刺參腸內(nèi)源酶對(duì)體壁膠原蛋白的降解作用

齊 申, 吳 海 濤,2, 王 成 成, 唐 越,2, 孫 娜,2, 于 翠 平,2

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院, 遼寧 大連 116034；2.大連工業(yè)大學(xué) 國(guó)家海洋食品工程技術(shù)研究中心, 遼寧 大連 116034 )

刺參腸內(nèi)源酶對(duì)體壁膠原蛋白的降解作用

齊 申1, 吳 海 濤1,2, 王 成 成1, 唐 越1,2, 孫 娜1,2, 于 翠 平1,2

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院, 遼寧 大連 116034；2.大連工業(yè)大學(xué) 國(guó)家海洋食品工程技術(shù)研究中心, 遼寧 大連 116034 )

采用明膠酶譜法檢測(cè)刺參腸內(nèi)源酶中膠原降解酶的活性，應(yīng)用流變儀分析刺參體壁粗膠原纖維的流變特性。通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和TCA可溶性寡肽含量測(cè)定方法，考察了刺參腸內(nèi)源酶對(duì)體壁酶促溶性膠原蛋白的降解作用。結(jié)果表明，當(dāng)粗膠原纖維質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%時(shí)，溶脹的粗膠原纖維顯示出明顯的凝膠特性，經(jīng)刺參腸內(nèi)源酶處理后，其凝膠性明顯下降。在pH 9.0和40 ℃的條件下，刺參腸內(nèi)源酶作用0.5 h后，可顯著促進(jìn)PSC中γ、β及α鏈的降解；在此過(guò)程中，體壁酶促溶性膠原蛋白降解產(chǎn)物中TCA可溶性寡肽含量逐漸增加。研究表明，刺參腸中具有能夠降解體壁膠原蛋白的內(nèi)源酶，并在刺參自溶中發(fā)揮重要作用。

刺參；體壁；自溶；內(nèi)源酶；膠原蛋白

Abstract: The activity of endogenous enzyme was determined by gelatin zymography. The rheological behavior of crude collagen fiber fromS.japonicuswas analyzed by rheometer. The effects of gut endogenous enzymes on degradation of pepsin-soluble collagen (PSC) were analyzed by SDS-PAGE and TCA-soluble oligopeptide content assay. The swelling of crude collagen fibers showed obvious gel characteristic when the crude collagen fiber mass fraction was 3%, but the gel properties decreased obviously when treated with endogenous enzymes ofStichopusjaponicus. The band intensities of γ-, β- and α-chain in PSC significantly decreased by treated with gut endogenous enzymes at pH 9.0 and 40 ℃ for 0.5 h. The content of TCA-soluble oligopeptides in the PSC degradation products increased gradually. The result suggested thatS.japonicuscontain endogenous enzymes that could degrade collagen in the body wall, and plays an important role in autolysis ofS.japonicus.

Keywords:Stichopusjaponicus; body wall; autolysis; endogenous enzymes; collagen

0 引 言

刺參(Stichopusjaponicus)是重要的海洋棘皮類(lèi)動(dòng)物[1]，其自溶主要通過(guò)自身水解酶類(lèi)的作用發(fā)生消解，同時(shí)伴隨胞內(nèi)物質(zhì)的釋放[2-3]。刺參體壁是刺參主要的食用部位，主要由上皮組織以及真皮結(jié)締組織構(gòu)成，體壁中的膠原蛋白含量最多，而膠原蛋白是膠原纖維的基本組成單位，對(duì)刺參體壁起著重要的支撐作用[4-5]。目前，對(duì)海參膠原蛋白的研究主要集中在氨基酸及亞基的組成方面[6]。刺參腸中含有豐富的蛋白水解酶，如胃蛋白酶、胰蛋白酶、組織蛋白酶B、高堿性蛋白酶和肽水解酶[7-10]。Wu等[11]研究發(fā)現(xiàn)，體壁中的半胱氨酸蛋白酶是一類(lèi)重要的蛋白酶，它直接參與了海參自溶過(guò)程中非膠原蛋白質(zhì)的降解，而對(duì)于自溶過(guò)程中刺參腸內(nèi)源酶與膠原蛋白的直接酶解作用還鮮有報(bào)道。

為延續(xù)上述研究工作，本實(shí)驗(yàn)以刺參體壁粗膠原纖維(crude collagen fiber，CCF)和酶促溶性膠原蛋白(pepsin-soluble collagen，PSC)為研究對(duì)象，利用刺參腸內(nèi)源酶考察其對(duì)體壁膠原蛋白的酶解作用，為進(jìn)一步豐富海參自溶機(jī)理奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 原料與主要試劑

刺參購(gòu)自大連長(zhǎng)興市場(chǎng)；明膠、SDS、溴酚藍(lán)、Tris、丙烯酰胺、N，N-亞甲基雙丙烯酰胺、過(guò)硫酸銨、Triton、考馬斯亮藍(lán)R-250、考馬斯亮藍(lán)G-250、N，N，N，N-四甲基乙二胺、尿素、巰基乙醇，上海生工生物工程有限公司；蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品，寶生物工程(大連)有限公司；牛血清白蛋白，瑞士Fluka公司；甘油、甘氨酸、冰乙酸，天津市科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心；其他試劑均為化學(xué)分析純。

1.2 主要設(shè)備

Discovery HR-1流變儀，美國(guó)TA儀器；Satorius pH計(jì)，塞多利絲科學(xué)儀器(北京)有限公司；AE-6450垂直電泳儀槽，日本ATTO株式會(huì)社；TS.B-108往復(fù)式脫色搖床，江蘇海門(mén)其林貝爾儀器制造有限公司；MF-ChemiBIS 2.0凝膠成像儀，DNR Bio-imaging systems Ltd。

1.3 方 法

1.3.1 刺參腸內(nèi)源酶提取及酶活檢測(cè)

1.3.1.1 刺參腸內(nèi)源酶的提取

根據(jù)文獻(xiàn)[12]的方法，本實(shí)驗(yàn)中的刺參腸內(nèi)源酶提取方法略有改變。方法如下：向干凈的刺參腸中加入2倍體積pH 9.0 20 mmol/L Tris-HCl緩沖液研磨浸提；離心后的上清液即為刺參腸內(nèi)源酶提取液。與前期研究方法不同之處在于，Tris-HCl緩沖液中去除了10 mmol/L的CaCl2，主要由于Ca2+對(duì)CCF凝膠溶液的形成有很大影響。

1.3.1.2 刺參腸內(nèi)源酶明膠酶譜檢測(cè)

根據(jù)文獻(xiàn)[13]的方法，將酶液稀釋2.5、5、10、20、30、40倍，取10 μL酶液進(jìn)行明膠酶譜檢測(cè)。

1.3.2 刺參體壁CCF的提取[14]

先將冷凍刺參體壁打碎，水洗離心，向所得沉淀中加入pH 8.0 0.1 mol/L含5 mmol/L EDTA、0.5 mol/L NaCl的Tris-HCl 緩沖液攪拌；再將離心所得沉淀水洗至中性后，用去離子水?dāng)嚢杼崛?，離心后得到的上層清液中含有粗膠原纖維；向下層沉淀中加入去離子水重復(fù)提取一次，并將兩次提取的上清液合并；經(jīng)NaOH洗滌后再水洗至中性，經(jīng)冷凍干燥得到膠原粗纖維。以上操作均在4 ℃下進(jìn)行。

1.3.3 刺參體壁CCF流變特性的測(cè)定及刺參腸內(nèi)源酶的影響

1.3.3.1 刺參體壁CCF流變特性的測(cè)定

采用流變儀反映刺參體壁CCF的流變特性。用超純水溶脹CCF 12 h，制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1%、2%、3%的懸濁液，離心除氣泡，靜置后用流變儀進(jìn)行測(cè)試。

根據(jù)文獻(xiàn)[15]的方法，測(cè)試參數(shù)設(shè)定為采用40 mm平行板作為夾具，溫度15 ℃，分別進(jìn)行頻率1 Hz、應(yīng)變0.1%～100%的應(yīng)變掃描，應(yīng)變2%、頻率0.1～10 Hz的頻率掃描和剪切速率0.1～100 s-1的剪切速率掃描3種模式測(cè)量。

1.3.3.2 刺參腸內(nèi)源酶對(duì)CCF流變性的影響

制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的CCF懸濁液，將懸濁液與刺參腸內(nèi)源酶液以質(zhì)量比10∶1的比例均勻混合，同時(shí)添加等量的pH 9.0 20 mmol/L Tris-HCl緩沖液作對(duì)照，用流變儀進(jìn)行測(cè)試。

1.3.4 刺參體壁酶促溶性膠原蛋白的提取

將粗膠原纖維溶于500倍0.5 mol/L乙酸溶液中，并加入胃蛋白酶；離心，向上清液中加入NaCl靜置過(guò)夜；將離心所得沉淀溶于少量0.5 mol/L 乙酸中，采用0.02 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4和0.1 mol/L乙酸透析液透析，將離心所得沉淀經(jīng)冷凍干燥得到酶促溶性膠原蛋白。以上操作均在4 ℃下進(jìn)行。

1.3.5 刺參腸內(nèi)源酶對(duì)PSC的影響

1.3.5.1 預(yù)處理

用pH 9.0 20 mmol/L Tris-HCl緩沖液溶解PSC，終濃度1.5 mg/mL，將稀釋5倍的刺參腸內(nèi)源酶液與PSC混合，終濃度1.5 mg/mL，于40 ℃下分別孵育0.5、1、2、4 h。

1.3.5.2 SDS-PAGE檢測(cè)

向預(yù)處理后的各樣品中加入5×上樣緩沖液，離心，上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

1.3.5.3 TCA可溶性寡肽含量的測(cè)定

向預(yù)處理后的各樣品中加入等體積20 g/mL 預(yù)冷過(guò)的TCA溶液，并振蕩混合均勻，室溫靜置后離心，上清液采用Folin-酚法測(cè)定[16]。

每個(gè)酶解時(shí)間作4組平行實(shí)驗(yàn)。以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為y=0.779 87x+0.069 81 (R2=0.996 19)。其中y為吸光度，x為牛血清蛋白質(zhì)量濃度。根據(jù)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算TCA-可溶性寡肽的含量。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示。采用在線(xiàn)軟件進(jìn)行Student’st檢驗(yàn)，P<0.05，差異性顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 刺參腸內(nèi)源酶的酶活檢測(cè)

按照“1.3.1”的方法提取刺參腸內(nèi)源酶并對(duì)其進(jìn)行稀釋?zhuān)妹髂z酶譜法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示。采用pH 9.0 20 mmol/L Tris-HCl緩沖液提取獲得的刺參腸內(nèi)源酶經(jīng)稀釋2.5倍、5倍后可由明膠酶譜清晰檢出，而稀釋10倍以上時(shí)酶含量過(guò)低，明膠酶譜顯示酶活較低。

L，低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)marker；H，高分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)marker；1～6，刺參腸內(nèi)源酶分別稀釋40、30、20、10、5、2.5倍樣品；7，未經(jīng)稀釋的刺參腸內(nèi)源酶原液

圖1 刺參腸內(nèi)源酶的活力

Fig.1 Activity of endogenous enzyme from gut inStichopusjaponicus

2.2 刺參體壁CCF的流變特性

按照“1.3.2”的方法分別制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、2%、3%的CCF懸濁液，樣品如圖2所示，不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的CCF樣品呈現(xiàn)不同的凝膠效果。當(dāng)CCF質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%時(shí)，將樣品倒置觀察，發(fā)現(xiàn)部分水被分離出來(lái)，海參膠原纖維凝膠效果較差；CCF質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%時(shí)，凝膠效果增強(qiáng)，但仍有少量水被分離，倒置后樣品有流動(dòng)性；而當(dāng)CCF質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到3%時(shí)，無(wú)水分分離，凝膠效果較好。因此，選用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的刺參體壁CCF進(jìn)行后續(xù)研究。

圖2 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)刺參體壁CCF懸濁液的外觀形態(tài)

Fig.2 CCF suspension of body wall at different concentration

按照“1.3.3.1”方法,采用流變儀對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%和3%的刺參體壁CCF懸濁液進(jìn)行流變特性的考察，以綜合評(píng)定其凝膠特性，結(jié)果如圖3所示。在圖3(a)中，G′為儲(chǔ)能模量，代表流變行為的彈性部分；G″為損耗模量，代表流變行為的黏性部分。在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%時(shí)，G′和G″較小，說(shuō)明凝膠性不明顯。當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到3%時(shí)，G′隨著應(yīng)變量的增加先保持不變，后急劇減?。欢鳪″隨著應(yīng)變的增加先上升后下降。G′大于G″，說(shuō)明刺參體壁CCF懸濁液在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%時(shí)，彈性特性高于黏性特性，表現(xiàn)為類(lèi)似固體的彈性行為占主導(dǎo)，呈現(xiàn)出凝膠性。

如圖3(b)所示，復(fù)數(shù)黏度(η*)體現(xiàn)了黏度和彈性共同的貢獻(xiàn)。在頻率掃描中，η*隨頻率增加而急劇下降，初始η*隨刺參體壁CCF懸濁液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而增大；G′和G″都隨著頻率的增加而略有增大。

圖3(c)為剪切速率掃描，刺參體壁CCF懸濁液的黏度(η)隨剪切速率的增加而急劇減小，呈現(xiàn)明顯的剪切稀化現(xiàn)象。在同一剪切速率下，刺參體壁CCF的質(zhì)量分?jǐn)?shù)越大，初始黏度越大；同一剪切速率下，其剪切應(yīng)力(σ)隨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而增大。

2.3 刺參腸內(nèi)源酶對(duì)體壁CCF流變特性的影響

按照“1.3.3.2”方法將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的CCF與刺參腸內(nèi)源酶液混合處理，并以Tris-HCl緩沖液為對(duì)照，再按照“1.3.3.1”方法采用流變儀考察刺參腸內(nèi)源酶對(duì)體壁CCF流變特性的影響，結(jié)果如圖4所示。質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的刺參體壁凝膠溶液經(jīng)刺參腸內(nèi)源酶處理12 h后，在應(yīng)變掃描(a)、頻率掃描(b)和剪切速率掃描(c)3種流變模式下，刺參腸內(nèi)源酶均顯示出明顯降低體壁CCFG′、G″、η*、η及σ的作用，說(shuō)明刺參腸內(nèi)源酶可能通過(guò)降低體壁CCF的凝膠性進(jìn)一步發(fā)揮降解膠原的能力。

(a) 應(yīng)變掃描(b) 頻率掃描(c) 剪切速率掃描圖3 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)刺參體壁CCF的流變特性Fig.3 The rheological properties of CCF suspension from body wall of Stichopus japonicus at different concentration

(a) 應(yīng)變掃描(b) 頻率掃描(c) 剪切速率掃描圖4 刺參腸內(nèi)源酶對(duì)體壁CCF流變特性的影響

2.4 刺參腸內(nèi)源酶對(duì)體壁PSC的降解作用

根據(jù)“2.1”的結(jié)果，按照“1.3.5.1”方法選擇5倍稀釋的酶液對(duì)刺參體壁酶促溶性膠原蛋白進(jìn)行酶解，并進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果如圖5所示。刺參膠原蛋白主要含β及α鏈，少量γ鏈，與文獻(xiàn)[17]結(jié)果一致。在pH 9.0 20 mmol/L Tris-HCl緩沖體系中，刺參體壁PSC在內(nèi)源酶作用0.5 h時(shí)，PSC基本降解完全，說(shuō)明刺參腸內(nèi)源酶對(duì)體壁PSC降解能力較強(qiáng)。

按照“1.3.5.3”方法，將刺參腸內(nèi)源酶對(duì)體壁PSC進(jìn)行酶解，檢測(cè)其TCA可溶性寡肽相對(duì)釋放量的變化情況，結(jié)果如圖6所示。隨著刺參腸內(nèi)源酶作用時(shí)間的延長(zhǎng)，體壁PSC降解產(chǎn)物中TCA可溶性寡肽含量逐漸增加，即大分子PSC被降解為小分子多肽。這一結(jié)果與電泳結(jié)果保持一致，說(shuō)明刺參腸內(nèi)源酶可明顯降解體壁PSC，并產(chǎn)生小分子肽類(lèi)物質(zhì)。

L，低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)marker；H,高分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)marker；1，未加酶對(duì)照組PSC；2～5，刺參腸內(nèi)源酶作用時(shí)間分別為30、60、120、240 min的產(chǎn)物

圖5 刺參腸內(nèi)源酶對(duì)體壁PSC降解作用

Fig.5 Effect of endogenous enzyme from gut on degradation of PSC of body wall inStichopusjaponicus

3 結(jié) 論

刺參腸內(nèi)源酶中含有膠原降解酶，刺參體壁CCF懸濁液在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%時(shí)顯示出較強(qiáng)的流變特性。將刺參腸內(nèi)源酶與體壁膠原纖維CCF懸濁液或PSC溶液相互作用時(shí)，內(nèi)源酶能夠有效降低體壁CCF的流變特性，同時(shí)可明顯降解體壁PSC。研究結(jié)果顯示，刺參腸中含有能夠降解體壁膠原蛋白的內(nèi)源酶，并在刺參自溶中可能發(fā)揮重要作用。

不同字母之間標(biāo)記的數(shù)據(jù)具有顯著差異(P<0.05)

圖6 刺參腸內(nèi)源酶酶解體壁PSC過(guò)程中TCA可溶性寡肽相對(duì)質(zhì)量的變化

Fig.6 Change of TCA-soluble oligopeptide content during degradation of PSC of body wall by endogenous enzyme from gut inStichopusjaponicus

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EffectofendogenousenzymefromgutonbodywallcollagendegradationinStichopusjaponicus

QIShen1,WUHaitao1,2,WANGChengcheng1,TANGYue1,2,SUNNa1,2,YUCuiping1,2

( 1.School of Food Science and Technology, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China；2.National Engineering Research Center of Seafood, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China )

TS254.2

A

1674-1404(2017)05-0313-05

2016-03-18.

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31370037)；遼寧省科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目(2015103020).

齊 申(1992-)，女，碩士研究生；通信作者：吳海濤(1980-)，女，副教授.

齊申,吳海濤,王成成,唐越,孫娜,于翠平.刺參腸內(nèi)源酶對(duì)體壁膠原蛋白的降解作用[J].大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2017,36(5):313-317.

QI Shen, WU Haitao, WANG Chengcheng, TANG Yue, SUN Na, YU Cuiping. Effect of endogenous enzyme from gut on collagen degradation from body wall inStichopusjaponicus[J]. Journal of Dalian Polytechnic University, 2017, 36(5): 313-317.