仿按體積比1∶1加入10 mL氯仿，收集氯仿層，再加入10 mL氯仿振蕩2 min，6 000g離心5 min，收集氯仿層，合并氯仿液，加入等體積的0.1% NaCl溶液，無水Na2SO4過濾，用已知質量的接收瓶收集氯仿層，再用氯仿沖洗3次，在旋轉蒸發(fā)儀上蒸去氯仿，于105 ℃烘干2 h，冷卻后稱重。

1.2.5 殘?zhí)橇繙y定

采用山東省科學院生產(chǎn)的SBA-40B生物傳感分析儀進行葡萄糖測定，檢測范圍在0～1.0 g/L。

1.2.6 脂肪酸組成分析

按文獻方法[12]對菌油脂肪酸進行甲酯化，準確稱取70 mg油脂，加入5% KOH/CH3OH溶液0.5 mL，70 ℃回流50 min。加入BF3的甲醇溶液0.7 mL，繼續(xù)回流10 min。冷卻后加入少量正己烷，再加入適量蒸餾水，使脂肪酸甲酯被萃取進入正己烷層，正己烷層經(jīng)洗滌后作為氣相色譜的進樣樣品。

用7890F氣相色譜儀對脂肪酸成分進行分析，色譜條件：FFAP石英毛細管柱(30 m×0.32 mm×0.4 μm)，進樣量0.5 μL，進樣器溫度250 ℃，檢測器(FID)溫度280 ℃，柱溫200 ℃。脂肪酸通過對照標準樣品定性，用面積歸一法確定相對質量分數(shù)[13]。

1.2.7 類胡蘿卜素的提取

測量菌體干重。測量細胞內類胡蘿卜素含量。取2 mL發(fā)酵液，加入3 mol/L鹽酸300 μL，沸水浴3 min，冰水浴3 min，8 000 r/min離心5 min，加入300 μL丙酮振蕩混勻，取上清液。該過程重復3次，至菌體顏色變白，收集上清。向丙酮溶液中加入500 μL石油醚和200 μL飽和食鹽水，振蕩混勻浸提。8 000 r/min離心5 min，小心轉移上清至2 mL離心管，在450 nm處測定吸光度[14]。采用下面的公式進行計算：

1.3 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)以(平均值±標準差)表示。

2 結果與討論

2.1 亞硝基胍誘變與等離子誘變

2.1.1 亞硝基胍誘變致死率曲線

如圖2所示，隨著時間的延長死亡率逐漸升高，當NTG的誘變時間為60 min時，菌株的死亡率為100%。所以選擇45 min作為誘變時間，菌株的死亡率達到93%。

圖1 NTG誘變下的致死率曲線Fig.1 The death rate curve of NTG

2.1.2 等離子體誘變致死率曲線

將培養(yǎng)至對數(shù)期的菌液進行等離子體誘變，分別誘變20、30、40、50、60、70、90 s。如圖3所示，對菌株誘變70 s，菌體的致死率達到95%；對菌株誘變90 s，菌體的致死率達到100%。

圖2 ARTP誘變下的致死率曲線Fig.2 The death rate curve of ARTP

2.2 菌株的篩選

按等離子體誘變的致死率95%和亞硝基胍誘變的致死率90%，分別進行單一因素誘變時，均未能篩選到目標菌株。等離子體與亞硝基胍復合誘變得到4株不同顏色的突變菌株，這4株菌株分別命名為XP-1、XR-2、XO-3、XY-4，顏色分別呈粉色、深紅色、橙黃色、黃色，結果如圖3所示。

圖3 NTG與ARTP誘變的變異菌株Fig.3 Mutants of NTG and ARTP

2.3 4株突變菌株油脂質量分數(shù)的測定

通過復合誘變所獲得的4株不同顏色的菌株，對4株表型變異的菌株與圓紅冬孢酵母單倍體發(fā)酵14 d后對其油脂和類胡蘿卜素含量進行提取測定，得到結果如表1所示。從表1中可以看出，菌體顏色變淺的XP-1、XO-3和XY-4等3株菌的類胡蘿卜素質量分數(shù)分別為167.94、238.05、62.12 μg/g，都比出發(fā)菌株NP11低，但其油脂含量并沒有相應提高，質量分數(shù)均在50%以上。菌體顏色變深的XR-2菌株的油脂含量顯著降低，僅為0.28 g/g，其類胡蘿卜素質量分數(shù)相應增加，達到0.77 μg/g。說明油脂合成途徑產(chǎn)物的減少可顯著提高類胡蘿卜素合成途徑的乙酰輔酶A流量，增加類胡蘿卜素合成。結果表明，在限氮的條件下培養(yǎng)時，油脂合成途徑為乙酰輔酶A節(jié)點處的優(yōu)勢分支途徑，從屬分支類胡蘿卜素合成通路的通量變化對油脂的含量無明顯影響。

表1 發(fā)酵后的殘?zhí)橇俊⑸锪?、油脂含量和類胡蘿卜素含量

Tab.1 Contents of residual sugar, cell biomass, lipid and caroteniod measured after fermentation

菌株殘?zhí)橇?(g·L-1)生物量/(g·L-1)w(油脂)/(g·g-1)w(類胡蘿卜素)/(μg·g-1)XP-12.1±0.39.2±0.50.54±0.1167.94±16.90XR-234.2±1.42.8±0.40.28±0.2770.09±22.73XO-31.3±0.97.2±0.20.51±0.3238.05±39.82XY-41.2±1.18.9±0.30.61±0.162.12±26.92NP111.2±0.48.9±0.80.57±0.1359.09±69.94

如圖4所示，限氮96 h時，油脂合成途徑為乙酰輔酶A節(jié)點的優(yōu)勢分支。限氮培養(yǎng)時，與乙酰輔酶A合成有關的基因乙酰輔酶A合成酶(Acs1)與ATP-檸檬酸裂解酶(Acl1)上調，從而保證充足的乙酰輔酶A前體供應；乙酰輔酶A下游代謝途徑中，與油脂合成有關的基因如乙酰輔酶A羧化酶(Acc1)上調，與萜類化合物合成的有關基因Erg10下調，乙酰輔酶A主要流向油脂合成途徑[15]。

2.4 4株特殊表型菌株的脂肪酸成分

用氣相色譜分別對脂肪酸C14:0、C16:0、C16:1、C18:0、C18:1、C18:2、C18:3成分進行分析，因XR-2積累油脂過少，不作分析。其他3株菌的脂肪酸質量分數(shù)如表2所示。3株表型變異的菌株與NP11脂肪酸成分差異不大。主要積累C16:0、C18:1，XP-1可以積累C18:3。

圖4 乙酰輔酶A相關代謝支點相關蛋白的 表達調節(jié)Fig.4 Expression of acetyl-CoA-associated proteins

表2 GC分析3株特殊表型菌株和NP11的脂肪酸成分

Tab.2 Fatty acid compositions of three different phenotype strains and NP11 estimated by GC

菌株w/%C14:0C16:0C16:1C18:0C18:1C18:2C18:3XP-15.427.10.69.942.211.10.8XO-33.433.80.711.440.56.8—XY-45.040.50.89.534.56.3—NP112.131.20.98.439.29.2—注:“—”代表未檢測到。

2.5 4株表型變異菌株的SNP測序

單核苷酸多態(tài)性(SNP)主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性，包括單個堿基的轉換、顛換等。XP-1進行基因組重測序，參考R.toruloidesNP11基因組比對，并進行SNP、分析和注釋，對所有突變蛋白進行聚類分析，重點關注油脂合成途徑和類胡蘿卜合成途徑上的關鍵基因，結果如表3所示。結果顯示，非同義突變主要發(fā)生在反轉錄酶、轉錄因子與類胡蘿卜素代謝途徑的相關的蛋白。但對顏色表型有貢獻的是XP-1的CRT1基因發(fā)生突變，310位堿基由C突變成T，使得相應的蛋白質序列104位氨基酸由His突變?yōu)門yr (CAC?TAC)如圖5所示。該關鍵位點突變導致CRT酶活下降，類胡蘿卜素合成減少，從基因水平上驗證了發(fā)酵結果。

表3 XP-1中反轉錄酶、轉錄因子與類胡蘿卜素的途徑Tab.3 Reverse transcriptase, transcription factor and pathway of carotenoid in XP-1

圖5 XP-1突變的氨基酸Fig.5 Mutant amino acid of XP-1

3 結 論

經(jīng)過等離子誘變與亞硝基胍復合誘變篩選出來的色素變異菌株XP-1、XO-3、XY-4都可以積累50%以上的油脂，而類胡蘿卜素的含量與NP11相比有所降低?？梢钥闯?，類胡蘿卜素代謝途徑受到阻遏，并沒有對油脂的形成產(chǎn)生影響。在圓紅冬孢酵母中油脂的合成為優(yōu)勢途徑。所以類胡蘿卜素的降低不會對油脂的形成構成影響。所篩選出來的XR-2菌株，與NP11相比可以合成較多的類胡蘿卜素，類胡蘿卜素的質量分數(shù)為NP11的1.97倍，僅能合成28%的油脂。該菌株在限氮的條件下不能生成油脂，說明油脂合成相關的代謝途徑被中斷，使乙酰輔酶A更多地流向萜類化合物的生成途徑。也證明了只有減弱優(yōu)勢途徑，才能使乙酰輔酶A更多地流向從屬分支途徑。同時誘變沒有對脂肪酸的組成造成影響。本實驗為紅酵母的類胡蘿卜素合成和萜類化合物生物合成代謝途徑重構提供了理論支持，也為類似的代謝節(jié)點調控研究提供了重要參考價值。

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ScreeningofcarotenoidsmutantsinRhodosporidiumtoruloides

ZHANG Chaolei1,2, ZHANG Sufang2, LIU Bingnan1, WANG Jihui1

( 1.School of Food Science and Technology, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China；2.Division of Biotechnology, Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Science, Dalian 116023, China )

TS201.3

A

1674-1404(2017)05-0318-05

2016-04-01.

國家自然科學基金項目(31370554)；遼寧省科技計劃項目(2014211003)；遼寧省教育廳創(chuàng)新團隊項目(LT2014010)；大連市科技計劃項目(2014B11NC088).

張超蕾(1989-)，女，碩士研究生；通信作者：王際輝(1970-)，男，教授.

張超蕾,張素芳,劉冰南,王際輝.圓紅冬孢酵母類胡蘿卜素合成突變菌株的篩選[J].大連工業(yè)大學學報,2017,36(5):318-322.

ZHANG Chaolei, ZHANG Sufang,LIU Bingnan, WANG Jihui. Screening of carotenoids mutants inRhodosporidiumtoruloides[J]. Journal of Dalian Polytechnic University, 2017, 36(5): 318-322.