2008-2015年石嘴山市手足口病流行病學特征及主要分離株基因序列分析

尤平濤，何 鋒，趙秀云，馬江濤，趙 瑞

·經(jīng)驗交流·

2008-2015年石嘴山市手足口病流行病學特征及主要分離株基因序列分析

尤平濤1，何 鋒1，趙秀云1，馬江濤2，趙 瑞1

目的分析手足口病發(fā)病情況與流行特征，掌握手足口病病原體的構(gòu)成及主要分離株基因序列。方法對石嘴山市手足口病疫情資料進行分析，并對主要分離株進行基因測序，根據(jù)VP1區(qū)核苷酸序列與其他省份以及國外的EV71、CVA16參考株序列構(gòu)建基因親緣進化樹。結(jié)果石嘴山市城區(qū)年平均報告發(fā)病率高于農(nóng)業(yè)縣，每年6、7月是發(fā)病高峰期，發(fā)病年齡主要集中在0～6歲，以散居、托幼兒童為主，男性發(fā)病率明顯高于女性。親緣進化樹、核苷酸同源性顯示石嘴山市CVA16屬于B1基因亞型，EV71屬于C4基因亞型。結(jié)論石嘴山市手足口病主要流行的EV71、CVA16的基因亞型與全區(qū)、全國一致，CVA16是石嘴山市手足口病優(yōu)勢病原體。

手足口?。涣餍胁W特征；基因序列

手足口病是由多種人腸道病毒引起的一種兒童常見傳染病，以發(fā)熱和手、足、口腔等部位的皮疹或皰疹為主要癥狀，容易在入托幼兒中引起手足口病暴發(fā)疫情。通過對石嘴山市手足口病疫情資料的分析，了解手足口病發(fā)病情況與流行特征，掌握手足口病病原體的構(gòu)成，并對EV71、CVA16陽性標本進行VP1基因序列特征和分子進化分析。

1 資料與方法

1.1 資料來源：2008-2015年石嘴山市疾控中心共收集全市二區(qū)一縣具有手足口病癥狀的患者標本4 238份，標本均為咽拭子、皰疹液。石嘴山市手足口病疫情資料來源于中國疾病監(jiān)測報告信息系統(tǒng)網(wǎng)絡直報疫情信息，實驗室資料來源于中心實驗室和寧夏疾控中心實驗室，人口資料來源于市統(tǒng)計局。

1.2 方法

1.2.1 病毒RNA的提?。喊凑铡妒肿憧诓☆A防控制指南(2008版)》[1]的要求，吸取標本200 μL上清液提取病毒RNA。采用德國Qiagen公司生產(chǎn)的總RNA提取試劑盒提取病毒核酸，操作步驟按照試劑盒說明書進行。

1.2.2 標本熒光RT-PCR檢測:采用江蘇碩世生物科技有限公司生產(chǎn)的柯薩奇病毒CVA16型和腸道病毒EV71型+腸道病毒通用型核酸檢測試劑盒(2+1)，按照文獻[1]要求對各類標本進行熒光RT-PCR檢測，條件為：50℃ 30 min，循環(huán)1次；95 ℃ 5 min，循環(huán)1次；95 ℃ 10 s，55 ℃ 40 s(檢測熒光)，循環(huán)45次。結(jié)果判定：擴增曲線呈典型S形曲線且Ct值≤35的樣本為陽性，Ct值>35或無典型S形擴增曲線的標本為陰性。

1.2.3 病毒分離：核酸檢測EV71、CVA16陽性標本預處理后接種到單層、形態(tài)良好的Hep-2細胞和RD細胞上，每日觀察特征性腸道病毒致細胞病變效應(CPE)的出現(xiàn)，連續(xù)盲傳兩代，當CPE達到75%以上的細胞病變時收獲病毒，二代病毒滴度高于一代病毒,選用二代病毒進行鑒定[2]。

1.2.4 序列測定與分析：擴增PCR產(chǎn)物用Qiagen公司生產(chǎn)的QIAquick Gel Extraction Kit試劑盒純化，操作步驟按照試劑盒說明書進行，回收產(chǎn)物委托基因公司進行序列測定。測序結(jié)果用DNAstar軟件進行整理后構(gòu)建基因進化樹，確定基因亞型，并進行核苷酸與氨基酸序列同源性分析。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)病情況分析:8年累積報告4 238例手足口病，實驗室診斷1 082例，其余均為臨床診斷病例，重癥病例2例，無死亡病例。

2.2 地區(qū)分布:全市3個縣(區(qū))年平均報告發(fā)病率：大武口區(qū)114.1/10萬，惠農(nóng)區(qū)56.0/10萬，平羅縣50.8/10萬。兩區(qū)一縣年平均報告發(fā)病率差異有統(tǒng)計學意義(χ2=81.154,P<0.05)。

2.3 時間分布:從2008-2015年手足口病網(wǎng)絡直報情況看，每年6、7月達到高峰期，10、11月再次達到高峰期，2009、2012年全年發(fā)病主高峰期為10、11月，其他年份發(fā)病主高峰期均在6、7月。

表1 石嘴山市2008-2015年手足口病病原學構(gòu)成分布

2.4 年齡分布特征：發(fā)病年齡分布在40歲以下年齡組，病例年齡最大38歲，最小4個月；主要集中在0～6歲兒童，共報告發(fā)病3 979例，占報告發(fā)病總數(shù)的93.89%，其中年平均報告發(fā)病率最高是3歲組，各年齡組年平均報告發(fā)病率差異有統(tǒng)計學意義(χ2=151.708,P<0.05)。

2.5 性別分布特征:4 238例手足口病病例中，男性2 499例(58.97%)，女性1 739例(41.03%)，男、女性別比為1.44∶1。不同性別年平均報告發(fā)病率：男性84.791/10萬，女性61.413/10萬，不同性別年平均報告發(fā)病率差異有統(tǒng)計學意義(χ2=13.488,P<0.05)。

2.6 職業(yè)分布特征:從手足口病發(fā)病職業(yè)構(gòu)成可見，發(fā)病以散居兒童和托幼兒童為主，分別占報告發(fā)病總數(shù)的45.3%、48.9%，學生占5.9%，其他職業(yè)發(fā)病很少。

2.7 手足口病病原學分析

2.7.1 手足口病病原學構(gòu)成：在4 238份樣品中，手足口病核酸檢測陽性1 082份。其中CVA16病毒545份，構(gòu)成比50.37%；EV71病毒245份，構(gòu)成比22.64%；其他腸道病毒292份，構(gòu)成比26.99%。CVA16為主要病原體(χ2=188.430,P<0.05)。手足口病病毒分離：對核酸檢測陽性標本進行病毒分離，利用Hep-2細胞和RD細胞共分離出60株EV71和65株CVA16。

2.7.2 不同年份病原學分布：2014年以EV71為優(yōu)勢病原體，2009年以其他腸道病毒為優(yōu)勢病原體，其他年份均以CVA16為優(yōu)勢病原體。

2.7.3 不同地區(qū)手足口病病原學構(gòu)成分布：大武口區(qū)檢出手足口病病原體最多，達到50.74%。不同地區(qū)CVA16和其他腸道病毒檢出率差異有統(tǒng)計學意義(2CVA16=11.678,P<0.05；其他腸道病毒=9.441,P<0.05)

2.8 手足口病主要分離株基因分析

2.8.1 EV71親緣進化樹分析：根據(jù)2008-2015年全市50株EV71的VP1區(qū)全序列以及GenBank中EV71各基因型及亞型代表序列，構(gòu)建VP1區(qū)基因的EV71系統(tǒng)進化樹。進化關系顯示，全市EV71與C4亞型C4a分支處于同一個進化分支，與C4a親緣關系最近,確定全市EV71為C4基因亞型。與EV71原型株(HEV71/BrCr/USA/70)之間遺傳距離較遠,與2008年安徽阜陽株(EV71/Fuyang.Anhui.P.R.C/17.02/3-2008)和2009年山東株(ZB0002F/SD/CHN/2009/EV71-2009)遺傳距離較近，提示石嘴山市流行的EV71與其他省份流行的EV71處于共流行循環(huán)狀態(tài)。從進化樹中不難看出，石嘴山市所有EV71進化分支相對獨立，但是不同年份EV71集中分布于不同分支上，并且2008年EV71與其他年份遺傳距離較遠，提示EV71形成了比較獨立流行的狀態(tài)，并且病毒不斷進化變異。

2.8.2 EV71分離株VP1編碼基因核苷酸同源性分析:通過表2的分析可知，石嘴山市EV71與C型代表株C4亞型核苷酸同源性最高。同一年份EV71同源性均高于7年間分離株總的核苷酸同源性，石嘴山市流行的EV71在時間分布上存在遺傳進化差異。

表2 2008-2015年石嘴山市50株地方株EV71核苷酸同源性分析結(jié)果

2.8.3 CVA16進化樹分析:將58株CVA16與GenBank中獲得國內(nèi)外參考株VP1區(qū)基因序列一起構(gòu)建基于VP1基因序列的進化樹。從整體上看，2010-2015年全市CVA16的基因型為B1亞型，大部分CVA16分布在B1b基因亞型分支上。與2008年山東株(H060F/SD/CHN/2008)遺傳距離近，親緣性好，與國外的毒株遺傳距離較遠，親緣性差，說明石嘴山市的基因型與國內(nèi)其他省份存在共循環(huán)流行。但2010年3株和2015年1株分布在B1a基因亞型分支上，與其他毒株遺傳距離較遠，提示存在不同的傳播鏈。

2.8.4 CVA16分離株VP1編碼基因核苷酸同源性分析：通過表3的分析可知，石嘴山市CVA16與B型代表株B1亞型核苷酸同源性最高。各年份CVA16核苷酸同源性均高于6年來總的核苷酸同源性，石嘴山市流行的CVA16在時間分布上存在遺傳進化差異。

表3 2010-2015年石嘴山市58株地方株CVA16核苷酸同源性分析結(jié)果

3 討論

對手足口病疫情的監(jiān)測，摸清了石嘴山市手足口病發(fā)病特征，為采取防控措施提供了科學性依據(jù)。從兩區(qū)一縣每年的發(fā)病率來看，城區(qū)發(fā)病率明顯高于以農(nóng)村為主的平羅縣[2]，這可能是因為城區(qū)兒童入托率高于農(nóng)村兒童，幼兒園兒童較聚集，容易造成手足口病暴發(fā)傳播[3-4]；發(fā)病年齡主要集中在0～6歲，反映低齡兒童人群免疫力水平低，良好的衛(wèi)生習慣還沒有形成；以散居兒童和托幼兒童為主，這與國內(nèi)其他研究結(jié)果一致；男性發(fā)病率明顯高于女性，男、女性別比與寧夏手足口病病例性別比基本一致[5]，與男性活動范圍、活動內(nèi)容、活動強度和女性不同有關。

通過病原學監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，全市手足口病流行的主要病原體是CVA16，這與寧夏手足口病主要病原體是一致的[6]；但是不同年份流行的主要病原體也不相同，這與手足口病病毒血清型較多有關，人通過顯性感染和隱性感染后均可獲得比較牢固的特異性免疫力，不同血清型間鮮有交叉免疫[1]，當某一血清型形成免疫屏障時，就容易造成其他血清型手足口病病毒的流行；全市CVA16是B基因型B1亞型，這與寧夏、北京、南京等地研究是一致的，B1亞型在我國其他地區(qū)及周邊國家廣泛分布和流行[7-8]，表明全市CVA16與我國其他省市和周邊國家地區(qū)的CVA16存在共同進化共同循環(huán)。全市CVA16分屬于B1a和B1b兩條進化分支，表明這兩條進化分支的CVA16在全市共循環(huán)。全市EV71是C4亞型C4a分支，這與寧夏、杭州、南京等地研究也是一致的[3,8-10]，表明全市、全區(qū)、全國乃至亞太其他地區(qū)流行的EV71均以C4亞型為主[8]。從全市每年病原體檢測情況來看，全市手足口病以不同基因型或基因亞型的CVA16、EV71和其他腸道病毒共同循環(huán)。

為了有效控制手足口病的流行，一是要加強兒童父母以及托幼機構(gòu)衛(wèi)生知識宣教，培養(yǎng)父母和孩子良好的個人衛(wèi)生習慣，定期對孩子接觸物品進行清潔晾曬，室內(nèi)定時通風換氣。二是根據(jù)中國疾控中心《腸道病毒71型滅活疫苗使用技術指南》[11]，鼓勵0～5歲兒童接種疫苗，有效降低兒童手足口病的發(fā)病率。三是教育部門加強對托幼機構(gòu)的監(jiān)管力度，落實晨午檢等制度，及時采取措施控制疫情的發(fā)展。四是疾控機構(gòu)加強疫情監(jiān)測和病原體檢測，掌握疫情流行規(guī)律，關注病原體進化程度，根據(jù)病原譜的變化及時發(fā)布預警信息，從而有效控制手足口病的流行。

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10.13621/j.1001-5949.2017.09.0847

1.寧夏石嘴山市疾病預防控制中心，寧夏 石嘴山 753000 2.寧夏疾病預防控制中心，寧夏 銀川 750004

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2017-03-31責任編輯馬興忠