四倍體小麥Langdon HMT1基因的克隆及原核表達

吳麗軍，尚 玥，劉 韜，陳文杰，劉寶龍，張連全，劉登才，張 波，張懷剛

(1.中國科學(xué)院西北高原生物研究所，青海西寧 810001； 2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049； 3.青海省作物分子育種重點實驗室，青海西寧 810001； 4.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥研究所，四川成都 611130)

四倍體小麥Langdon HMT1基因的克隆及原核表達

吳麗軍1,2，尚 玥1,2，劉 韜1,2，陳文杰1,3，劉寶龍1,3，張連全4，劉登才4，張 波1,3，張懷剛1,3

(1.中國科學(xué)院西北高原生物研究所，青海西寧 810001； 2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049； 3.青海省作物分子育種重點實驗室，青海西寧 810001； 4.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥研究所，四川成都 611130)

硒是人類不可缺少的重要微量元素之一，人類必須補充足夠的硒才能保證身體健康。同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(homocysteine-S-methyltransferase，HMT)基因與植物富硒關(guān)鍵酶硒代半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(selenocysteine methyltransferase，SMT)基因同源。為了發(fā)掘并利用麥類作物中的富硒關(guān)鍵酶基因，基于NCBI已公布的節(jié)節(jié)麥(AegilopstauschiiCoss.)同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1基因( AetHMT1)的序列設(shè)計 HMT1基因的特異性引物H1-F/H1-R，克隆四倍體小麥Langdon HMT1的開放閱讀框(open reading frame，ORF)后進行序列分析，并通過原核表達驗證該基因。結(jié)果表明，利用H1-F/H1-R從四倍體小麥Langdon(LDN)克隆出兩條長度均為975 bp的序列，分別命名為 LDNHMT1-1和 LDNHMT1-2。 LDNHMT1-1、 LDNHMT1-2與 AetHMT1基因一樣，均編碼342個氨基酸，分子量大小分別為35.19 kDa和35.18 kDa。通過氨基酸序列比對和進化樹分析發(fā)現(xiàn)， LDNHMT1-1、LDNHMT1-2與其他HMT、SMT有較高的相似性。構(gòu)建原核表達載體，并通過SDS-PAGE鑒定，成功獲得 LDNHMT1-1、 LDNHMT1-2的原核表達菌株，且原核表達的蛋白質(zhì)與預(yù)測分子量大小一致。

四倍體小麥Langdon；硒；同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶；基因克?。辉吮磉_

Abstract: Selenium is one of the most important essential trace elements for humans and enough selenium must be supplemented to ensure body health. Homocysteine-S-methyltransferase(HMT) is homologous to selenocysteine methyltransferase(SMT),which is the key enzyme to enrich selenium for plants. In order to explore and use the key enzyme genes of selenium-rich in wheat crop,we designed especial primers H1-F/H1-R to clone the open reading frame(ORF) of the HMT1 in tetraploid wheat Langdon,based on the sequence of homocysteine-S-methyltransferase 1 gene fromAegilopstauschiiCoss.( AetHMT1) from NCBI and finally verified through the method of prokaryotic expression. The results showed that two sequences with the same size of 975 bp from Langdon(LDN) were cloned,respectively,named LDNHMT1-1 and LDNHMT1-2. Like the AetHMT1,the LDNHMT1-1 and LDNHMT1-2 genes both encode 342 amino acids,with the molecular weight of 35.19 kDa and 35.18 kDa,respectively. The LDNHMT1-1 and LDNHMT1-2 have high similarity with other HMTs and SMTs,based on amino acid sequence alignment and phylogenetic tree analysis. We successfully gained the prokaryotic expression strains of LDNHMT1-1 and LDNHMT1-2 by the way of constructing the prokaryotic expression vector and SDS-PAGE. The protein molecular weight of prokaryotic expression was consistent with the predicted one.

Keywords: Tetraploid wheat Langdon; Selenium; Homocysteine-S-methyltransferase; Gene cloning; Prokaryotic expression

硒是人類不可缺少的微量元素之一，而人體內(nèi)卻無法產(chǎn)生硒，必須通過食物補充足夠的硒才能保證身體健康[1]。無機硒對人體是有毒性的，依靠植物將無機硒轉(zhuǎn)化為有機硒可以被人類吸收利用[2]。自然界中富硒的植物不多，能用來日常補硒的更少。有研究表明，生物大分子的甲基化作用在信號傳導(dǎo)[3]、DNA修復(fù)[4]、生物大分子合成[5-6]和硒解毒[7-8]等過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[9]。而S-同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(homosysteine-S-methyltransferase,HMT)可以利用S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體將同型半胱氨酸(Hcy)轉(zhuǎn)化為S-腺苷同型半胱氨酸和甲硫氨酸[10]。此酶與植物富硒的關(guān)鍵酶硒代半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(selenocysteine methyltransferase,SMT)起源于同一祖先[11]，具有類似的活性結(jié)構(gòu)[12]。SMT可以將甲基轉(zhuǎn)入硒代半胱氨酸產(chǎn)生非蛋白氨基酸即硒甲基硒代半胱氨酸，在高硒植物的解除硒毒性中起著關(guān)鍵作用[13]。

四倍體硬粒小麥(AABB)作為普通小麥的近緣物種，在小麥中種植面積居第二，約占世界小麥的10%[14]。四倍體小麥Langdon具有硬粒小麥的共同特點，即耐旱、耐瘠薄、蛋白質(zhì)含量高、營養(yǎng)價值高和工藝性能好[15]，是小麥育種的優(yōu)異供體材料。S-同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶與植物富硒關(guān)鍵酶SMT結(jié)構(gòu)相似，具有類似的活性結(jié)構(gòu)，且甲基化對硒解毒[7-8]具有重要的調(diào)節(jié)作用[9]，據(jù)此推測其對硒的吸收可能具有調(diào)節(jié)作用。研究表明，節(jié)節(jié)麥(AegilopstauschiiCoss.)的硒含量要高于作為大部分地區(qū)主食的小麥[16]，且是小麥的二倍體供體祖先，可以以節(jié)節(jié)麥為基礎(chǔ)進行其他麥類作物的硒研究。節(jié)節(jié)麥 HMT1基因序列已公布，本研究根據(jù)已公布的節(jié)節(jié)麥 HMT1基因，研究四倍體硬粒小麥Langdon中的 HMT1基因，以期為富硒小麥的研究打下理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試材料

供試材料為四倍體硬粒小麥Langdon，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)提供，并由青海省作物分子育種重點實驗室繁育、保存。

1.1.2 主要試劑

1.2 方 法

1.2.1 總RNA的提取及cDNA第一條鏈的合成

培養(yǎng)Langdon至三葉一心期，用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取葉片總RNA，并用1.0%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測RNA的完整性及濃度，最后保存于-80 ℃?zhèn)溆谩Ｒ設(shè)ligo(dT)18為引物，以1 μg總RNA為模板，按照RevertAid第一鏈cDNA合成試劑盒的操作說明書合成第一鏈cDNA。

1.2.2 HMT1基因的PCR擴增

根據(jù)NCBI已公布的節(jié)節(jié)麥 HMT1基因(KD510783.1)序列，利用Primer Premier 5.0設(shè)計可擴增 HMT1基因完整編碼區(qū)的特異性引物H1-F/H1-R(H1-F：5′-ATGGCCGGGGTGGTG GA-3′，H1-R：5′-TCACTGGCCGTTCCTGCT CTT-3′)，并交由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。以Langdon葉片總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，利用引物H1-F/H1-R進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系20 μL：模板cDNA 0.5 μL，上下游引物各0.5 μL，Phusion DNA聚合酶0.2 μL，5×HF buffer 4 μL，dNTPs 1.6 μL，ddH2O 12.7 μL。PCR反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s，69 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳30 min分離檢測PCR產(chǎn)物并切膠回收純化目的條帶(回收步驟參照DNA凝膠回收純化試劑盒說明)，最后72 ℃ 30 min加A，體系為：每20 μL產(chǎn)物加10×buffer 2 μL，dNTPs 1.6 μL，TaqDNA聚合酶0.2 μL。

1.2.3 HMT1基因的克隆及測序

將已獲得的PCR產(chǎn)物與pGEM-T Easy載體于4 ℃條件下過夜連接，反應(yīng)體系(10 μL)：回收產(chǎn)物3.5 μL，pGEM-T Easy載體1 μL，T4DNA連接酶1 μL，2×連接buffer 5 μL。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α中，涂布在含有100 μg·mL-1氨芐青霉素(ampicillin，AMP)的LB固體培養(yǎng)基上過夜培養(yǎng)，挑取生長良好的單個白色菌落，劃線并編號。利用T7、SP6通用引物進行菌落PCR，反應(yīng)體系20 μL：模板用牙簽蘸取少許菌，引物各0.5 μL，TaqDNA聚合酶0.2 μL，10×buffer 2 μL，dNTPs 1.6 μL，ddH2O 15.2 μL。PCR反應(yīng)程序為95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性30 s，46 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳30 min篩選陽性克隆，挑選5個獨立的陽性克隆，送至北京六合華大科技股份有限公司進行測序。

1.2.4 序列分析

采用NCBI網(wǎng)站的BLASTn工具(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)在線比對測序得到的序列并判斷其屬性，同時在線搜索與其同源的核苷酸及氨基酸序列；將利用Vector NTI 10.0軟件對測得的完整編碼區(qū)序列進行蛋白質(zhì)翻譯及多序列比對等處理；利用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)在線對蛋白理化性質(zhì)進行預(yù)測；利用ScanProsite(http://prosite.expasy.org/scanprosite/)在線對蛋白結(jié)構(gòu)進行預(yù)測；利用Vector NTI 10.0和DNAMAN 8.0進行序列分析；利用MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)演化樹[3]。

1.2.5 重組表達載體的構(gòu)建

根據(jù)已獲得的目的基因序列及原核表達載體pET-30a-c(+)的多克隆位點序列設(shè)計一對含有酶切位點的引物BH1-F/HH1-R(BH1-F：5′-CGCGGATCCGCGATGGCCGGGGTGGTGGA -3′，劃線處為BamHⅠ酶切位點；HH1-R：5′-CCCAAGCTTGGGTCACTGGCCGTTCCTGC TCTT-3′，劃線處為HindⅢ酶切位點)。參照1.2.2和1.2.3的方法獲得具有酶切位點的目的片段的單克隆菌株。擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，用引物BH1-F/HH1-R對質(zhì)粒進行 PCR擴增，擴增程序及體系參照引物H1-F/H1-R，進而獲得大量含有酶切位點的目的片段。同時擴大培養(yǎng)帶有pET-30a-c(+)載體的菌株，提取質(zhì)粒。

將回收片段和pET-30a-c(+)載體同時進行37 ℃水浴30 min雙酶切。體系為50 μL，包括10×Smart buffer 5 μL、BamHⅠ1 μL、HindⅢ1 μL、質(zhì)粒或PCR回收產(chǎn)物小于1 μg，補ddH2O至50 μL。酶切后的目的條帶和pET-30a-c(+)載體回收純化后按3∶1的摩爾比混勻，加入2×連接buffer 5 μL及T4DNA連接酶1 μL后于4 ℃過夜連接。

將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α中，以T7/T7 ter為引物，進行PCR擴增，篩選陽性克隆。PCR擴增程序參考引物T7/SP6，退火溫度為58 ℃。挑選10個獨立陽性克隆送至北京六合華大基因有限公司進行測序鑒定。

1.2.6 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達

提取測序鑒定正確的陽性克隆菌株的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至原核表達菌株BL21(DE3)，并過夜培養(yǎng)。取過夜培養(yǎng)的菌液100 μL接種于5 mL含100 mg·L-1卡納霉素(kanamycin，Kana)的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、200 r·min-1振蕩2 h左右，至OD600值為0.6～0.8，加入IPTG進行誘導(dǎo)表達。為了盡可能獲得目的蛋白，設(shè)置不同IPTG終濃度：0、0.01、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mmol·L-1，震蕩3 h后，分別收集誘導(dǎo)菌液于4 ℃ 保存?zhèn)溆?。選擇誘導(dǎo)蛋白質(zhì)量最多的IPTG濃度作為IPTG誘導(dǎo)濃度，設(shè)置不同的誘導(dǎo)時間：1、2、3、4、5、6、8、10 h，分別收集誘導(dǎo)菌液于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 重組蛋白的SDS-PAGE檢測

將1.2.6中得到的菌液樣品12 000 r·min-1離心5 min，棄上清，加入200 μL蛋白質(zhì)提取液，沸水煮5 min，12 000 r·min-1離心3 min。取上清用10%的SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，電泳結(jié)束后進行考馬斯亮藍染色3 h，倒掉染色液，再用脫色液(冰乙酸：乙醇：水=1∶3∶6)脫色，檢測蛋白質(zhì)的表達情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 四倍體小麥Langdon HMT1基因的克隆及其核酸序列分析

利用引物H1-F/H1-R對Langdon葉片cDNA進行PCR擴增，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，得到大小約為1 000 bp的特異性條帶(圖1)，與預(yù)期片段大小(975 bp)相符。將擴增產(chǎn)物回收、加A后連接到T載體，轉(zhuǎn)入DH5α，獲得陽性單克隆菌株后測序，結(jié)果顯示，獲得的目的片段長度為975 bp。與NCBI數(shù)據(jù)庫公布的節(jié)節(jié)麥AS2407 HMT1基因 AetHMT1 相比，四倍體小麥Langdon的核苷酸序列發(fā)生了變化(圖2)，克隆出兩條不同的條帶，與 AetHMT1的相似度極高，因此，其中一條命名為 LDNHMT1-1，另一條命名為 LDNHMT1-2。 LDNHMT1-1與 LDNHMT1-2的相似度高達95.6%， LDNHMT1-1與 AetHMT1的相似度高達95.1%， LDNHMT1-2與 AetHMT1的相似度高達96.4%，其中 LDNHMT1-1的核苷酸序列在54、84、93、108、189、201、225、232、240、244、282、294、296、300、306、331、333、335、336、339、357、363、366、381、387、393、399、402、423、426、429、441、494、501、588、591、636、639、684、702、744、751、840、843、846、871、906和948共48個位點與 AetHMT1不同。 LDNHMT1-2的核苷酸序列在84、106、108、120、189、225、232、244、252、363、366、372、393、402、423、429、441、445、447、494、498、547、567、577、591、636、639、661、702、840、843、846、855、906和934共35個位點與 AetHMT1不同。其中，Langdon兩條序列都發(fā)生了變化的位點有84、108、189、225、232、244、363、366、393、402、423、429、441、494、591、636、639、702、840、843、846、906共22個，除366、402、494和906位點外，另外18個位點發(fā)生改變的結(jié)果一樣。

M：核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)；1和2：2次重復(fù)。

M:DNA marker; 1 and 2：Two replicates.

圖1LangdonHMT1基因的PCR擴增結(jié)果

Fig.1PCRamplificationresultofHMT1geneinLangdon

2.2 四倍體小麥Langdon HMT1編碼氨基酸序列的比較分析

根據(jù)已知的測序結(jié)果，對 LDNHMT1-1和 LDNHMT1-2進行翻譯，然后與實驗室前期獲得的 AetHMT1預(yù)測結(jié)果進行比較，結(jié)果(圖3)顯示，核苷酸序列的變化導(dǎo)致氨基酸序列也發(fā)生了變化。LDNHMT1-1與 LDNHMT1-2的相似度高達95.6%，LDNHMT1-1與AetHMT1的相似度高達98.1%，LDNHMT1-2與AetHMT1的相似度高達98.1%。與AetHMT1相比，LDNHMT1-1氨基酸序列在99、112、165、248、251和316共6個位點上發(fā)生了變化，這是由7個氨基酸堿基變化導(dǎo)致的，說明41個核苷酸堿基的變化是同義突變，錯義突變率為14.58%。而LDNHMT1-2在36、149、165、183、193和221共6個位點上發(fā)生了變化，這是由8個氨基酸堿基的變化引起的，說明27個核苷酸堿基的變化是同義突變，錯義突變率為22.86%。且在165位點上兩條序列均發(fā)生突變，且變異結(jié)果不一致。利用ProtParam對所得到氨基酸序列進行蛋白理化性質(zhì)預(yù)測，結(jié)果可知， LDNHMT1-1、 LDNHMT1-2氨基酸的數(shù)量均為324，分子量分別為35.19和35.18 kDa；pI理論值分別為5.74和5.94。

目前，研究人員已經(jīng)從其他物種中克隆出SMT和HMT，例如黃芪SMT(AbSMT)[17]、擬南芥HMT1(AtHMT1)[18]、羽衣甘藍SMT(BoSMT)[12]、茶樹SMT(CsSMT)[13]等。 LDNHMT1-1、LDNHMT1-2和其他甲基轉(zhuǎn)移酶序列比對分析發(fā)現(xiàn)，LDNHMT1-1、LDNHMT1-2和其他SMT、HMT一樣：C端附近有在鋅鏈結(jié)構(gòu)中扮演著重要的角色[19-21]的一個保守GGCCR序列和三個守恒的半胱氨酸殘基：Cys236、Cys303、Cys304[18,22]，且都沒有明顯的葉綠體和線粒體靶向序列[22](圖3)。

字體背景為黑色代表核苷酸堿基序列發(fā)生改變。

The nucleotide base mutations are shown with black background.

圖2LDNHMT1-1、LDNHMT1-2和AetHMT1的核苷酸序列比對

Fig.2NucleotidesequencealignmentofLDNHMT1-1,LDNHMT1-2andAetHMT1

2.3 四倍體小麥Langdon HMT1的系統(tǒng)進化分析

通過進化樹分析(圖4)發(fā)現(xiàn)，LND HMT1-1、LND HMT1-2與節(jié)節(jié)麥HMT(AetHMT1)的相似度分別高達98.15%、98.50%，與黃芪SMT(AbSMT)的相似度分別高達49.70%、50.30%，與羽衣甘藍SMT(BoSMT)的相似度分別高達52.31%、51.45%，與茶樹SMT(CsSMT)的相似度分別高達49.86%、49.29%，與烏拉爾圖小麥HMT1(TuHMT1)的相似度分別高達89.37%、92.24%，與擬南芥HMT1(AtHMT1)的相似度分別高達65.65%、65.65%，與玉米HMT1(ZmHMT1)的相似度分別高達87.04%、85.49%。

較高的同源性使得SMT與HMT具有共同促進半胱氨酸作用[23]，說明SMT和HMT可能源自一個共同的祖先，在功能上是相關(guān)的。HMT、SMT不同的保守氨基酸可能負責(zé)不同的酶催化能力[11]。

2.4 原核表達載體的構(gòu)建和重組子的鑒定結(jié)果

利用引物BH1-F/HH1-R對Langdon葉片cDNA進行PCR擴增，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，均得到含有酶切位點、大小約為1 000 bp的特異性條帶，分別將擴增產(chǎn)物回收、加A后連接到T載體進行測序，從Langdon克隆獲得的質(zhì)粒命名為pGEM-BH- LDNHMT1。BamHⅠ 和HindⅢ對pGEM-BH- LDNHMT1和pET-30a-c(+)分別雙酶切并進行鑒定，酶切產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠檢測，結(jié)果顯示，酶切后pET-30a-c(+)在5 000 bp附近出現(xiàn)一條亮帶，而pGEM-BH- LDNHMT1則在1 000 bp處出現(xiàn)亮帶(圖5)。此外，連接重組后表達質(zhì)粒的測序結(jié)果與克隆序列完全一致，Langdon同樣得到兩條序列，并且開放閱讀框正確，因此，將獲得的Langdon HMT1原核表達質(zhì)粒分別命名為pET-BH-LDNHMT1-1和pET-BH- LDNHMT1-2。表明Langdon HMT1基因原核表達載體構(gòu)建成功。

黑色背景表示序列保守；短線表示間斷；單箭頭表示第三個半胱氨酸殘基；雙箭頭表示可能的Z鏈結(jié)構(gòu)；紅框代表LDNHMT1-1、LDNHMT1-2與AetHMT1相比，氨基酸發(fā)生變化的位點；AetHMT1、TuHMT1、AtHMT1、ZmHMT1分別代表節(jié)節(jié)麥、烏拉爾圖小麥、擬南芥、玉米同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(EMT27714.1、EMS47619.1、AAF23821、AF297045)；CsSMT、BoSMT、AbSMT分別代表茶樹、羽衣甘藍、黃芪硒代半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(ABF47292.1、AY817737、CAA10368)。

Conserved residues are shaded in black;Stub depicting gaps were added for optimum alignment;The arrowhead indicates the third conserved Cys residue;The double-headed arrow shows the possible zinc-binding motif;The red frames indicate the changed amino acids of LDNHMT1-1 and LDNHMT1-2,compared with AetHMT1;AetHMT1,TuHMT1,AtHMT1 and ZmHMT1 represent HMT1s ofAegilopstauschiiCoss.(EMT27714.1),Triticumurartu(EMS47619.1),Arabidopsis(AAF23821) andZeamays(AF297045);CsSMT,BoSMT and AbSMT represent SMTs ofCamelliasinensis(ABF47292.1),Brassicaoleracea(AY817737) andA.bisulcatus(CAA10368).

圖3LDNHMT1-1、LDNHMT1-2及其同源基因編碼氨基酸序列的比對

Fig.3AlignmentofaminoacidsequencesencodedbyLDNHMT1-1,LDNHMT1-2andotherhomologousgenes

圖4 LDNHMT1-1、LDNHMT1-2和其他相關(guān)物種蛋白質(zhì)序列的進化樹分析

M：核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道1為Langdon HMT1基因雙酶切后的結(jié)果；泳道2為pET-30a-c(+)雙酶切后的結(jié)果。

M：DNA marker;1：The product of HMT1 gene in Langdon digested withBamHⅠ andHindⅢ; 2：The product of pET-30a-c(+) digested withBamHⅠ andHindⅢ.

圖5LangdonHMT1基因和質(zhì)粒pET-30a-c(+)的酶切鑒定結(jié)果

Fig.5TheproductsofHMT1inLangdonandpET-30a-c(+)digestedwithrestrictenzyme

2.5 目的蛋白的誘導(dǎo)表達

將測序正確的pET-BH- LDNHMT1-1轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)后，經(jīng)不同濃度的IPTG和不同時間誘導(dǎo)表達，SDS-PAGE分析結(jié)果(圖6)表明，重組質(zhì)粒 pET-BH- LDNHMT1-1產(chǎn)生了一條約34 kDa的條帶，與理論分子量大小相符；在200 r·min-1、37 ℃、3 h的培養(yǎng)條件下，目的蛋白的表達量在IPTG濃度為0.2 mmol·L-1時表達量最高；在200 r·min-1、37 ℃、IPTG 0.2 mmol·L-1的培養(yǎng)條件下，3 h后目的蛋白的表達量達到最高。說明 HMT1的最佳誘導(dǎo)條件為IPTG 濃度為0.2 mmol·L-1、誘導(dǎo)時間為3 h。同樣，將測序正確的pET-BH- LDNHMT1-2轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)后，經(jīng)0.2 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)表達3 h，與LDNHMT1-1蛋白一起進行SDS-PAGE分析。結(jié)果(圖7)表明，重組質(zhì)粒pET-BH- LDNHMT1-2與pET-BH- LDNHMT1-1一樣也產(chǎn)生了約34 kDa的條帶，與理論分子量大小相符。

M：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；pET：空載體；A圖泳道上方數(shù)字表示誘導(dǎo)濃度，單位為mmol·L-1；B圖泳道上方數(shù)字表示誘導(dǎo)時間，單位為h；箭頭所指為誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)。

M：Protein molecular weight marker; pET：The pET-30a-c(+) vector; The number above the lane in Figure 6A indicates the induction concentration(mmol·L-1) of IPTG; The number above the lane in Figure 6B indicates the induction time(h);Arrows indicate the induced proteins.

圖6在不同誘導(dǎo)濃度(A)和誘導(dǎo)時間(B)下LDNHMT1-1基因原核表達產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測結(jié)果

Fig.6ExpressionoftheplasmidswithLDNHMT1-1withdifferentinductionconcentrations(A)anddifferentinductiontime(B)detectedbySDS-PAGE

3 討 論

高濃度的硒對動植物具有毒害作用[24]，研究麥類作物的硒代謝，挖掘關(guān)鍵酶基因，培育或改良富硒作物具有重要的意義。硒代半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(SMT)是植物硒代謝途徑中的一個關(guān)鍵酶，而同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(HMT)與SMT起源于同一祖先，具有類似的活性結(jié)構(gòu)。目前，對于麥類作物富硒的關(guān)鍵酶基因研究較少。本研究以四倍體硬粒小麥Langdon為研究對象，克隆獲得HMT1基因的ORF序列。核苷酸序列分析顯示，Langdon中克隆出與 AetHMT1大小相同(975 bp)且序列發(fā)生變化的兩條序列，其中一條命名為 LDNHMT1-1，另一條命名為 LDNHMT1-2。小麥?zhǔn)橇扼w植物，包括A、B、D三個基因組[25]，節(jié)節(jié)麥?zhǔn)瞧胀ㄐ←淒染色體組的供體[26]，Langdon是含有A、B染色體組的硬粒小麥[15]，三個基因組之間具有部分同源性。 LDNHMT1-1、 LDNHMT1-2基因克隆自Langdon(小麥A、B組染色體)，根據(jù)聚類分析結(jié)果， LDNHMT1-2與烏拉爾圖小麥 HMT1(TuHMT1)在進化上的關(guān)系極近，而烏拉爾圖小麥(Triticumurartu)是小麥屬的二倍體種之一，是四倍體小麥和普通小麥A基因組的供體[27]， LDNHMT1-2很可能來自A染色體組，那么 LDNHMT1-1極有可能來自B染色體組。

M：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：空載體；2：LDNHMT1-1蛋白；3：LDNHMT1-2蛋白；箭頭所指為誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)。

M：Protein molecular weight marker; 1：The pET-30a-c(+) vector; 2：Expressed protein of LDNHMT1-1; 3：Expressed protein of LDNHMT1-2; Arrow indicates the induced protein.

圖7最佳誘導(dǎo)條件下LDNHMT1-1和LDNHMT1-2基因原核表達蛋白的SDS-PAGE檢測結(jié)果

Fig.7ExpressionoftheplasmidswithLDNHMT1-1andLDNHMT1-2undertheoptimumconditiondetectedbySDS-PAGE

對 LDNHMT1-1、LDNHMT1-2所編碼氨基酸進行分析發(fā)現(xiàn)，二者的氨基酸數(shù)量均為324，核苷酸的變化導(dǎo)致部分氨基酸序列也會發(fā)生變化，進而分子量也發(fā)生了變化，分子量分別為35.19、35.18 kDa。它們和其他相關(guān)SMT、HMT一樣，C端附近有在鋅鏈結(jié)構(gòu)中扮演著重要的角色[19-21]的一個保守的GGCCR序列和三個守恒的半胱氨酸殘基：Cys236、Cys303、Cys304[19,24]，且都沒有明顯的葉綠體和線粒體靶向序列[22]。進一步通過進化樹分析發(fā)現(xiàn)，LNDHMT1-1、LNDHMT1-2和SMT具有較高的同源性，有共同促進半胱氨酸作用[23]，SMT和HMT可能來自同一個祖先，在功能上是相關(guān)的。HMT、SMT不同的保守氨基酸可能負責(zé)不同的酶催化能力[11]。LNDHMT1-1和LNDHMT1-2酶催化能力是否也是如此，有待進一步考證。

將構(gòu)建成功的含有 LNDHMT1-1和 LNDHMT1-2的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌 BL21(DE3)后，經(jīng)不同濃度的IPTG 和不同時間誘導(dǎo)表達，確定最佳誘導(dǎo)表達條件為：IPTG濃度為0.2 mmol·L-1，誘導(dǎo)時間為3 h，最終得到Langdon的兩種HMTI蛋白質(zhì)。然而，Langdon HMT1蛋白質(zhì)是否具有活性、酶活大小以及與硒吸收的關(guān)系，還有待于進一步運用分子生物學(xué)手段等進行研究。

[1] RAYMAN M P.The importance of selenium to human health [J].TheLancet,2000,356(9225):233.

[2] LYONS G,STANGOULIS J,GRAHAM R.High-selenium wheat:Biofortification for better health [J].NutritionResearchReviews,2003,16(1):45.

[3] BEDFORD M T,RICHARD S.Arginine methylation:An emerging regulator of protein function [J].MolecularCell,2005,18(3):265.

[4] BEDFORD M T,CLARKE S G.Protein arginine methylation in mammals:Who,what,and why [J].MolecularCell,2009,33(1):7.

[5] CHENG X D,BLUMENTHAL R M.S-adenosylmethionine-dependent Methyltransferases:Structures and Functions [M].Singapore:World Seientific Publishing Co.Pte.Ltd,1999:5.

[6] CLARKE S G,TAMANOI F.Protein Methyltransferases [M].Cambridge,Massachusetts,UK:-Academic Press 2006:4.

[7] HYMER C B,CARUSO J A.Selenium speciation analysis using inductively coupled plasma-mass spectrometry [J].JournalofChromatographyA,2006,1114(1):2.

[8] SPALLHOLZ J E.Free radical generation by selenium compounds and their prooxidant toxicity [J].BiomedicalandEnvironmentalSciences,1997,10(2-3):260.

[9] 谷勁松,譚曉軍.一種S-腺苷甲硫氨酸依賴的甲基轉(zhuǎn)移酶活性的檢測方法[J].高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報,2012,33(3):521.

GU J S,TAN X J.Enzymatic analysis method for adomet-dependent methyltransferases [J].ChemicalJournalofChineseUniversities,2012,33(3):521.

[10] BREKSA A P,GARROW T A.Recombinant human liver betaine-homocysteine S-methyltransferase:Identification of three cysteine residues critical for zinc binding [J].Biochemistry,1999,38(42):13991.

[11] ZHAO D Y,SUN F L,ZHANG B,etal.Systematic comparisons of orthologous selenocysteine methyltransferase and homocysteine methyltransferase genes from seven monocots species [J].NotulaeScientiaBiologicae,2015,7(2):211.

[12] LYI S M,ZHOU X,KOCHIAN L V,etal.Biochemical and molecular characterization of the homocysteine S-methyltransferase from broccoli(Brassicaoleraceavar.italica) [J].Phytochemistry,2007,68(8):1114.

[13] ZHU L,JIANG C J,DENG W W,etal.Cloning and expression of selenocysteine methyltransferase cDNA fromCamelliasinensis[J].ActaPhysiologiaePlantarum,2007,30(2):170.

[14] 嚴(yán) 俊,張玲玲,王興梅,等.四倍體小麥產(chǎn)量相關(guān)性狀QTL的定位與分析[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2011,42(2):164.

YAN J,ZHANG L L,WANG X M,etal.QTL mapping of yield-related traits in durum wheat ×wild emmer wheat population [J].JournalofShandongAgriculturalUniversity(NaturalScience),2011,42(2):164.

[15] 任 志.硬粒小麥的研究與利用[J].麥類作物學(xué)報,1985(1):18.

REN Z.Research and utilization ofTriticumdurumDesf [J].JournalofTriticeaeCrops,1985(1):18.

[16] 趙德勇.小麥氮利用效率改良與鋅、鐵、硒富集評價[D].北京:中國科學(xué)院大學(xué),2015:93.

ZHAO D Y.Genetical evaluation of nitrogen,zinc,iron,selenium utilisation efficiency in wheat [D].Beijing:University of Chinese Academy of Science,2015:93.

[18] RANOCHA P,BOURGIS F,ZIEMAK M J,etal.Characterization and functional expression of cDNAs encoding methionine-sensitive and -insensitive homocysteine S-methyltransferases fromArabidopsis[J].TheJournalofBiologicalChemistry,2000,275(21):15962.

[19] MILLIAN N S,GARROW T A.Human betaine-homocysteine methyltransferase is a zinc metalloenzyme [J].ArchivesofBiochemistry&Biophysics,1998,356(1):93.

[20] PEARISO K,GOULDING C W,HUANG S,etal.Characterization of the zinc binding site in methionine synthase enzymes ofEscherichiacoli:The role of zinc in the methylation of homocysteine [J].JournaloftheAmericanChemicalSociety,1998,120(33):8410.

[21] KOUTMOS M,PEJCHAL R,BOMER T M,etal.Metal active site elasticity linked to activation of homocysteine in methionine synthases [J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2008,105(9):3286.

[22] LYI S M,HELLER L I,RUTZKE M,etal.Molecular and biochemical characterization of the selenocysteine Se-methyltransferase gene and Se-methylselenocysteine synthesis in broccoli [J].PlantPhysiology,2005,138(1):411.

[23] SORS T G,MARTIN C P,SALT D E.Characterization of selenocysteine methyltransferases fromAstragalusspecieswith contrasting selenium accumulation capacity [J].PlantJournal,2009,59(1):111.

[24] 劉聲傳,鄢東海,周 雪,等.茶樹CsSMT基因的克隆、原核表達及植物超表達載體構(gòu)建 [J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報,2016,29(7):1540.

LIU S C,YAN D H,ZHOU X,etal.Cloning and prokaryotic expression of selenocysteine methyltransferase gene from tea plant and its plant overexpression vector construction [J].SouthwestChinaJournalofAgriculturalSciences,2016,29(7):1540.

[25] 趙永濤.四倍體小麥低分子量麥谷蛋白基因家族的研究[D].鄭州:河南農(nóng)業(yè)大學(xué),2008:12.

ZHAO Y T.Study on LMW glutenin gene family in tetraploid wheat [D].Zhengzhou:Henan Agricultural University,2008:12.

[26] 張海泉,郎 杰.節(jié)節(jié)麥抗小麥白粉病基因的SSR定位[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,46(3):335.

ZHANG H Q,LANG J.Studies on SSR markers of powdery mildew resistance genes ofAe.tauschii[J].HubeiAgriculturalSciences,2007,46(3):335.

[27] 張效梅,白建榮,賈 旭.烏拉爾圖小麥的遺傳學(xué)研究進展 [J].西北植物學(xué)報,2004,24(10):1972.

ZHANG X M,BAI J R,JIA X.Progress in genetics ofTriticumurartu[J].ActaBotanicaBoreali-OccidentaliaSinica,2004,24(10):1972.

CloningandProkaryoticExpressionAnalysisofHMT1GeneinTetraploidWheatLangdon

WULijun1,2,SHANGYue1,2,LIUTao1,2,CHENWenjie1,3,LIUBaolong1,3,ZHANGLianquan4,LIUDengcai4,ZHANGBo1,3,ZHANGHuaigang1,3
(1.Northwest Institute of Plateau Biology,Chinese Academy of Sciences,Xining,Qinghai 810001,China; 2.University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China; 3.Qinghai Province Key Laboratory of Crop Molecular Breeding,Xining,Qinghai 810008,China; 4.Triticeae Research Institute,Sichuan Agricultural University,Chengdu,Sichuan 611130,China)

時間：2017-09-13

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20170913.1138.002.html

S512.1；S330

A

1009-1041(2017)09-1139-09

2017-03-03

2017-07-01

國家自然科學(xué)基金項目(31101140)；中國科學(xué)院戰(zhàn)略性A類先導(dǎo)科技專項子課題(XDA08030106)；中國科學(xué)院西部之光一般項目；青海省重點研發(fā)與轉(zhuǎn)化計劃項目(2016-HZ-808)；青海省高原作物種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用國家重點實驗室培育基地開放課題(2014-09)

E-mail：wljd126@126.com

張 波(E-mail:zhangbo@nwipb.cas.cn)；張懷剛(E-mail:hgzhang@nwipb.cas.cn)