三黃膠囊對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的抗炎作用

李梅珍，唐秋月，梁國(guó)強(qiáng)

（1.蘇州市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，江蘇 蘇州 215003；2.蘇州市吳門醫(yī)派研究院，江蘇 蘇州 215003）

·實(shí)驗(yàn)研究·

三黃膠囊對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的抗炎作用

李梅珍1，唐秋月1，梁國(guó)強(qiáng)2*

（1.蘇州市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，江蘇 蘇州 215003；2.蘇州市吳門醫(yī)派研究院，江蘇 蘇州 215003）

目的 通過(guò)觀察三黃膠囊對(duì)尿酸鈉（MSU）致急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清及膝關(guān)節(jié)液中白介素-β（IL-β）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）或環(huán)氧酶2( COX-2)水平的影響，探討三黃膠囊治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的機(jī)制。方法 將大鼠分為正常組，模型組，三黃膠囊組（6.45 g 生藥/kg），秋水仙堿組(0.325 mg/kg)。正常組和模型組灌胃生理鹽水；各給藥組按劑量灌胃給藥，連續(xù)14 d。末次給藥1 h后，正常組右側(cè)踝關(guān)節(jié)腔注射100 mL無(wú)菌1%磷酸鹽緩沖液（PBS），其余各組注射100 mL MSU溶液，于造模后24 h用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)血清和關(guān)節(jié)滑液中IL-β、TNF-α或COX-2水平；光鏡下觀察其對(duì)大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織病理變化的影響。結(jié)果 與正常組比較，模型組MSU注射進(jìn)大鼠踝關(guān)節(jié)腔24 h后，在大鼠血清中IL-β、TNF-α和關(guān)節(jié)滑液中IL-β、TNF-α及COX-2的含量均明顯增加（P＜0.05）；與模型組比較，三黃膠囊組及秋水仙堿組均顯著降低MSU致大鼠痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎血清IL-β、TNF-α及關(guān)節(jié)滑液中IL-β、TNF-α和COX-2水平（P＜0.05）；造模組滑膜組織的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、纖維組織增生、滑膜細(xì)胞增生、水腫、充血的病理改變較中藥組和西藥組嚴(yán)重。結(jié)論 MSU可以增加血清IL-β、TNF-α及關(guān)節(jié)滑液中IL-β、TNF-α和COX-2的水平；三黃膠囊可能通過(guò)降低IL-β、TNF-α和COX-2的水平產(chǎn)生抗MSU痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的作用。

三黃膠囊；尿酸鈉；急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎

Abstract:?Objective To observe the effects of Sanhuang capsule oninter IL-β, TNF-α and COX-2 levels in the serum and the ankle joint fluid, and explore the therapeutic mechanism of Sanhuang capsule on gouty arthritis induced by MSU crystal in rats.Methods The rats were divided into normal group, model group, Sanhuang capsule group(6.45g/kg), colchicine group (0.325 mg/kg).The normal group and model group were ig (intragastric administration)administered with normal saline, various treatment groups were ig administered with corresponding doses for continuous 14 days.One hour after the last administering, 100 l sterile 1% PBS was injected in on the right side ankle joint cavity in normal group, and 100l MSU was injected in other groups.Twenty-four hour after modeling,ELISA method were used to detect IL-, TNF-α or COX-2 levels in the serum and ankle joint fluid.and the pathologic changes of synovial tissues were observed by microscope.Results Compared with the normal group, the levels of IL-and TNF-α in serum and IL-β,TNF-α,COX-2 in ankle joint fluid were significantly increased after injection of MSU into the ankle joint of rats (P＜0.05) after 24h.Compared with the model group, the levels of IL-β and TNF-α in the rat and IL-β, TNF-α, COX-2 in ankle joint fluid induced by MSU were significantly decreased in Sanhuang Capsule and colchicine group (P＜0.05).the total index of synovial tissue of model of inflammatory cell infiltration, fiber optic proliferation, synovail cell proliferation, edema, congestion were more severe than those in the Chinese herbs group and western Medicine group.Conclusion MSU can increase the levels of IL-β,TNF-α in serum and IL-β, TNF-α and COX-2 in ankle joint fluid.Sanhuang capsule may have the effect on MSU induced gouty arthritis by decreasing IL-β,TNF-α and COX-2 level.

Keywords:?Sanhuang capsule; monosodium urate; acute gouty arthritis

研究[1-3]顯示，高尿酸血癥是發(fā)生痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎（GA）的基礎(chǔ)，也可能存在其他誘發(fā)因素。急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎屬中醫(yī)“痹證”“歷節(jié)病”“白虎歷節(jié)”范疇?！陡裰掠嗾摗ね达L(fēng)論》載：“熱血得寒，污濁凝澀，所以作痛”。中醫(yī)認(rèn)為，本病的發(fā)生多由先天正氣不足或勞倦過(guò)度，風(fēng)、寒、濕、熱之邪侵襲人體，痹阻關(guān)節(jié)經(jīng)絡(luò)，以致經(jīng)絡(luò)阻滯，氣血運(yùn)行不暢而致。初起屬實(shí)證，多為濕熱痹阻、氣滯血瘀[4-7]。三黃膠囊為蘇州市中醫(yī)醫(yī)院醫(yī)院制劑，由大黃、黃芩、黃柏3味中藥組成，具有清熱解毒、除濕、活血消腫之功效，本研究用于治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎，療效確切穩(wěn)定[8-10]。本研究筆者采用大鼠右側(cè)踝關(guān)節(jié)注射尿酸鈉制作急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型，探討三黃膠囊防治急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的抗炎機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD雄性大鼠180～220 g，購(gòu)自昭衍（蘇州）新藥研究中心有限公司，許可證號(hào)：scxk（蘇）2013-0003。飼養(yǎng)條件一致，室溫（24±2）℃，標(biāo)準(zhǔn)飼料（由蘇州雙獅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料科技有限公司中心提供），自由攝食、飲水。

1.2 藥品與試劑 三黃膠囊（蘇州市中醫(yī)醫(yī)院醫(yī)院制劑，藥劑科提供）；秋水仙堿（廣東彼迪藥業(yè)有限公司）；尿酸鈉晶體（美國(guó)sigma-aidrich公司生產(chǎn)，蘇州大學(xué)惠贈(zèng)）；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（武漢百浩天生物科技有限公司）； IL-β、TNF-α、COX-2酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）測(cè)定試劑盒（上海邦奕生物科技有限公司）；戊巴比妥鈉（Sigma 公司生產(chǎn)）；乙醚、甲醛等其他試劑均為市售分析醇。

1.3 主要儀器 蔡司倒置熒光顯微鏡（德國(guó)Zeiss，型號(hào)：Discovery.V20）；紫外-可見(jiàn)酶標(biāo)儀（美國(guó)MD，型號(hào)：SPECTRA MAX 190）；AX-26DR萬(wàn)分之一分析天平：瑞士梅特勒-托利多公司；TG16W離心機(jī)：微量高速離心機(jī)（國(guó)產(chǎn)）等。

2 方法

2.1 藥物配制 成人（60 kg）每日三黃膠囊、秋水仙堿常用量分別為27 g生藥、3 mg，由此換算[11]得出2種干預(yù)藥物的用量分別為6.45 g生藥/（kg·d）、0.325 mg/(kg·d)。依據(jù)上述用藥量計(jì)算出每只大鼠的用藥量，分別配置成相當(dāng)于0.645 g生藥/mL的三黃膠囊藥液和0.325 mg/mL的秋水仙堿片混懸液，4 ℃保存，用前搖勻，以10 mL/kg體積灌胃給藥。

2.2 分組與給藥 取32只SD雄性大鼠，隨機(jī)法分為4組（n=8）：空白對(duì)照組（同體積生理鹽水），模型對(duì)照組（同體積生理鹽水），西藥對(duì)照組（秋水仙堿）0.325 mg/(kg·d)；中藥實(shí)驗(yàn)組（三黃膠囊藥液）6.45 g生藥/(kg·d)。連續(xù)灌胃14 d，灌胃至13 d后造模。取500 mg MSU加入25 mL 0.9%氯化鈉注射液，攪拌制成濃度為20 mg/mL的MSU溶液。選受試大鼠右側(cè)踝關(guān)節(jié)背側(cè)，常規(guī)碘伏消毒后，用6號(hào)注射針與脛骨成45°插入踝關(guān)節(jié)，將100 μL MSU溶液注入到右側(cè)踝關(guān)節(jié)腔，以關(guān)節(jié)囊對(duì)側(cè)鼓起為注入標(biāo)準(zhǔn)，3 h后觀察受試大鼠關(guān)節(jié)腫脹明顯，即證明復(fù)制大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型成功[12-14]。第14天末次灌胃后1 h，將大鼠乙醚麻醉，股動(dòng)脈取血后頸椎脫臼處死。取血后先于室溫下自然放置20 min，3 000 r/min，離心10 min，分離血清，分裝置于EP管內(nèi)后置-80 ℃冰箱中冰凍保存。大鼠處死后立即收集右側(cè)踝關(guān)節(jié)內(nèi)關(guān)節(jié)滑液置于EP管內(nèi)-80 ℃冰箱中冰凍保存，同時(shí)取出右側(cè)踝關(guān)節(jié)軟組織，一部分置于EP管內(nèi)，-80℃冰箱中冰凍保存，另一部分置于10%福爾馬林中保存。

2.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法 大體觀察及蘇木素-伊紅（HE）染色觀察軟組織病理學(xué)變化；ELISA法檢測(cè)血清中IL-β、TNF-α 水平以及目標(biāo)關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)滑液中 IL-β、TNF-α和COX-2水平，操作均按試劑盒說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格進(jìn)行。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 15.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為正態(tài)分布，滿足方差齊性，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x± s ）表示，t 檢驗(yàn)采用配對(duì)t 檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大體觀察 造模3 h后，3組建模后與建模前比較，膝關(guān)節(jié)紅腫、皮膚溫度升高，尤以模型對(duì)照組明顯，西藥對(duì)照組和中藥實(shí)驗(yàn)組情況相近，空白對(duì)照組則無(wú)此反映。末次給藥后1 h（造模后24 h左右）踝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)滑液觀察：空白對(duì)照組無(wú)色、質(zhì)清、量少，其他3組均呈淺黃色、質(zhì)濁、量較多，尤以模型對(duì)照組明顯。3.2 目標(biāo)關(guān)節(jié)軟組織病理學(xué)變化 通過(guò)HE染色觀察目標(biāo)踝關(guān)節(jié)軟組織病理學(xué)變化，可見(jiàn)空白對(duì)照組滑膜組織無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、纖維組織增生、滑膜細(xì)胞增生和毛細(xì)血管充血、水腫；其他3組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、纖維組織增生、滑膜細(xì)胞增生和毛細(xì)血管充血、水腫明顯，尤以模型對(duì)照組最為明顯；說(shuō)明以MSU誘導(dǎo)的急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎建模成功，有明顯的病理反映；西藥對(duì)照組和中藥實(shí)驗(yàn)組2組與模型對(duì)照組比較，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、纖維組織增生、滑膜細(xì)胞增生和毛細(xì)血管充血、水腫程度均有所降低，而西藥對(duì)照組整體上優(yōu)于中藥實(shí)驗(yàn)組。

3.3 血清中IL-β和TNF-α水平 見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清中IL-β、TNF-α水平變化比較（x± s n=8） pg/mL

3.4 關(guān)節(jié)滑液中IL-β、TNF-α和COX-2水平 見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠踝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)滑液中IL-β、TNF-α和COX-2水平比較（x ± s ）

4 討論

隨著人民生活水平的提高，嘌呤類食物攝入增多，近年來(lái)痛風(fēng)的發(fā)病率逐年升高，急性復(fù)發(fā)性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)性慢性關(guān)節(jié)炎等成為嚴(yán)重危害人們生活的疾病[15-16]。目前，西藥治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性發(fā)作雖然有效，但嚴(yán)重的不良反應(yīng)限制了多數(shù)患者長(zhǎng)期使用[17]。急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的致炎因子是MSU結(jié)晶體，這種結(jié)晶體能刺激局部組織釋放出大量IL-β、TNF-α等多種炎癥介質(zhì)與致炎因子，引起關(guān)節(jié)周圍廣泛的炎癥。IL-β在中性粒細(xì)胞趨化、激活過(guò)程中起重要作用，是調(diào)節(jié)炎癥的始動(dòng)因素和炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)，主要存在于關(guān)節(jié)內(nèi)；TNF-α僅由巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞經(jīng)致炎因子刺激后釋放，可引起細(xì)胞死亡和組織損傷；COX-2是炎癥細(xì)胞合成炎癥介質(zhì)前列腺素的關(guān)鍵酶，與其他炎癥介質(zhì)一起參與了復(fù)雜的炎癥反應(yīng)過(guò)程，COX-2作為誘導(dǎo)酶還能被IL-β、TNF-α等誘導(dǎo)因素大量誘導(dǎo)和表達(dá)，引起炎癥反應(yīng)的擴(kuò)大和加重。因此，急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病與細(xì)胞因子IL-β、TNF-α的升高及中性粒細(xì)胞的聚集等因素密切相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察到MSU注射的大鼠模型的血清及關(guān)節(jié)腔液中細(xì)胞炎性因子IL-β、TNF-α與正常對(duì)照組大

鼠比較顯著性升高（P＜0.05），證明了模型復(fù)制的成功。相對(duì)于模型組，三黃膠囊顯著降低了血清和關(guān)節(jié)腔液中IL-β、TNF-α的水平及關(guān)節(jié)液中COX-2的水平，結(jié)合病理學(xué)觀察結(jié)果，表明與臨床抗炎效果一致，本研究還顯示，陽(yáng)性對(duì)照藥秋水仙堿作為急性痛風(fēng)的特效藥，也證明了其療效機(jī)制，整體療效優(yōu)于三黃膠囊，其作用機(jī)制是抑制粒細(xì)胞浸潤(rùn)和乳酸的形成，并不影響尿酸的生成與排泄。本研究提示，三黃膠囊是否可調(diào)節(jié)尿酸的生成與排泄而發(fā)揮、拓展中醫(yī)藥防治痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的作用，比如防治高尿酸血癥的轉(zhuǎn)歸方向研究等。由此可見(jiàn)這項(xiàng)研究不但驗(yàn)證了三黃膠囊的實(shí)驗(yàn)療效，而且有助于更好的提高和推廣三黃膠囊治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的應(yīng)用和作用機(jī)理的深入研究。

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Experimental research of Sanhuang capsule on acute gouty arthritis

LI Meizhen1, TANG Qiuyue1, LIANG Guoqiang2*
（1.Department of Osteopathia, Suzhou hospital of Traditional Chinese Medicine, Suzhou 215003, China;2Academy of Wumen Chinese Medicine, Suzhou 215003, China)

R285.5

A

2095-6258(2017)05-0696-04

2017-01-13)

10.13463/j.cnki.cczyy.2017.05.003基金項(xiàng)目：江蘇省青年醫(yī)學(xué)人才培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目（QNRC2016252）；江蘇省蘇州市科技局計(jì)劃項(xiàng)目（SYS201420）。

李梅珍(1971-)，女，副主任中藥師，主要從事中藥學(xué)相關(guān)飲片調(diào)劑、煎煮及膏方制備等研究。

*通信作者：梁國(guó)強(qiáng)，男，主管中藥師，電話-13584809803，電子信箱- 616250366@qq.com