4種提取工藝制備潰結(jié)康栓對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠的治療作用

李麗霞，何 毅，馬東明，馬曉偉，裴 帥，夏鴻東，張懂懂，鄭雪瑩，黃芝娟*，肖學(xué)鳳*

（1 .天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津 300193；

2 .天士力制藥集團股份有限公司創(chuàng)新中藥關(guān)鍵技術(shù)國家重點實驗室，天津 300410）

4種提取工藝制備潰結(jié)康栓對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠的治療作用

李麗霞1，何 毅2，馬東明1，馬曉偉1，裴 帥1，夏鴻東1，張懂懂1，鄭雪瑩1，黃芝娟2*，肖學(xué)鳳1*

（1 .天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津 300193；

2 .天士力制藥集團股份有限公司創(chuàng)新中藥關(guān)鍵技術(shù)國家重點實驗室，天津 300410）

目的 研究4種提取工藝制備的潰結(jié)康栓對2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎（UC）大鼠的治療作用。方法 SD雄性大鼠隨機分為正常對照組、模型組、美沙拉秦栓組和4種提取工藝制備的潰結(jié)康栓組共7組，每組10只，用TNBS法復(fù)制UC大鼠模型，各給藥組給予相應(yīng)栓劑治療，連續(xù)14 d。以各組實驗大鼠疾病活動指數(shù)（DAI）、結(jié)腸黏膜損傷度、組織病理學(xué)改變、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-4（IL-4）等為指標(biāo)，對其治療療效進(jìn)行評價。結(jié)果 模型組大鼠DAI評分、結(jié)腸黏膜損傷評分，血清中TNF-α、IL-1β及IL-4水平與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），美沙拉秦栓組、各工藝潰結(jié)康栓組DAI評分、結(jié)腸黏膜損傷評分顯著降低，TNF-α、IL-1β 及IL-4水平與模型組比較有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；美沙拉秦栓組與工藝Ⅰ潰結(jié)康栓組、工藝Ⅳ潰結(jié)康栓組DAI評分，TNF-α、IL-1β及IL-4水平比較無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論 4種提取工藝制備的潰結(jié)康栓均對TNBS誘導(dǎo)的UC模型大鼠有治療作用，其中以提取工藝Ⅳ制備的潰結(jié)康栓療效尤為顯著，可為潰結(jié)康栓制劑研究提供工藝基礎(chǔ)。

潰結(jié)康栓；提供工藝；潰瘍性結(jié)腸炎

Abstract:?Objective To study effects of Kuijiekang suppository with four different processes on rats with ulcerative colitis induced by TNBS.Methods SD male rats were randomly divided into control group, model group,positive control group and four groups of Kuijiekang suppository with four different processes,10 rats per group.Rats model of ulcerative colitis set up by rectally administration of TNBS, except control group、model group, were given the appropriate medication to treat for 14 days.Take disease activity index, colon tissue injuries of scores, pathology,TNF-α, IL-1β, IL-4 as the detection indicator and evaluate the treatment.Results Compared with the control group,the model rats showed DAI significantly increased, the levels of TNF-α, IL-1βincreased (P＜0.01), and IL-4 decreased(P＜0.01).Compared with the model group, different processes and positive control group showed DAI significantly decreased (P＜0.05), the levels of TNF-α, IL-1βdecreased (P＜0.05), and IL-4 (P＜0.05) increased.Conclusion Kuijiekang suppositories with different processes rectly have effect on the ulcerative colitis induced by TNBS,especially in the first and the fourth process.Thus, the fourth process should be taken into consideration to conduct the next research.

Keyword:?Kuijiekang suppository; process; UC

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是一種病因尚不明確的慢性、非特異性炎癥性疾病，屬炎癥性腸病的一個主要類型。病變多位于乙狀結(jié)腸和直腸，可擴展至近端結(jié)腸、橫結(jié)腸甚至全結(jié)腸，潰瘍嚴(yán)重者可侵及肌層及漿膜層，甚至導(dǎo)致腸穿孔。該病病程長、易復(fù)發(fā)、治愈難度大，被世界衛(wèi)生組織列為現(xiàn)代難治病之一，嚴(yán)重威脅人類生存質(zhì)量和健康水平，又有高癌變風(fēng)險[1-2]。潰結(jié)康灌腸液是天士力制藥集團股份有限公司開發(fā)的中藥六類新藥，由赤芍、青黛、爐甘石、白及等中藥配制而成，治療UC療效顯著[3-5]，但存在灌腸后藥液腸容納性低、患者依從性差等缺陷，在此基礎(chǔ)上，筆者根據(jù)原處方及制劑工藝進(jìn)行劑型改革，結(jié)合栓劑制備預(yù)實驗、文獻(xiàn)調(diào)研及以往的開發(fā)經(jīng)驗，優(yōu)選4種工藝進(jìn)行藥效學(xué)研究，通過對UC大鼠的治療作用評價，篩選出最佳的提取工藝，從而為潰結(jié)康栓制劑研究提供提取工藝基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級SD大鼠70只，雄性，體質(zhì)量（200±20）g，動物許可證號：SCXK-（軍）2012-0004，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供。

1.1.2 藥品與試劑 美沙拉秦栓由實驗室自制，美沙拉秦原料（湖北巨勝科技有限公司），硬脂酸聚烴氧（40）酯（S-40）（湖北遠(yuǎn)成賽創(chuàng)科技有限公司），5% 2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）（sigma公司），福爾馬林由實驗室配制，甲醛溶液，分析純，批號20160111，天津市化學(xué)試劑供銷公司，白介素-1β（IL-1β）Elisa試劑盒、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-4（IL-4）Elisa試劑盒（武漢云克隆科技股份有限公司），氯化鈉注射液（河北天成藥業(yè)股份有限公司）。

1.1.3 儀器 FA2004電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司），栓劑模型（江蘇省諸暨醫(yī)藥設(shè)備廠），L600臺式低速離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司），Infinite 200型多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司），DK-98-Ⅱ水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司），遠(yuǎn)紅外恒溫干燥箱（余姚市遠(yuǎn)東數(shù)控儀器廠），Motic BA410 生物顯微鏡（麥克奧迪實業(yè)集團有限公司），Motic Pro 282A-數(shù)碼顯微系統(tǒng)（麥克奧迪實業(yè)集團有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 潰結(jié)康栓制備 工藝Ⅰ：赤芍等藥材12倍量水提2次，每次1 h，干燥，粉碎；青黛、爐甘石等藥材粉碎，均過100目藥篩，混勻，制得藥粉Ⅰ。工藝Ⅱ：赤芍、青黛、白及等藥材12倍量水提2次，每次1 h，干燥，粉碎；爐甘石等藥材粉碎，均過100目篩，混勻，制得藥粉Ⅱ。 工藝Ⅲ：赤芍、白及等藥材12倍量水提2次，每次1 h，干燥，粉碎；青黛等藥材12倍量80 %乙醇提取2次，每次2 h；爐甘石粉碎，均過100目篩，混勻，制得藥粉Ⅲ。工藝Ⅳ：赤芍等藥材12倍量水提2次，每次1 h，干燥，粉碎；白及以水提醇沉方式制得白及粗多糖；青黛、爐甘石等藥材過100目篩，混勻，制得藥粉Ⅳ。4種藥粉以S-40為基質(zhì)，基質(zhì)：藥粉=1：1，制得4種栓劑，工藝Ⅰ潰結(jié)康栓、工藝Ⅱ潰結(jié)康栓、工藝Ⅲ潰結(jié)康栓，工藝Ⅳ潰結(jié)康栓。

1.2.2 實驗分組 SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機分為正常對照組、模型組、美沙拉秦栓組、工藝Ⅰ潰結(jié)康栓組、工藝Ⅱ潰結(jié)康栓組、工藝Ⅲ潰結(jié)康栓組、工藝Ⅳ潰結(jié)康栓組共7組，每組10只。

1.2.3 大鼠UC模型的建立 1）TNBS乙醇溶液配制：5 % TNBS與50 % 乙醇體積比3：2混勻，4 ℃保存。2）UC大鼠模型的復(fù)制[6]：大鼠造模前禁食不禁水24 h，稱重后，10 %水合氯醛溶液（3 mL/kg）腹腔麻醉，固定于手術(shù)臺上，將外徑2 mm、長約15 cm硅膠管于溫水中浸泡至軟，硅膠管外壁涂抹少許甘油，插入大鼠肛門6～8 cm，以TNBS乙醇溶液120 mg/kg（4 mL/kg）緩慢注入，夾閉肛門，倒置，使造模液充分作用于腸腔，正常對照組大鼠給予相同劑量的生理鹽水灌腸。造模后大鼠側(cè)臥歸籠，自然清醒。造模后每天記錄大鼠體質(zhì)量、飲食、活動狀態(tài)及糞便情況。

1.2.4 給藥方法 于大鼠造模第3天后給藥，放入自制固定容器內(nèi)，使肛門完全暴露，給藥。工藝Ⅰ潰結(jié)康栓組、工藝Ⅱ潰結(jié)康栓組、工藝Ⅲ潰結(jié)康栓組、工藝Ⅳ潰結(jié)康栓組給藥劑量 4 mL/kg；美沙拉秦栓組給藥劑量100 mg/kg，模型組與正常對照組給予4 mL/kg蒸餾水。給藥前禁食不禁水12 h，用直徑2 mm、長15 cm于溫水中軟化的硅膠管涂抹少量甘油后從肛門插入約6～8 cm，緩慢推入，給藥后夾閉肛門，倒置。給藥1次/d，連續(xù)14 d。

1.2.5 標(biāo)本采集 給藥后第14天晚禁食，次日對各組大鼠稱重，10 %水合氯醛（3 mL/kg）腹腔麻醉，腹主動脈取血，離心，取上清液，分裝，- 20 ℃冰箱保存。迅速剖開腸系膜，分離肛門至盲腸之間的全部直腸和結(jié)腸，觀察大鼠結(jié)腸6～8 cm外觀形態(tài)，沿縱軸剖開腸管，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗腸管內(nèi)殘留物，平鋪展開，肉眼觀察黏膜病變情況，記錄潰瘍個數(shù)，直尺測量潰瘍面大小。取1 cm大小的潰瘍面，10 %福爾馬林液浸泡固定，常規(guī)石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅染色法（HE）染色，光鏡下觀察結(jié)腸的病理組織學(xué)形態(tài)。

1.3 檢測指標(biāo) 1 ）大鼠一般情況： 觀察并記錄各組大鼠精神狀態(tài)、飲食、活動、毛色、大便性狀、體質(zhì)量等情況，各組大鼠進(jìn)行DAI評分標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[7]。2 ）大鼠結(jié)腸黏膜損傷評分標(biāo)準(zhǔn)，參照文獻(xiàn)[8-9] ：觀察結(jié)腸黏膜大體形態(tài)損傷、組織病理學(xué)改變。3 ）生化指標(biāo)測定：運用雙抗體夾心ELISA法檢測血清TNF-α、IL-1β、IL-4 水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差（x± s ）表示，采用單因素方差分析進(jìn)行各組間差異比較，以P＜0.05為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況及DAI評分 正常對照組大鼠體質(zhì)量正常增長，無腹瀉、血便等異常改變。造模組大鼠在造模1 h后尿液顏色呈橘黃色，表明TNBS溶液已被吸收；造模組大鼠造模當(dāng)天即出現(xiàn)精神不振、少動、厭食等表現(xiàn)；造、模后第2天即出現(xiàn)稀糊便，夾帶膿血，1周內(nèi)均伴有體質(zhì)量下降，毛色無光澤、枯燥，少動等表現(xiàn)。4種提取工藝制備的潰結(jié)康栓組、美沙拉秦栓組隨著給藥時間的持續(xù)，癥狀明顯好轉(zhuǎn)，大便逐漸恢復(fù)正常，呈灰褐色顆粒狀，毛色逐漸轉(zhuǎn)為光亮順滑。DAI評分結(jié)果,見表1。

表1 各組大鼠DAI評分（x± s ，n=6） 分

2.2 潰結(jié)康栓對UC大鼠病理形態(tài)學(xué)的影響 正常對照組大鼠結(jié)腸管壁無增厚，皺襞紋理清晰，黏膜光滑，鏡下觀察黏膜組織完整，細(xì)胞形態(tài)正常，黏膜固有層腺體排列整齊，含有大量的杯狀細(xì)胞，無炎性細(xì)胞浸潤。模型組大鼠結(jié)腸腸管局部充血、腸襞增厚，纖維化，失去彈性，可見明顯水腫和潰瘍，鏡下觀察結(jié)腸黏膜破壞，腺體結(jié)構(gòu)紊亂，大量腺體被破壞消失，部分形成潰瘍，隱窩消失，大量中性粒細(xì)胞浸潤至黏膜下層、肌層，并且黏膜下層血管擴張、肌層增厚水腫。工藝Ⅰ潰結(jié)康栓組大鼠結(jié)腸黏膜仍見殘缺斷裂，杯狀細(xì)胞增多，潰瘍面情況改善，黏膜及黏膜下層中性粒細(xì)胞浸潤減少，黏膜充血水腫。工藝Ⅱ、工藝Ⅲ潰結(jié)康栓組大鼠鏡下觀察結(jié)腸黏膜杯狀細(xì)胞增多，仍可見隱窩膿腫，黏膜及黏膜下層有明顯中性粒細(xì)胞浸潤，與模型組相比，炎癥侵犯的深度和范圍減小。美沙拉秦栓組、工藝Ⅳ潰結(jié)康栓組大鼠結(jié)腸腸管輕度充血，未見水腫和潰瘍，鏡下觀察結(jié)腸黏膜杯狀細(xì)胞增多，腺體排列基本整齊，極少數(shù)仍見殘缺斷裂，少量中性粒細(xì)胞浸潤。結(jié)腸黏膜大體評分結(jié)果，見表2。

表2 各組大鼠結(jié)腸黏膜損傷評分（x ± s , n=6） 分

2.3 潰結(jié)康栓對UC大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-4的影響 見表3。

表3 各組大鼠血清中細(xì)胞因子水平比較（x± s , n=6）pg/mL

3 小結(jié)

從本實驗的結(jié)果可知：與模型組比較，不同工藝潰結(jié)康栓組DAI評分、結(jié)腸黏膜損傷評分、血清中TNF-α、IL-1β水平顯著降低，IL-4水平顯著升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），說明不同提取工藝潰結(jié)康栓對UC大鼠有不同程度的治療作用，其中工藝Ⅰ潰結(jié)康栓組和工藝Ⅳ潰結(jié)康栓組更為明顯，但是由于提取工藝Ⅰ中白及以原藥粉直接加入而制備潰結(jié)康栓，白及富含白及粗多糖，有特殊的粘性，在制栓過程中直接導(dǎo)致制栓液粘稠，注模困難。工藝Ⅱ、工藝Ⅲ潰結(jié)康栓組各指標(biāo)差異較不明顯，分析原因可能是潰結(jié)康復(fù)方臣藥青黛、血竭中藥效成分未被提取完全，而中藥復(fù)方是由藥物配伍共同發(fā)揮治療作用，這也進(jìn)一步提示對中藥復(fù)方物質(zhì)基礎(chǔ)研究的必要性。綜合以上結(jié)果，再結(jié)合實際生產(chǎn)條件，本課題選用工藝Ⅳ作為最佳提取工藝，以制備潰結(jié)康栓[10-12]。

[1]EADEN J A, ABRAMS K R, MAYBERRY J F.The risk of colorectal cancer in ulcerative colitis a meta-analysis[J].Gut,2001, 50(4)： 526-535.

[2]RUTTER M D, SAUNDERS B P, WILKINSON K H, et al.Cancer surveillance in longstanding ulcerative colitis：endoscopic appearances help predict Cancer risk[J].Gut, 2004,53(12)： 1813-1816.

[3]王桂娟.潰結(jié)康治療潰瘍性結(jié)腸炎的臨床與實驗研究[D].濟南： 山東中醫(yī)藥大學(xué), 2002.

[4]李婧.潰結(jié)康對TNBS誘導(dǎo)大鼠克羅恩病模型的治療作用[D].天津： 天津醫(yī)科大學(xué), 2016.

[5]于培.潰結(jié)康對噁唑酮誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型的治療作用[D].天津： 天津醫(yī)科大學(xué), 2016.

[6]MORRI J P, BECK P L, HERRIDEGE M S, et al.Hapteninduced Model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon[J].Gastroenterology, 1989, 96(3)： 795-803.

[7]KOETZNER L, GROVER G, BOULET J, et al.Plant-derived polysaccharide supplements inhibit dextran sulfate sodiuminduced colitis in the rat[J].Dig Dis Sci, 2010, 55(5)： 1278.

[8]LUK H H, KO J K, FUNG H S, et al.Delineation of the protective action of Zinc sulfate on ulcerative colitis in rats[J].Eur J Pharmacol, 2002, 443(1/3)： 197-204.

[9]D’ARIENZO A, MANGUSO F, ASTARITA C, et al.Allergy and mucosal eosinophil infiltrate in ulcerative colitis[J].Scand J Gastroenterol, 2000, 35(6)： 624-631.

[10]FABIA R, WILLéN R, Ar'RAJAB A, et al.Acetic acidinduced colitis in the rat： a reproducible experimental model for acute ulcerative colitis[J].Eur Surg Res, 1992, 24(4)： 211.

[11]GUAN Q, MA Y, HILLMAN C L, et al.Targeting IL-12/IL-23 by employing a p40 peptide-based vaccine ameliorates TNBS-induced acute and chronic murine colitis[J].Mol Med,2011, 17(7/8)： 646-656.

[12]趙曼, 高峰.潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機制研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2010, 10(16)： 3160-3165.

Therapeutic effect of Kuijiekang suppository with different processes on rats with ulcerative colitis induced by TNBS

LI Lixia1, HE Yi2, MA Dongming1, MA Xiaowei1, PEI Shuai1, XIA Hongdong1, ZHANG Dongdong1,ZHENG Xueying1, HUANG Zhijuan2*, XIAO Xuefeng1*
（1.School of Chinese Materia Medica, Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193, China;2.State Key Laboratory of Core Technology in Innovative Chinese Medicine,Tasly Pharmaceutical Group Co, Ltd, Tianjin 300410, China）

R283.1

A

2095-6258(2017)05-0708-04

2017-03-18）

10.13463/j.cnki.cczyy.2017.05.007

國家自然科學(xué)基金“中藥質(zhì)量戰(zhàn)略研究”（81642011）。

李麗霞（1990 -），女，碩士研究生，主要從事藥學(xué)專業(yè)方向研究。

* 通信作者：肖學(xué)鳳，女，教授，碩士研究生導(dǎo)師，電話-（022）59596221，電子信箱-kai1219@163.com黃芝娟，女，高級工程師，電話-（022）86343778，電子信箱-huangzj@tasly.com