基于Mn摻雜ZnS量子點(diǎn)室溫磷光法檢測(cè)鹽酸巴馬汀

安昭琦， 栗東霞， 于建敏， 閆桂琴

(山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西臨汾 041000)

摻雜半導(dǎo)體量子點(diǎn)(Quantum Dots，QDs)作為一種新型的納米材料,具有獨(dú)特的光學(xué)、電學(xué)和磁學(xué)性質(zhì)，可以應(yīng)用于電子發(fā)光器件、熒光標(biāo)記和生物分析等領(lǐng)域[1]，尤其是室溫磷光(Room Temperature Phosphorescence,RTP)量子點(diǎn)在很多領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。磷光相對(duì)于熒光檢測(cè)選擇性更強(qiáng)，壽命更長(zhǎng)，可以有效避免生物體液的背景熒光和散射光干擾[2 - 3]。此外，由于磷光相對(duì)于熒光是一種更少見的現(xiàn)象，選擇性也更好[4]。因此，RTP檢測(cè)法備受關(guān)注。

鹽酸巴馬汀(Palmatine Hydrochloride，PaH)是一種異喹啉生物堿，可由毛茛科植物黃連及防己科植物金果欖的根部和防己科植物黃藤的莖中提取得到[5 - 6]，具有抗炎[7]、抗腫瘤[8]和抗菌等藥理藥效作用[9 - 10]。臨床上PaH常用于治療婦科炎癥、腸炎、外科感染、眼結(jié)膜炎、呼吸道及泌尿道感染等[11]。但服用該藥會(huì)出現(xiàn)眩暈、惡心等癥狀，若服用劑量較大則對(duì)呼吸中樞有一定抑制作用，有時(shí)還可引起錐體外系癥狀。因此，建立一種檢測(cè)生物體液中PaH含量的方法十分必要。目前，測(cè)定PaH的方法主要有共振光散射法[12 - 13]、高效液相色譜法[14 - 15]、紫外-可見光譜法[16]和熒光光譜法[17]。盡管這些方法檢測(cè)PaH有效，但也存在著各種不足，如共振光散射法需要酸性或堿性環(huán)境；高效液相色譜法需要復(fù)雜的預(yù)處理、分析時(shí)間長(zhǎng)、儀器昂貴；紫外-可見光譜與熒光光譜法容易受自體熒光和散射光的干擾。因此，基于中性環(huán)境建立一種低成本、耗時(shí)少、操作簡(jiǎn)單、靈敏高效檢測(cè)PaH的方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

本文以3-巰基丙酸(3-Mercaptopropionic Acid，MPA)包裹的Mn摻雜ZnS量子點(diǎn)(Mn∶ZnS QDs)為室溫磷光探針，利用PaH與量子點(diǎn)發(fā)生靜電作用，使得Mn∶ZnS QDs發(fā)生室溫磷光猝滅效應(yīng)，從而建立了一種簡(jiǎn)單、快速、靈敏且選擇性好的測(cè)定痕量PaH的方法，該方法可有效用于生物體液中PaH的快速測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

采用Rigaku D/max-2500 X-射線粉末衍射儀(日本，理光公司)對(duì)量子點(diǎn)進(jìn)行表征。熒光光譜和磷光光譜在Cary Eclipse熒光分光光度計(jì)(美國(guó)，瓦里安公司)上進(jìn)行測(cè)定。pHS-3C型pH計(jì)(上海雷磁公司)。AEU-200電子天平(日本，島津公司)。

鹽酸巴馬汀標(biāo)準(zhǔn)品(PaH，上海曼思環(huán)境科技有限公司);Zn(Ac)2·2H2O、Mn(Ac)2·4H2O、NaS·9H2O、NaH2PO4、Na2HPO4(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司);3-巰基丙酸(MPA，北京百靈威科技有限公司);實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純。高純水(18.2 MΩ· cm)采用WaterPro水純化系統(tǒng)(美國(guó)Labconco公司)制備。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1MPA包裹的Mn∶ZnSQDs的合成參考文獻(xiàn)方法[18]并做適當(dāng)改進(jìn)：在250 mL三頸燒瓶中，依次加入2 mL 0.01 mol/L Mn(Ac)2，5 mL 0.1 mol/L Zn(Ac)2和50 mL 0.04 mol/L MPA溶液，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至11，在室溫下磁力攪拌，并通氬氣飽和30 min，確保穩(wěn)定劑MPA與Zn2+和Mn2+充分絡(luò)合后，加入5 mL 0.1 mol/L Na2S溶液，在室溫下繼續(xù)反應(yīng)20 min后，將得到的溶液MPA包裹的ZnS∶Mn QDs溶液在50 ℃ 下陳化2 h，用相同體積的無水乙醇使量子點(diǎn)沉淀，高速離心，洗滌2～3次，室溫真空干燥24 h，即得MPA 包裹的Mn∶ZnS QDs固體粉末。

1.2.2室溫磷光檢測(cè)在一系列10 mL比色管中，依次加入500 μL 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH=7.4)，35 μL 2 mg/mL的MPA包裹的Mn∶ZnS QDs水溶液，及不同濃度的PaH溶液，用高純水定容至5 mL，充分搖勻，靜置10 min后進(jìn)行磷光檢測(cè)。

1.2.3樣品檢測(cè)尿液收集于健康志愿者，分析前將其用高純水稀釋100倍即可，無需進(jìn)一步處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 MPA包裹的Mn∶ZnS QDs的表征

圖1(A)為X-射線衍射(XRD)表征圖譜。如圖所示，在2θ=29°、48°和57°的三個(gè)衍射峰分別對(duì)應(yīng)于立方型閃鋅礦結(jié)構(gòu)的(111)、(220)和(311)三個(gè)晶面的衍射光譜，表明所合成的Mn∶ZnS QDs具有典型立方晶體結(jié)構(gòu)。通過熒光分光光度計(jì)測(cè)定該Mn∶ZnS QDs 的最強(qiáng)激發(fā)峰為295 nm，最強(qiáng)發(fā)射峰為590 nm(圖1(B))，與文獻(xiàn)報(bào)道[19 - 20]一致，說明量子點(diǎn)成功制備。由于ZnS是寬禁帶半導(dǎo)體材料，Mn2+與Zn2+的價(jià)態(tài)相同，離子半徑相近，使得Mn2+能夠很好的滲入到Zn2+晶格中，并且不會(huì)對(duì)ZnS的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。量子點(diǎn)在295 nm 處有很強(qiáng)的磷光發(fā)射峰，是因?yàn)楫?dāng)激發(fā)光被ZnS 母體吸收后其電子受到激發(fā)，空穴則被Mn2+捕獲，電子和空穴各自在Mn2+上復(fù)合從而導(dǎo)致Mn2+的激發(fā)，然后以磷光形式釋放能量。在這一過程中Mn2+發(fā)生了從三重態(tài)(4T1)到基態(tài)(6A1)的躍遷，并在590 nm 處發(fā)出橙紅色的磷光。

圖1 (A)Mn∶ZnS QDs的X-射線衍射(XRD)圖譜；(B) Mn∶ZnS QDs的激發(fā)光譜與發(fā)射光譜 Fig.1 (A) XRD image of Mn∶ZnS QDs;(B) The excitation and emission spectra of Mn∶ZnS QDs cQDs:14 mg/L；PBS buffer:20 mmol/L；pH=7.4.

2.2 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

為了實(shí)現(xiàn)對(duì)PaH的靈敏檢測(cè)，對(duì)pH值、反應(yīng)時(shí)間及NaCl的濃度進(jìn)行了優(yōu)化。由圖2(A)可知，Mn∶ZnS QDs 的室溫磷光強(qiáng)度IRTP與pH值密切相關(guān)。結(jié)果表明，pH值在7.0～7.4時(shí)相對(duì)穩(wěn)定。由于生理pH值為7.4，所以選擇pH=7.4作為該實(shí)驗(yàn)的緩沖液。同時(shí)，量子點(diǎn)的IRTP在10～40 min內(nèi)(圖2(B))和較高的鹽濃度下(0.3 mol/L)基本保持穩(wěn)定(圖2(C))。

圖2 pH(A)、時(shí)間(B)和NaCl濃度(C)對(duì)Mn∶ZnS QDs IRTP的影響 Fig.2 Effect of pH(A),time(B)and NaCl concentration(C) on the IRTP of Mn∶ZnS QDs cQDs:14 mg/L；cPaH:3 μmol/L.

2.3 Mn∶ZnS QDs對(duì)PaH的響應(yīng)

在最佳條件下，研究了MPA包裹的Mn∶ZnS QDs的室溫磷光猝滅強(qiáng)度(ΔIRTP)與PaH 濃度之間的關(guān)系。隨著PaH濃度的增大，Mn∶ZnS QDs的IRTP在590 nm處呈規(guī)律性猝滅(圖3(A))。當(dāng)PaH的濃度在0.75～30 μmol/L范圍時(shí)與ΔIRTP呈線性關(guān)系(圖3(B))，線性方程為:ΔIRTP=52.133cPaH+36.14，相關(guān)系數(shù)R=0.996，檢出限(3σ)為0.35 μmol/L。

圖3 (A)PaH濃度對(duì)Mn∶ZnS QDs的IRTP的影響；(B)PaH濃度與ΔIRTP的校正曲線Fig.3 (A) Effect of PaH concentrations on IRTP of Mn∶ZnS QDs;(B) Calibraation curve between cPaH and ΔIRTP(A)cQDs:14 mg/L；cPaH：a-j.0，0.75，1.5，3.0，6.0，10.5，15.0，19.5，24.0，30.0 μmol/L;(B) cQDs:14 mg/L；cPaH：0.75，1.5，3.0，6.0，10.5，15.0，19.5，24.0，30.0 μmol/L.

2.4 PaH與量子點(diǎn)的作用機(jī)制

熒光光譜圖(圖4(A))顯示，量子點(diǎn)(曲線a)中加入PaH(曲線b)后熒光明顯加強(qiáng)(曲線c)，但加強(qiáng)效應(yīng)并非二者數(shù)據(jù)簡(jiǎn)單疊加(曲線d)所致，表明PaH和MPA包裹的Mn∶ZnS QDs 之間發(fā)生了相互作用，且形成了新的物質(zhì)。

圖4 (A) 熒光光譜圖；(B) Mn∶ZnS QDs的Lineweaver-Burk圖和Stem-Volmer圖Fig.4 (A) Fluorescence spectra;(B) Lineweaver-Burk Graph and Stem-Volmer Graph of Mn∶ZnS Dots(A) a.QDs;b.PaH;c.QDs/PaH;d.QDs+PaH;cQDs:14 mg/L;cPaH:3 μmol/L.(B) cQDs:14 mg/L；cPaH:0.75，3.0，6.0，10.5，15.0，19.5，24.0，30.0 μmol/L.

由于量子點(diǎn)表面存在大量羧基，呈電負(fù)性，而PaH為異喹啉生物堿，其分子中有不飽和的N原子，使其在水溶液中呈正電性，因此二者極易通過靜電作用而結(jié)合。因此，當(dāng)體系中加入PaH 后，PaH作為一種陽離子電子受體，可能通過靜電吸引與MPA包裹的Mn∶ZnS QDs形成復(fù)合物，進(jìn)而從量子點(diǎn)捕獲電子并阻止量子點(diǎn)內(nèi)電子與空穴的正常復(fù)合，量子點(diǎn)電子從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時(shí)以光能形式釋放能量受到障礙，變?yōu)榉禽椛滠S遷，這是導(dǎo)致量子點(diǎn)磷光猝滅的主要原因。

磷光猝滅過程通常分為動(dòng)態(tài)和靜態(tài)猝滅，動(dòng)態(tài)猝滅遵從Stem-Voliner方程(1)，靜態(tài)碎滅遵從Lineweaver-Burk方程(2)[21 - 22]：

P0/P=1+KSV

(1)

1/(P0-P)=1/P0+KLB/(P0cPaH)

(2)

其中，P0代表磷光體磷光強(qiáng)度，P代表加入磷光碎滅劑后體系的磷光強(qiáng)度，cPaH為猝滅劑的濃度，KSV是動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)，KLB是靜態(tài)猝滅常數(shù)[23 - 25]。圖4(B)為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合出來的曲線，P0/P和cPaH的關(guān)系不遵循Stem-Voliner方程，而P0-P與cPaH的關(guān)系符合Lineweaver-Burk方程，說明PaH猝滅Mn∶ZnS QDs是一個(gè)靜態(tài)猝滅過程。

圖5為MPA包裹的Mn∶ZnS QDs與PaH的反應(yīng)機(jī)理圖。

圖5 (A) 基于MPA包裹的Mn∶ZnS QDs檢測(cè)PaH的反應(yīng)機(jī)理圖;(B) MPA包裹的Mn∶ZnS QDs結(jié)構(gòu);(C) PaH分子結(jié)構(gòu)Fig.5 (A) Mechanism of PaH detection using the MPA capped Mn∶ZnS QDs;(B) Structure of MPA capped Mn∶ZnS QDs;(C) Structure of PaH

2.5 共存物質(zhì)的干擾

在最佳條件下，考察了共存物質(zhì)的影響(表1)。結(jié)果表明，在PaH濃度為3 μmol/L時(shí)，250倍的K+,800倍的Na+,100倍的葡萄糖，100倍的蔗糖,200倍的果糖，15倍的L-谷氨酸(L-Glu)，15倍的L-精氨酸(L-Arg)，50倍的L-賴氨酸(L-Lys)，100倍的L-酪氨酸(L-Tyr)，100倍的L-丙氨酸(L-Ala)，150倍的L-脯氨酸(L-Pro)，400倍的DL-甲硫氨酸(DL-Met)對(duì)Mn∶ZnS QDs的影響均不大。其他陽離子藥物存在，會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生或多或少的干擾：若其他陽離子藥物濃度較小，對(duì)檢測(cè)體系幾乎沒有干擾；若濃度較大，則會(huì)產(chǎn)生干擾。但在實(shí)際藥物使用中，PaH功能主治與其他陽離子藥物雖有相似之處，但同時(shí)服用的可能性很小。因此，用Mn∶ZnS QDs的PaH具有較高的準(zhǔn)確性和潛在的適應(yīng)性。

表1 生物體液物質(zhì)干擾Table 1 Effect of co-existing substances

圖6 尿液的磷光(a)和熒光(b)光譜圖Fig.6 Phosphorescence(a) and fluorescence(b) spectra of urine

2.6 實(shí)際樣品分析

為考察MPA 包裹的Mn∶ZnS QDs的室溫磷光檢測(cè)PaH的可行性，進(jìn)行了尿液的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。圖6顯示，人尿液無背景磷光(曲線a)，卻有較強(qiáng)的背景熒光(曲線b)，表明該檢測(cè)方法能有效避免生物體液中其他物質(zhì)的熒光干擾。進(jìn)一步說明了本方法只需將待測(cè)液稀釋100倍，不需要進(jìn)行其他復(fù)雜的預(yù)處理。PaH的回收率為94.0%～103.3%(表2)。因此，該方法適合人體液中痕量PaH的檢測(cè)。

表2 基于MPA包裹的Mn∶ZnS QDs的RTP法檢測(cè)PaHTable 2 Detection of PaH by RTP method based on Mn∶ZnS QDs

3 結(jié)論

基于3-巰基丙酸包裹的Mn：ZnS QDs的室溫磷光性質(zhì)，利用鹽酸巴馬汀與Mn∶ZnS QDs發(fā)生靜電作用，使得Mn∶ZnS QDs的磷光發(fā)生有效猝滅，并實(shí)現(xiàn)了生物體液中痕量鹽酸巴馬汀的檢測(cè)，其線性范圍為0.75～30 μmol/L，檢出限為0.35 μmol/L，加標(biāo)回收率為94.0%～103.3%。該方法成本低、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)方便且不受體液背景熒光和散射光的干擾。