反式雄烯二酮對(duì)食蚊魚的生長(zhǎng)發(fā)育和第二性征的影響

古明宗 曾科 楊華杰 方貴楨 侯麗萍

摘 要：為了研究反式雄烯二酮（ADD）長(zhǎng)期暴露對(duì)食蚊魚（Gambusia affinis）生長(zhǎng)發(fā)育和第二性征的影響，分別用不同濃度的ADD（50、200、500、2 000 μg/L）對(duì)食蚊魚進(jìn)行60 d的水浴暴露處理，以0.1%甲醇和清水作對(duì)照，考察食蚊魚形態(tài)特征、組織結(jié)構(gòu)以及生長(zhǎng)和生殖相互關(guān)系的變化情況。結(jié)果表明：雌性食蚊魚的各項(xiàng)生理指標(biāo)均受水體中雄性激素ADD的影響，且影響程度隨著ADD濃度的增加而增加。隨著雄性激素ADD的加入，食蚊魚的體長(zhǎng)和臀鰭長(zhǎng)變短，體重、性腺重和肝重變輕，卵子數(shù)量變少；卵細(xì)胞發(fā)生了形變、腫脹，甚至退化；肝細(xì)胞的細(xì)胞核偏移中央，細(xì)胞腫大，出現(xiàn)了空泡結(jié)構(gòu)，細(xì)胞脂質(zhì)化程度逐漸加深；鰓絲長(zhǎng)短不一，排列不整齊，甚至出現(xiàn)了退化現(xiàn)象；臀鰭出現(xiàn)上短下長(zhǎng)，尖端分叉的現(xiàn)象。總體來(lái)講，水體中雄性激素ADD會(huì)引發(fā)雌性食蚊魚出現(xiàn)雄性化的第二性征。

關(guān)鍵詞：雄激素；反式雄烯二酮（ADD）；食蚊魚；生長(zhǎng)發(fā)育

中圖分類號(hào)：S949 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-060X（2017）01-0063-05

Abstract： In order to study the trans androstenedione （ADD） long exposure to Gambusia affinis growth and the influence of the secondary sex characteristic， with different concentrations of the ADD （50， 200， 500， 2 000 g/L） to 60 d water bath exposed mosquito fish processing， 0.1% methanol and water as contrast， Gambusia affinis morphological characteristics， organization structure and the relationship between growth and reproduction was studied. The results showed that the female Gambusia affinis of various physiological indexes under the influence of male hormones in the water， ADD， and influence degree increase with the increased concentration of the ADD. As the male hormone ADD to join， the Gambusia affiniss body length and anal fin length shorter， lighter weight， gonad weight and liver weight， less number of eggs； the egg deformation happened， swelling， or even degradation； the central nucleus of liver cell migration， cell swelling， a cavity structure， degree of cell lipid change gradually deepened； the gill filament length is differ， untidy， even the degradation phenomenon appeared； the anal fin on next short length， cutting-edge forked phenomenon. In general， male hormones in the water， ADD cause female Gambusia affinis appear male secondary sex characteristic.

Key words： androgen； trans-androstenedione； Gambusia affinis； growing development

內(nèi)分泌干擾物（EDCs），也稱為環(huán)境激素，是一種干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)的外源性化學(xué)物質(zhì)。這類物質(zhì)在環(huán)境中即使數(shù)量極少，也能干擾人類或動(dòng)物內(nèi)分泌系統(tǒng)諸環(huán)節(jié)并導(dǎo)致異常效應(yīng)，進(jìn)而影響生物的生長(zhǎng)發(fā)育及生殖[1]。近年來(lái)，很多國(guó)家和地區(qū)陸續(xù)在城市水環(huán)境中檢測(cè)到雄激素物質(zhì)。這些環(huán)境雄激素可損害水生生物正常的內(nèi)分泌系統(tǒng)，使雌魚出現(xiàn)雄性第二性征，一方面導(dǎo)致雌性水生生物生殖能力下降，另一方面引起某些水生生物雌雄比例發(fā)生改變[2-4]。反式雄烯二酮就是這樣一種雄激素，它廣泛存在于地表水中，但目前尚未有與其相關(guān)的毒理數(shù)據(jù)。

食蚊魚（Gambusia affinis）是原產(chǎn)于北美洲的著名入侵種，屬鳉形目胎鳉科，廣泛分布在我國(guó)華南地區(qū)的淡水水體中，容易捕撈，也易于在實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。因此，食蚊魚被當(dāng)作模式生物廣泛用于化合物的各種毒性測(cè)試，是研究?jī)?nèi)分泌干擾作用和水體污染監(jiān)測(cè)的理想指示生物[5]。

為進(jìn)一步探討反式雄烯二酮的環(huán)境毒理效應(yīng)，篩選出相應(yīng)的生物標(biāo)志物，研究以食蚊魚為對(duì)象，探討了反式雄烯二酮長(zhǎng)期暴露對(duì)其生理活動(dòng)及生長(zhǎng)發(fā)育的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試食蚊魚購(gòu)自廣州花鳥魚蟲市場(chǎng)，供試試劑為反式雄烯二酮母液（ADD，分析純）和甲醇（分析純）。

1.2 暴露處理

挑選大小相似的雌性食蚊魚210條，分6個(gè)魚缸分別編號(hào)1～6，每個(gè)魚缸35條，培養(yǎng)1個(gè)月，讓雌魚適應(yīng)該魚群密度。暴露處理：編號(hào)1～4的魚缸中分別添加反式雄烯二酮50、200、500和2000 μg/L；5號(hào)魚缸為藥劑對(duì)照組，加入0.01%甲醇；6號(hào)魚缸為空白對(duì)照組，不加藥劑。暴露試驗(yàn)開始后，隔天換1/2體積的水，換水后添加適當(dāng)?shù)姆词叫巯┒顾袧舛缺３忠恢?，培養(yǎng)2個(gè)月[6]。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

從形態(tài)學(xué)觀測(cè)記錄食蚊魚各生長(zhǎng)指標(biāo)，從毒理學(xué)方面觀測(cè)各組織切片中細(xì)胞和結(jié)構(gòu)的變化。

1.3.1 形態(tài)學(xué)和生理學(xué)測(cè)定 暴露結(jié)束后，將食蚊魚埋入冰中致死。從低濃度開始測(cè)量觀察，測(cè)量每條食蚊魚的體長(zhǎng)、體重和臀鰭數(shù)。對(duì)食蚊魚進(jìn)行解剖，迅速取出魚肝、魚鰓及性腺，用濾紙吸取血漬，稱重記錄。

1.3.2 組織切片制作 配置Bouin氏液：稱取2.25 g苦味酸固體溶解于150 mL蒸餾水中，福爾馬林50 mL，冰醋酸10 mL，攪拌均勻。用Bouin氏液迅速固定稱重之后的魚肝、魚鰓及性腺，封蓋并貼標(biāo)簽。用濃度梯度遞增的乙醇溶液脫水，至100%乙醇，使脫水硬化，選用二甲苯（xylene）為透明劑。用石蠟作為支持介質(zhì)并對(duì)組織進(jìn)行石蠟包埋，用切片機(jī)切片后，采用蘇木素伊紅染色法（EH染色法）進(jìn)行染色，后用樹膠和蓋玻片封固。

1.3.3 骨骼制作 將剩下的食蚊魚放置濃度為2%～3%的氫氧化鉀中浸泡12 h，在體式顯微鏡下，剔除魚身上的皮肉，再用1%的茜素紅染色30 min，用清水洗滌，放置體式顯微鏡下觀察，記錄臀鰭的變化特征。

1.3.4 肝體指數(shù)（HSI）和性體指數(shù)（GSI） HSI=（肝重/魚體重量）×100%，GSI=（性腺重/魚體重量）×100%。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析，采用單因素方差分析（ANOVA）法來(lái)檢驗(yàn)不同處理下食蚊魚各生理指標(biāo)的差異，并用LSD對(duì)結(jié)果進(jìn)行多重比較。如果P<0.05，則認(rèn)為處理間差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 水體中ADD暴露對(duì)雌性食蚊魚形態(tài)特征的影響

2.1.1 體 長(zhǎng) 由圖1可知，當(dāng)水體中ADD濃度為500和2 000 μg/L時(shí)，雌性食蚊魚的體長(zhǎng)極顯著短于其他處理，而濃度為50和200 μg/L時(shí)，雌性食蚊魚的體長(zhǎng)與對(duì)照組差異不顯著。因此，可認(rèn)為雌性食蚊魚在含有500和2 000 μg/LADD的水體中，體長(zhǎng)發(fā)生了特變。

2.1.2 臀鰭長(zhǎng) 由圖2可知，當(dāng)水體中ADD濃度為500和2 000 μg/L時(shí)，雌性食蚊魚的臀鰭長(zhǎng)極顯著性短于對(duì)照組，而濃度為50和200 μg/L時(shí)，雌性食蚊魚的臀鰭長(zhǎng)與對(duì)照組差異不顯著。因此，可認(rèn)為ADD對(duì)雌性食蚊魚臀鰭的生長(zhǎng)發(fā)育有顯著影響，但在高濃度下才出現(xiàn)明顯突變。

2.1.3 體 重 由圖3可知，當(dāng)水體中ADD濃度為500和2 000 μg/L時(shí)，雌性食蚊魚的體重極顯著性輕于對(duì)照，而濃度為50和200 μg/L時(shí)，雌性食蚊魚的體重與對(duì)照組差異不明顯。因此，可認(rèn)為雌性食蚊魚在含有500和2 000 μg/LADD的水體中，體重發(fā)生了特變；而在50和200 μg/L的ADD條件下，體重與對(duì)照組差異不顯著，并未發(fā)生特變。

2.1.4 性腺重 由圖4可知，當(dāng)水體中ADD濃度為500和2 000 μg/L時(shí)，雌性食蚊魚的性腺重極顯著性輕于對(duì)照，而在濃度為50和200 μg/L時(shí)，雌性食蚊魚的性腺重與對(duì)照組差異不明顯。這表明ADD對(duì)雌性食蚊魚性腺的生長(zhǎng)發(fā)育有極顯著的抑制作用，但只表現(xiàn)在高濃度下。

2.1.5 肝 重 由圖5可知，當(dāng)水體中ADD濃度為500和2 000 μg/L時(shí)，雌性食蚊魚的肝臟重極顯著性輕于對(duì)照，而在濃度為50和200 μg/L時(shí)，雌性食蚊魚的肝臟重與對(duì)照組差異不明顯，這表明高濃度ADD對(duì)雌性食蚊魚肝臟生長(zhǎng)發(fā)育有極顯著的抑制作用，而在低濃度下無(wú)抑制作用。

2.1.6 卵 子 由圖6可知，當(dāng)水體中ADD濃度為500和2 000 μg/L時(shí)，雌性食蚊魚的卵子數(shù)量極顯著少于對(duì)照，而當(dāng)濃度為50和200 μg/L時(shí)，雌性食蚊魚的卵子數(shù)量稍低于對(duì)照，但差異不顯著。因此，可認(rèn)為高濃度的ADD條件下，雌性食蚊魚的卵子數(shù)量發(fā)生了特變，而低濃度的ADD對(duì)雌性食蚊魚卵子數(shù)量的影響不顯著。

2.2 水體中ADD暴露對(duì)雌性食蚊魚各組織結(jié)構(gòu)的影響

2.2.1 性 腺 卵母細(xì)胞的發(fā)育可分為6個(gè)時(shí)期，分別為：I時(shí)期，卵原細(xì)胞時(shí)相；II時(shí)期，初級(jí)卵母細(xì)胞；III時(shí)期，卵黃泡出現(xiàn)時(shí)期；IV時(shí)期，卵黃充滿時(shí)相；V時(shí)期，成熟卵細(xì)胞時(shí)相；VI時(shí)期，退化吸收時(shí)期。圖7中A和B分別為空白對(duì)照和藥劑對(duì)照的食蚊魚的性腺，為正常狀態(tài)下的卵母細(xì)胞，包含了I～VI個(gè)時(shí)期；圖8中C～F為卵黃充滿時(shí)期（IV時(shí)期），可以看出卵細(xì)胞發(fā)生了形變、腫脹，甚至出現(xiàn)了退化的卵母細(xì)胞，表明在50～2 000 μg/L的ADD作用下，食蚊魚卵細(xì)胞發(fā)育出現(xiàn)了阻礙和抑制。正常環(huán)境中的魚類通過(guò)下丘腦分泌促性腺激素釋放激素（GnRH），刺激促性腺激素的分泌，然后促性腺激素促進(jìn)雌激素的分泌，從而促使性腺發(fā)育。該試驗(yàn)結(jié)果顯示，食蚊魚的性腺發(fā)育受到ADD的抑制，而且隨著ADD濃度的增加，抑制作用越強(qiáng)。這可能與食蚊魚雌激素的分泌受到抑制或者是與食蚊魚性腺發(fā)育有關(guān)的激素分泌受到抑制有關(guān)。

2.2.2 肝 由圖8A和圖8B可知，正常情況下，食蚊魚的肝細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞質(zhì)均勻，細(xì)胞核位于細(xì)胞中心。但水體中加入了ADD之后，從圖8C～F可以看出，肝細(xì)胞的細(xì)胞核偏移中央，細(xì)胞腫大，出現(xiàn)了空泡結(jié)構(gòu)，細(xì)胞脂質(zhì)化程度逐漸加深。其中，圖8E和圖8F的空泡結(jié)構(gòu)較多，肝細(xì)胞腫大更嚴(yán)重。由此可知，ADD對(duì)雌性食蚊魚肝臟的毒害作用較為嚴(yán)重。

2.2.3 鰓 正常情況下，食蚊魚的鰓絲排列緊密，整齊，細(xì)長(zhǎng)均勻，如圖9A～B所示。當(dāng)水體中出現(xiàn)ADD以后，食蚊魚的鰓絲發(fā)生了變化，表現(xiàn)為鰓絲長(zhǎng)短不一，排列不整齊，甚至出現(xiàn)了退化現(xiàn)象；且隨著ADD濃度的增加，病變程度越嚴(yán)重，如圖9C～F。鰓是魚類的重要呼吸器官，魚體與外環(huán)境的氣體交換主要由鰓來(lái)完成。當(dāng)水體中存在ADD時(shí)，魚鰓直接暴露于ADD污染下，受其毒害作用而發(fā)生病變，而鰓發(fā)生病變必然會(huì)影響魚類的正常代謝和生長(zhǎng)；情況嚴(yán)重時(shí)，鰓的氣體的交換量（即呼出二氧化碳，吸收水中氧氣）不能維持最低生命活動(dòng)需要，魚類就會(huì)窒息死亡。

2.2.4 臀 鰭 如圖10A所示，正常情況下雌性食蚊魚的臀鰭長(zhǎng)度整齊，鰭條尖端分叉少。水體中加入ADD后，食蚊魚的臀鰭出現(xiàn)上短下長(zhǎng)，尖端分叉的現(xiàn)象（圖10B）。這表明在ADD的作用下，雌性食蚊魚的臀鰭有雄性化延長(zhǎng)的趨勢(shì)。

2.3 水體中ADD暴露對(duì)雌性食蚊魚生長(zhǎng)與生殖相互關(guān)系的影響

魚類的生長(zhǎng)包括營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)，肝體指數(shù)（HSI）和性體指數(shù)（GSI）的變化可以反映出生長(zhǎng)與生殖的相互關(guān)系，也可以反映卵黃的發(fā)生和積累過(guò)程。魚類卵黃的發(fā)生主要通過(guò)兩種形式：一是由卵母細(xì)胞自身合成，稱為內(nèi)源性卵黃合成或自動(dòng)合成；二是自卵母細(xì)胞以外的地方合成，然后進(jìn)入卵母細(xì)胞，稱為外源性卵黃合成。外源性卵黃的形成是在雌激素作用下，肝細(xì)胞中首先合成卵黃前體物質(zhì)（卵黃蛋白原），然后經(jīng)血液循環(huán)運(yùn)輸?shù)铰殉玻偻ㄟ^(guò)微胞飲作用被卵母細(xì)胞吸收，最終在卵母細(xì)胞中裂解為卵黃蛋白，作為卵母細(xì)胞發(fā)育與成熟的物質(zhì)基礎(chǔ)。由圖11～12可以看出，各處理食蚊魚的HSI與GSI的變化趨勢(shì)相同，HIS和GSI均隨ADD濃度的增加而不斷降低。這說(shuō)明在ADD作用下，雌性食蚊魚卵巢的生理功能受到抑制而無(wú)法吸收或無(wú)法分解由肝細(xì)胞合成的卵黃蛋白原，或卵黃蛋白原的輸送受到抑制。

綜上所述，在ADD作用下，雌性食蚊魚的HSI與GSI具有正相關(guān)的效應(yīng)，營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)與生殖生長(zhǎng)均受ADD抑制。

3 結(jié) 論

試驗(yàn)結(jié)果表明，雌性食蚊魚的各項(xiàng)生理指標(biāo)均受水體中雄性激素ADD的影響，且影響程度隨著ADD濃度的增加而增加。從形態(tài)特征來(lái)看，隨著雄性激素ADD的加入，食蚊魚的體長(zhǎng)和臀鰭長(zhǎng)變短，體重、性腺重和肝重變輕，卵子數(shù)量變少。從組織結(jié)構(gòu)來(lái)看，隨著雄性激素ADD的加入，卵細(xì)胞發(fā)生了形變、腫脹，甚至退化；肝細(xì)胞的細(xì)胞核偏移中央，細(xì)胞腫大，出現(xiàn)了空泡結(jié)構(gòu)，細(xì)胞脂質(zhì)化程度逐漸加深；鰓絲長(zhǎng)短不一，排列不整齊，甚至出現(xiàn)了退化現(xiàn)象；臀鰭出現(xiàn)上短下長(zhǎng)，尖端分叉的現(xiàn)象。從生長(zhǎng)與生殖的相互關(guān)系來(lái)看，HIS和GSI均隨ADD濃度的增加而不斷降低?？傮w來(lái)講，水體中雄性激素ADD會(huì)引發(fā)雌性食蚊魚出現(xiàn)雄性化的第二性征。

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（責(zé)任編輯：成 平）