利用渦蟲頭部再生構(gòu)建促再生藥物篩選模型

韓亞鵬，陳德來，許姝娟，史紅全，張小霞，祁小東，文小東

(1.甘肅省高校隴東生物資源保護(hù)與利用省級重點實驗室, 隴東學(xué)院, 甘肅 慶陽 745000；2.慶陽市中心血站，甘肅 慶陽 745000)

利用渦蟲頭部再生構(gòu)建促再生藥物篩選模型

韓亞鵬1，陳德來1，許姝娟1，史紅全1，張小霞2，祁小東1，文小東1

(1.甘肅省高校隴東生物資源保護(hù)與利用省級重點實驗室, 隴東學(xué)院, 甘肅 慶陽 745000；2.慶陽市中心血站，甘肅 慶陽 745000)

為了能夠有效地篩選促組織再生藥物，建立一種促再生渦蟲藥物篩選模型。采用丹參注射液、天麻注射液、紅花注射液、神經(jīng)節(jié)苷脂鈉注射液、N-N-二甲基乙酰胺等幾種藥物對日本三角渦蟲頭部的再生時間的影響作用，分析了日本三角渦蟲頭部再生對不同藥物的差異性反應(yīng)。結(jié)果顯示同種藥品在同一濃度下對不同日本三角渦蟲個體的再生時間影響不顯著(P>0.05)，不同濃度下對日本三角渦蟲的再生時間影響顯著(P<0.05)，不同藥物之間對日本三角渦蟲的再生時間的影響顯著(P<0.05)。表明日本三角渦蟲頭部再生對不同藥物反應(yīng)靈敏，不同藥物對渦蟲頭部再生有不同作用，可以作為神經(jīng)再生藥物篩選的一種生物模型。

日本三角渦蟲；再生；藥物篩選模型

Abstract:To effectively screen promoting tissue regeneration drug，a new promoting regenerationDugesiajaponicadrug screening model was constructed. Through the effects of several drugs, such as Salvia Miltiorrhiza Injection, Gastrodin Injection, Safflower Injection, Ganglioside Sodium Injection and N-N-dimethylacetamide, on the head regeneration time ofDugesiajaponica, the differential response of the regeneration of the head to the different drugs was analyzed. The results showed that the effects of the same drug on the regeneration time of the different planarians at the same concentration were not significant (P>0.05), the regeneration time of the different concentration was significant (P<0.05), and the regeneration time was significantly different among different drugs (P<0.05). The results indicated that the head regeneration ofDugesiajaponicawas sensitive to different drugs and could be used as a biological model for the screening of nerve regeneration drugs.

Keywords:Dugesiajaponica;Regeneration; Drug screening Model

三角渦蟲隸屬于扁形動物門(Platyhelminthes)，渦蟲亞門(Turbellaria)，渦蟲綱 、三腸目(Tricladi-da)、淡水亞目( Paludicola)、三角渦蟲科(Duge-siidae)、三角渦蟲屬(Dugesia)。該屬是淡水亞目中第一大屬，三角渦蟲頭明顯呈三角形，耳突發(fā)達(dá)，眼點一對，寬溫動物，分布廣泛[1-2]。三角渦蟲通常生活于山間小溪活泉水中[3-5]。渦蟲再生能力極強，現(xiàn)已證實，成體渦蟲強大的再生能力源自體內(nèi)一類有增殖分化潛能的干細(xì)胞，稱為“neoblasts”，即成體未分化細(xì)胞[6-7]。Rossi等[8]也得出結(jié)論，渦蟲neoblasts的增殖分化能力是動物界中任何成體干細(xì)胞所無可比擬的。這類細(xì)胞能對蟲體損傷的組織器官進(jìn)行完美的修復(fù)或替換，從而形成一個完整的有機體。渦蟲極強的再生能力使其在研究細(xì)胞分化與去分化機理和染色體等領(lǐng)域具有較高的科研價值和廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域[9]。

臨床上，已知心腦血管疾病、神經(jīng)精神疾病、肝臟及胰臟疾病等發(fā)展至后期，器官功能將嚴(yán)重減退或喪失而危及生命。一些遺傳基因缺陷疾病和外傷致殘性疾病(如脊髓損傷) 目前尚缺乏有效的治療手段[10]，周圍神經(jīng)損傷是目前臨床上常見的創(chuàng)傷并發(fā)癥，促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷后的再生，恢復(fù)其功能已日益成為研究的重心[11]。另外，腫瘤的分化逆轉(zhuǎn)也已成為腫瘤治療研究的新熱點[12]。目前以促組織再生藥物創(chuàng)制為關(guān)鍵核心內(nèi)容的再生醫(yī)學(xué)有望為上述疾病的治療帶來希望[13-16]，并成為醫(yī)學(xué)上亟待突破的國際前沿研究領(lǐng)域[17-22]。

創(chuàng)新促再生藥物(regeneration-promoting drugs)的發(fā)現(xiàn)離不開利用適當(dāng)?shù)膭游锝⒌募膊∧Ｐ鸵约皩Υ罅炕衔飿悠愤M(jìn)行篩選研究，小鼠和斑馬魚在藥物或靶蛋白篩選方面已形成了較為完善的藥物篩選技術(shù)平臺[23-24]。但是小鼠和斑馬魚作為藥物篩選模型均存在手術(shù)操作復(fù)雜、用樣量大、實驗周期長、耗費大量人力和財力等缺點，而試驗所用日本三角渦蟲具有手術(shù)操作簡單、結(jié)構(gòu)簡單、數(shù)量大、養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)、繁殖能力強、病害發(fā)生少、腦神經(jīng)再生能力強、再生過程明顯等特性[9,25-26]。渦蟲再生基因研究方面，Reddien等[27]通過RNA干涉技術(shù)發(fā)現(xiàn)有240個基因與渦蟲再生有關(guān)，而這些基因中的85%存在于人類基因組內(nèi)。Guo等[28]最近研究發(fā)現(xiàn)維持渦蟲干細(xì)胞數(shù)量的BRULI蛋白基因同樣存在于人類基因組內(nèi)。這些結(jié)果說明渦蟲與人類基因同源性很高。此外，近年來利用多種農(nóng)藥、表面活性劑、重金屬、無機鹽及興奮性藥物對日本三角渦蟲進(jìn)行急毒性、再生、酶活等的研究[29-31]也多有報道，上述研究均說明日本三角渦蟲對藥物的檢測具有較高的靈敏度。由此相比小鼠、斑馬魚等模式動物，日本三角渦蟲更適合神經(jīng)、組織再生修復(fù)的相關(guān)研究，對于實驗所用促進(jìn)或抑制神經(jīng)、組織再生修復(fù)藥物的篩選更具有重要意義。

N-N-二甲基乙酰胺有顯著的生理毒性,經(jīng)常接觸二甲基乙酰胺，可導(dǎo)致肝、腎、心、血管、神經(jīng)等系統(tǒng)出現(xiàn)不正常癥狀[32]；神經(jīng)節(jié)苷脂(GM1)可促進(jìn)神經(jīng)重構(gòu)(包括神經(jīng)細(xì)胞生存、軸突延長和突觸生長)，在細(xì)胞分化、發(fā)育、神經(jīng)組織修復(fù)、神經(jīng)元可塑性等方面起重要作用；丹參注射液、天麻注射液、紅花注射液均對神經(jīng)修復(fù)，組織再生有積極的促進(jìn)作用[33-44]。

本實驗通過丹參注射液、天麻注射液、紅花注射液、神經(jīng)節(jié)苷脂鈉注射液、N-N-二甲基乙酰胺(分析純)對日本三角渦蟲的再生實驗，研究了同種藥品不同濃度下對日本三角渦蟲再生時間的差異性，相同濃度下對日本三角渦蟲個體再生時間的差異性，以及不同藥品對日本三角渦蟲再生時間的差異性，來探討日本三角渦蟲在藥物篩選中的再生時間差異性作用，并擬為建立促進(jìn)組織再生藥物的動物篩選模型提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料、藥品

本實驗用日本三角渦蟲取自甘肅省慶陽市西峰區(qū)火巷溝山泉中，在室溫下培養(yǎng)，喂養(yǎng)期間，每隔4天用豬肝或雞蛋黃喂食1次，喂食4h后換隔夜自來水[45]。實驗前停止喂食1～2天，實驗溫度為(22±1)℃。實驗所選日本三角渦蟲為最大伸展體長8～10mm。實驗用水為實驗室隔夜自來水。

表1 藥品名稱、藥品規(guī)格、生產(chǎn)地

1.2 實驗方法

三角渦蟲再生對藥物的篩選:配制天麻注射液、N-N-二甲基乙酰胺、丹參注射液、紅花注射液、單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉注射液濃度梯度溶液。配好后將各濃度的溶液依次移入不同培養(yǎng)皿(直徑9或12cm)各25mL，皿面做好標(biāo)記。每個濃度設(shè)3個重復(fù)，每組10只日本三角渦蟲，日本三角渦蟲的體長相近。

表2 實驗藥物濃度梯度

再生試驗開始時，將三角渦蟲逐條移至培養(yǎng)皿中用消毒刀片緊貼耳突后切去頭部，收集手術(shù)后的三角渦蟲放入盛有各濃度的培養(yǎng)皿中進(jìn)行再生觀察。術(shù)后72h開始，每隔2h在體視顯微鏡下進(jìn)行1次三角渦蟲眼點再生觀察并記錄，以兩個眼點再生完全作為渦蟲再生完成的標(biāo)志。而培養(yǎng)皿中的溶液每24h重新更換1次。設(shè)置濃度依據(jù)是藥物說明書上的規(guī)格用量。

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

丹參注射液、天麻注射液、紅花注射液、神經(jīng)節(jié)苷脂鈉注射液、N-N-二甲基乙酰胺對渦蟲再生的影響通過統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS 22.0軟件和EXCEL軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，將幾次重復(fù)的實驗結(jié)果進(jìn)行單因素線性統(tǒng)計分析，表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，對變量進(jìn)行t檢驗，P<0.05時具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 N-N-二甲基乙酰胺對日本三角渦蟲再生時間的影響作用

從培養(yǎng)開始48h之后觀察，每隔2h觀察一次再生情況。對照組渦蟲126h后均出現(xiàn)眼點，與對照組相比各濃度N-N-二甲基乙酰胺(DMA)對渦蟲的再生時間均有影響且不同濃度下對渦蟲再生時間影響顯著(P<0.05)。從表3數(shù)據(jù)看出，濃度為0.90mg/mL時可以抑制渦蟲再生，且隨濃度增大抑制作用增強。當(dāng)濃度為0.90～2.70mg/mL處理組均有渦蟲完成再生，但未全部再生；濃度大于2.70mg/mL的處理組在150h后依然沒有完成再生；濃度高于3.30mg/mL時渦蟲會表現(xiàn)出不同程度扭曲、翻滾、卷曲、吐咽、死亡等現(xiàn)象。

表3 N-N-二甲基乙酰胺對日本三角渦蟲再生時間影響作用

注：*與對照組(0mg/mL)比較P<0.05。

2.2 天麻素注射液對日本三角渦蟲再生時間的影響作用

從表4數(shù)據(jù)看出對照組渦蟲眼點再生完成時間多于處理組，說明一定濃度天麻素注射液增加渦蟲再生的數(shù)量，不同濃度下對渦蟲的再生時間影響顯著(P<0.05)，同濃度下對不同個體渦蟲的再生時間影響不顯著(P>0.05)，且在濃度0.01mg/mL的時候?qū)u蟲的再生促進(jìn)作用最強，當(dāng)濃度增大到0.100mg/mL時對渦蟲的再生時間影響不顯著(P>0.05)。

表4 天麻素注射液對日本三角渦蟲再生時間影響作用

注：*與對照組(0mg/mL)比較P<0.05。

2.3 丹參注射液對日本三角渦蟲再生時間的影響作用

從表5數(shù)看出示丹參注射液對渦蟲再生有促進(jìn)作用，濃度在0.01～1mg/mL時與對照組比較對渦蟲再生促進(jìn)作用顯著(P<0.05)；濃度高于1mg/mL時對渦蟲再生促進(jìn)作用不顯著(P>0.05)；不同濃度比較可知濃度為0.5mg/mL時術(shù)后渦蟲全部再生只需100h，對渦蟲的再生影響最明顯。

表5 丹參注射液對日本三角渦蟲再生時間影響作用

注：*與對照組(0mg/mL)比較P<0.05。

2.4 紅花注射液對日本三角渦蟲再生時間的影響作用

從表6上顯示的數(shù)據(jù)分析紅花注射液對渦蟲再生有促進(jìn)作用，不同濃度下對渦蟲的再生時間影響顯著(P<0.05)，同濃度下對不同個體渦蟲的再生時間影響不顯著(P>0.05)。濃度0.050～0.025mg/mL時對渦蟲的再生促進(jìn)作用最強，其中濃度在0.050mg/mL下，術(shù)后渦蟲經(jīng)過96h已經(jīng)全部再生。

表6 紅花注射液對日本三角渦蟲再生時間影響作用

注：*與對照組(0mg/mL)比較P<0.05。

2.5 神經(jīng)節(jié)苷脂鈉注射液對日本三角渦蟲再生時間的影響作用

從表7數(shù)據(jù)看出神經(jīng)節(jié)苷脂鈉注射液對渦蟲再生有促進(jìn)作用，不同濃度下對渦蟲的再生時間影響顯著(P<0.05)，同濃度下對不同個體渦蟲的再生時間影響不顯著(P>0.05)，與其他濃度相比濃度在0.010mg/mL時對渦蟲的再生促進(jìn)作用最強，以后隨著濃度的變化對渦蟲的再生促進(jìn)作用逐漸減弱。

表7 神經(jīng)節(jié)苷脂鈉注射液對日本三角渦蟲再生時間影響作用

注：*與對照組(0mg/mL)比較P<0.05。

3 討論

3.1 日本三角渦蟲在藥物溶液中的反應(yīng)

N-N-二甲基乙酰胺對日本三角渦蟲具有一定的生物毒性作用，能夠影響日本三角渦蟲渦蟲的再生[46-48]。急性毒性實驗及日本三角渦蟲頭部再生實驗說明日本三角渦蟲對DMA的反應(yīng)較為靈敏。在較低濃度范圍內(nèi)日本三角渦蟲可以通過自身調(diào)節(jié)機制減緩或削弱DMA的毒害作用，雖然時間延長但仍可以完成再生，日本三角渦蟲最終均可以再生；在相對較高濃度(>0.30mg/mL)持續(xù)作用下，日本三角渦蟲機體調(diào)節(jié)系被損壞，無法完成再生且渦蟲逐漸出現(xiàn)不同表現(xiàn)，出現(xiàn)翻滾、扭轉(zhuǎn)、卷曲、吐咽現(xiàn)象。這說明日本三角渦蟲對于抑制類藥物的感應(yīng)性很強，反應(yīng)靈敏。

天麻素注射液、紅花注射液、復(fù)方丹參注射液、神經(jīng)節(jié)苷脂鈉注射液對日本三角渦蟲再生均有促進(jìn)作用，日本三角渦蟲在藥液中反應(yīng)正常，通過日本三角渦蟲頭部再生時間對比可知試驗組日本三角渦蟲頭部再生速度明顯比對照組時間短。從另一方面看，日本三角渦蟲的再生速度也就反映了日本三角渦蟲對藥物的吸收效率。日本三角渦蟲對藥物的感應(yīng)靈敏性越強，說明對藥物的吸收率越高。

3.2 日本三角渦蟲對藥物的差異性反應(yīng)

試驗中DMA濃度設(shè)置依次為0.90、1.50、2.10、2.70、3.30、3.90、4.50mg/mL。梯度濃度之間濃度間差是0.6mg/mL，濃度差很小。但是在各個濃度中，日本三角渦蟲再生速度明顯被抑制，均比對照組再生所用時間長，組間差異大，抑制效應(yīng)明顯。天麻素注射液、紅花注射液、復(fù)方丹參注射液、神經(jīng)節(jié)苷脂鈉注射液的濃度梯度設(shè)置合理，日本三角渦蟲再生在各藥液中均有最佳濃度，再生效果明顯。不同濃度下日本三角渦蟲的再生時間之間存在顯著差異(P<0.05)，相同濃度下不同個體之間的再生時間差異不顯著(P>0.05)，不同藥品濃度之間對日本三角渦蟲的再生時間的影響也不同，差異性顯著(P<0.05)。上述結(jié)果均說明日本三角渦蟲對藥物作用的反應(yīng)靈敏。

4 結(jié)論

綜上所述,不論是丹參注射液、天麻注射液、紅花注射液、神經(jīng)節(jié)苷脂鈉注射液對日本三角渦蟲的促進(jìn)再生作用，還是N-N-二甲基乙酰胺(分析純)對日本三角渦蟲的抑制再生作用，這些藥物對日本三角渦蟲再生作用效果均明顯，日本三角渦蟲對藥物靈敏性很好，表明日本三角渦蟲對藥物可以進(jìn)行篩選，能作為一種用于藥物篩選的模式動物。

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EstablishmentofPromotingRegenerationDrugScreeningModelUsingHeadRegenerationofDugesiajaponica

Han Yapeng1, Chen Delai1, Xu Shujuan1, Shi Hongquan1, Zhang Xiaoxia2, Qi Xiaodong1,Wen Xiaodong1

(1.University Provincial Key Laboratory for Protection and Utilization of Long dong Bio-resources in Gansu Province,Longdong University,Qingyang 745000;2.Qingyang City Blood Station 745000 )

2017-04-22

甘肅省科技廳自然科學(xué)基金(17JR5RM356)

韓亞鵬(1979-)，男，副教授，碩士研究生，主要從事發(fā)育和神經(jīng)生物學(xué)方面研究，E-mail：408665001@qq.com。

Q95-3

A

DOI.:10.13268/j.cnki.fbsic.2017.05.001