小興安嶺地區(qū)野生藍莓菌根真菌的分離和鑒定

賈鵬博，姜秀煜，王玉紅，陳維建

(1.黑龍江省帶嶺林業(yè)科學(xué)研究所，黑龍江 伊春 153103；2.吉林省林業(yè)調(diào)查規(guī)劃院)

小興安嶺地區(qū)野生藍莓菌根真菌的分離和鑒定

賈鵬博1，姜秀煜1，王玉紅1，陳維建2

(1.黑龍江省帶嶺林業(yè)科學(xué)研究所，黑龍江 伊春 153103；2.吉林省林業(yè)調(diào)查規(guī)劃院)

試驗利用2種不同的根段消毒方法從野生藍莓植株的根系內(nèi)分離出9株菌根真菌，其中5株分別命名為L1-L5，并對其進行形態(tài)觀察與分子生物學(xué)鑒定，篩選出其中3株為杜鵑花科菌根真菌，結(jié)果如下：菌株L1屬于杜鵑花類菌根真菌Meliniomycesvariabilis屬真菌；菌株L2、L3為Phialocephalafortinii杜鵑花科菌根真菌；L4、L5為Fusariumoxysporum鐮刀菌屬。

野生藍莓;菌根真菌;分離;鑒定

藍莓(Blue Berry)為杜鵑花科(Ericaceae)越桔屬(VacciniumLinn.)植物，多年生灌木，其果實營養(yǎng)豐富，經(jīng)濟效益高，是潛力巨大的經(jīng)濟林樹種。它為淺根系植物，根系不發(fā)達，無根毛，主要分布在淺土層。在自然條件下，藍莓根系通常易與杜鵑花類菌根真菌形成互利共生的關(guān)系，它們形成一種特殊的菌根結(jié)構(gòu)(又稱歐石楠類菌根，ERM)。這類菌根可以促進藍莓對營養(yǎng)元素的吸收，它可以幫助藍莓直接利用土壤中的有機氮，并促進其對無機氮的吸收；促進藍莓對難溶性P，特別是無機P 的吸收；還可以促進藍莓對S、Ca、Cu、Zn、Mn、Fe 等其他元素的吸收；而當(dāng)重金屬元素供應(yīng)過量時，又能起到緩解作用，有菌根真菌侵染的植株，明顯表現(xiàn)出生長量大而且產(chǎn)量高[1]。菌根真菌還可以分泌有機酸，促使一些不易溶解的無機和有機化合物轉(zhuǎn)化為可溶態(tài)養(yǎng)分，被藍莓吸收。

篤斯越桔(Vacciniumuliginosum)，又稱野生藍莓，在小興安嶺地區(qū)資源豐富，蘊含豐富的菌根真菌資源。本試驗觀察并分離小興安嶺地區(qū)篤斯越桔的菌根真菌，并對分離出的菌根真菌進行鑒定，為進一步保護和應(yīng)用野生藍莓菌根真菌資源做好基礎(chǔ)工作。

1 試驗材料

1.1 植物材料

2015年5月從伊春市友好區(qū)翠北林場采集健康野生藍莓附帶根基土壤的根樣，用已滅菌的采樣袋帶回實驗室，存放在4℃冰箱內(nèi)，盡快取樣并觀察、分離菌根真菌。

1.2 菌種用培養(yǎng)基

分離菌種采用PDA培養(yǎng)基：配置1L溶液所需材料(馬鈴薯去皮切成小塊200 g，葡萄糖20g，瓊脂16～18g，蒸餾水1000mL)，于電磁爐上煮沸保持20min，用4層紗布過濾得到濾液，pH自然；121℃滅菌20min，待用[2]。

2 試驗方法

2.1 根樣品預(yù)處理

取出野生藍莓菌根真菌根樣，選擇新鮮、健康的根樣，輕輕去除其表面的苔蘚及土壤，放在自來水下沖洗，沖洗時間約為2h，沖洗干凈后的菌根用干凈的吸水紙吸掉根表面的水分，剪成0.5cm的根段，備用。

2.2 侵染率計算

將預(yù)處理根樣于FAA固定液中固定24h，取出后放在10%KOH溶液中水浴(90℃)20～60min；然后取出用自來水輕輕沖洗根系至無色；將上述處理的根段進行錐蟲藍染色(染液配方：錐蟲藍0.05g+苯酚20g+乳酸20mL+甘油40mL+蒸餾水20mL)，室溫下12h；將染色的根段取出于甘油中脫色，于光學(xué)顯微鏡下觀察，計算侵染率。

2.3 菌根菌的分離、純化

采用PDA培養(yǎng)基，利用根段直接分離法分離菌根真菌。將洗凈的根系，用以下兩種方式進行根系表面滅菌：①將根段放入75%的酒精溶液中，滅菌30s，用無菌水沖洗3次，然后用0.1%的氯化汞溶液消毒2min，無菌水沖洗3次。②將根段放入75%的酒精溶液中滅菌2min，再用5%NaClO溶液浸泡12min，用無菌水沖洗3次。在超凈工作臺中將滅菌的根段切成1cm長，將根段放入平皿上，每個培養(yǎng)皿中放入3個根段，將培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中，25℃恒溫避光倒置培養(yǎng)，每種處理設(shè)3個重復(fù)。待根段切口處長出菌絲后用接種環(huán)挑取菌絲將其移至無菌空白PDA培養(yǎng)基上進行純化培養(yǎng)，直至得到單一菌落。

2.4 菌根真菌鑒定

2.4.1 形態(tài)觀察。將純化后的菌種在PDA培養(yǎng)基上進行純培養(yǎng)后，對其菌落的形態(tài)特征進行觀察和記錄。

2.4.2 分子鑒定

2.4.2.1 儀器耗材：通過rDNA的18S序列進行菌株鑒定。

表1 實驗主要儀器耗材

(1)真菌基因組提取

1)從培養(yǎng)基中挑取真菌，盡量去除瓊脂。

2)加入200μL植物lysis buf，研磨至粉狀。

3)加入600μL植物lysis buf，0.8μL β巰基乙醇，充分混勻。

4)65℃水浴40min，12000rpm，10min離心。

5)去上清，加等體積氯仿抽提，12000rpm，5min離心。

6)加入700μL植物Binding buf，上柱靜置5min。

7)12000rpm，2min離心。

8)加入500μL 80%乙醇洗2次，12000rpm，1min離心。

8)室溫靜置10min揮發(fā)晾干，加40μL H2O，靜置5～10min。

9)換新管，13000rpm，2min離心，管底即為基因組。

目的片段擴增：

引物合成：

NS1：GTAGTCATATGCTTGTCTC

NS8：TCCGCAGGTTCACCTACGGA

反應(yīng)體系

表2 反應(yīng)體系

反應(yīng)條件：

回收PCR產(chǎn)物

1)2.0%瓊脂糖凝膠電泳，切取目的片斷。

2)加入回收試劑溶液A 300μL/0.1g，6 0℃水浴至膠完全溶化。

3)加入50μL回收試劑溶液B，混勻。

4)將溶液置于離心柱中，靜置5min，12000rpm，1min，棄液體。

5)加入500μL 80%乙醇，12000rpm，離心1min，棄液體，重復(fù)1次。

6)12000rpm，離心5min，甩干余液，棄液體，晾干5～8min。

7)將離心柱置于新的離心管中，加入30μL滅菌雙蒸水，靜置10min。

8)13000rpm，離心3min，管底即為純化產(chǎn)物，取3μL電泳檢測。

(2)測序比對

以上試驗由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司完成，所得的產(chǎn)物序列通過National Center Biotechnology Information(NCBI)核算數(shù)據(jù)庫利用Blast程序搜索得到結(jié)果。

3 結(jié)果與分析

3.1 侵染率

經(jīng)錐蟲藍染色法染色后真菌組織呈藍色，按照侵染率計算公式計算，通過光學(xué)顯微鏡觀察，野生藍莓內(nèi)生菌根菌的侵染率約為60%。實驗觀察發(fā)現(xiàn)野生藍莓菌根真菌侵染率高的根段為分枝多直徑很細的根段，粗壯分枝少的根系侵染率很低。說明小興安嶺地區(qū)野生藍莓根系菌根真菌資源豐富。見圖1。

圖1 左為野生藍莓根段 右為野生藍莓菌根侵染形態(tài)

3.2 菌根真菌的分離

本試驗采用根段培養(yǎng)法，采取兩種消毒方法進行培養(yǎng)。

培養(yǎng)5天后，根段切面處長出白色菌絲(圖2)，可以推測此菌絲為藍莓根段內(nèi)共生真菌。采用的兩種消毒方法中，方法1分離出3個菌落，方法2分離出6個菌落。方法1分離出來的菌落較少，可能是由于酒精、升汞處理的造成菌絲的死亡。但是方法2的消毒方法根段污染率明顯高于方法1。

圖2 分離出的菌根真菌

圖3 2種方法對菌根真菌分離數(shù)量的影響

采用根段直接培養(yǎng)法分離野生藍莓菌根真菌，采用2種根段表面消毒法。不同消毒方法得到的菌落數(shù)不同，方法2得到的菌落數(shù)稍多，但是根段污染率極高，不易純化，而方法1消毒方法根段幾乎沒有污染，純化簡單。說明消毒時間及方法不同分離得到的真菌數(shù)量不同，純化難易程度也不相同。經(jīng)過篩選，淘汰了常見的腐生性真菌，初步得到5株單菌落。分別命名為L1～L5。

3.3 菌株培養(yǎng)特征

表3 分離得到的菌落特征(PDA培養(yǎng)基，25℃)

3.4 菌株鑒定

本研究通過對真菌的rDNA的ITS序列分析，對5個菌株進行分子生物學(xué)鑒定，通過18s rDNA檢測技術(shù)，從核酸水平鑒定菌株并進行分類鑒定可以很大程度地提高菌種分類鑒定的準(zhǔn)確率。

利用以上真菌的rDNA的ITS作為通用引物對供試的菌株擴增得到rDNA序列，將得到的序列通過GeneBank上的BLAST局部相似性查詢系統(tǒng)，搜索和待測菌株最相似的序列，并比較分析。菌株L1屬于杜鵑花類菌根真菌Meliniomycesvariabilis屬真菌。菌株L2、L3為Phialocephalafortinii杜鵑花科菌根真菌。L4、L5為Fusariumoxysporum鐮刀菌屬。5株菌株中有2株為鐮刀菌屬，說明可能植物本身正處在非內(nèi)生性病原菌感染的初期，這樣我們分離得到的真菌就不是目的內(nèi)生真菌。

表4 4株內(nèi)生真菌的BLAST結(jié)果

采用的根段分離法對野生藍莓菌根真菌進行分離，此法雖然是國內(nèi)外分離歐石楠類菌根真菌最普遍的方法，但其本身也存在其自身的局限性。首先，即使選取的根系沒有病害癥狀等，但也可能有潛在的病原菌存在，本試驗中，分離出的鐮刀菌屬被確定是潛在的致病菌。第二，有些菌根真菌并不一定能在人工培養(yǎng)基上生長，從而不能將其從植物組織內(nèi)的內(nèi)生真菌全部被分離出來，第三，菌根真菌長期生活在植物組織內(nèi)部，與宿主植物協(xié)同進化，為適應(yīng)微環(huán)境其形態(tài)特征會發(fā)生一定變化，因此，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)能否準(zhǔn)確反映出真實分類地位有待探討。

由此可見，創(chuàng)建從活體植物根系組織內(nèi)直接檢測和鑒定內(nèi)生真菌的技術(shù)體系是非常必要的。對植物根段的消毒時間也是影響分離效果的主要因素，何映霞研究珙桐內(nèi)生真菌的實驗表明，不同的消毒時間分離得到的真菌數(shù)量是不同的。消毒時間過長，可能會殺死一些內(nèi)生真菌，從而不能完全分離出植株內(nèi)生真菌；消毒時間過短，可能不會完全殺死植物根系組織表面的雜菌，干擾實驗結(jié)果[3]。

我們將用本次試驗分離出的杜鵑花科菌根真菌接種于藍莓苗中，觀察其對藍莓植株生長的促進作用，為實際應(yīng)用提供理論依據(jù)。

[1]顧姻，賀善安.藍漿果與蔓越橘[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社.2001

[2]鄭文龍，朱慧芳.產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌EFY-21的鑒定與生物學(xué)特性研究[J].菌物研究，2010，8(1)：35-39.

[3]何映霞.珙桐產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌的分離及鑒定[J].貴州，貴州大學(xué)，2008.

2017-06-09

S663.9

A

DOI.∶10.13268/j.cnki.fbsic.2017.05.008