不同連作年限懷牛膝根際土壤理化性質(zhì)及微生物多樣性

王娟英，許佳慧， 吳林坤， 吳紅淼， 朱 銓, 孔露霏, 林文雄,*

1 福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 福州 350002 2 福建農(nóng)林大學(xué)生物農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 福州 350002 3 福建農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)生態(tài)過(guò)程與安全監(jiān)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 福州 350002

不同連作年限懷牛膝根際土壤理化性質(zhì)及微生物多樣性

王娟英1,2,3，許佳慧2,3， 吳林坤1,2,3， 吳紅淼1,2,3， 朱 銓1,2,3, 孔露霏1,2,3, 林文雄1,2,3,*

1 福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 福州 350002 2 福建農(nóng)林大學(xué)生物農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 福州 350002 3 福建農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)生態(tài)過(guò)程與安全監(jiān)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 福州 350002

以不同連作年限懷牛膝根際土壤為材料，采用土壤農(nóng)化分析技術(shù)和磷脂脂肪酸生物標(biāo)記法，對(duì)土壤理化性質(zhì)以及根際微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。結(jié)果表明：懷牛膝連作會(huì)使大部分大量元素(全磷、堿解氮、速效磷和速效鉀)含量上升，而全氮、全鉀的變化并無(wú)明顯趨勢(shì)。全量鈣、全量鎂、全量錳和有效鋅的含量也會(huì)隨著連作年限的增加而增加。研究發(fā)現(xiàn)，懷牛膝連作1a的土壤與對(duì)照相比，根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)差別不大，但是與連作10a和30a的土壤相比微生物多樣性卻發(fā)生了明顯變化。土壤中總PLFAs、細(xì)菌、革蘭氏陰性菌Gram(-)及真菌含量都隨連作年限增加而明顯上升，微生物多樣性增加，且革蘭氏陽(yáng)性菌Gram(+)/革蘭氏陰性菌Gram(-)的比值隨著連作年限的增加而下降。此外，土壤中一些嗜熱解氫桿菌和真菌等參與土壤物質(zhì)循環(huán)和木質(zhì)素降解的微生物類(lèi)群數(shù)量明顯增加，假單胞菌等有益微生物類(lèi)群也顯著增多，這是牛膝連作促進(jìn)作用的生物學(xué)基礎(chǔ)。研究用藥用植物懷牛膝證明了植物根際微生物結(jié)構(gòu)和功能多樣性對(duì)植物連作促進(jìn)或連作抑制作用的產(chǎn)生與控制的生態(tài)學(xué)意義。

懷牛膝；連作促進(jìn)；磷脂脂肪酸；根際微生物

Abstract： In this study, the rhizosphere soils ofAchyranthesbidentata, which was grown in a monoculture for multiple years, were investigated for analyzing the major elements, trace elements and rhizosphere microbial community structure by means of agricultural chemistry and phospholipid fatty acid (PLFA) analysis techniques. The results showed that consecutive monocultures ofA.bidentataincreased the contents of major elements (total phosphorus, alkaline hydrolysis nitrogen, available phosphorus, and available potassium). However, the ability of consecutive monocultures to change the total nitrogen content and total potassium was not obvious. In addition, total calcium, total magnesium, total manganese, and available zinc contents also increased with the increasing years of monoculture. Further analysis of PLFA profiles showed that there were no obvious differences in the rhizosphere microbial community structures between the control and newly plantedA.bidentata. Besides, different results were depicted by 10 years and 30 years of consecutive monoculture, which showed that the total PLFA, bacteria (especially G-), and fungal content increased significantly, and the G+/G-ratio decreased with increasing years of monoculture. Moreover, some microbes involved in material cycling and lignin degradation, such asHydrogenobacter, fungi (PLFA18:2ω6,9), and some beneficial bacteria includingPseudomonasincreased significantly with increasing years of monoculture. These results suggest the important biological basis for the promotion mechanism ofA.bidentataunder a monoculture system. The case study exemplifies the ecological significance of rhizosphere microbial structure and its functional diversity in monoculture promotion or monoculture inhibition.

KeyWords:Achyranthesbidentata; continuous cropping promotion; phospholipid fatty acid; rhizosphere microorganisms

懷牛膝(AchyranthesbidentataBl.)為莧科牛膝屬多年生草本植物，主產(chǎn)于我國(guó)河南溫縣、武陟、博愛(ài)及沁陽(yáng)等地，是著名的“四大懷藥”之一。根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》記載，牛膝性味甘苦、酸平，具有補(bǔ)肝腎、散淤血、填精補(bǔ)髓、益陰活血之功效[1]。在長(zhǎng)期的生產(chǎn)實(shí)踐過(guò)程中，人們發(fā)現(xiàn)大約有70%以上的藥用植物連續(xù)在同一塊田地上種植后，會(huì)出現(xiàn)土壤微生態(tài)環(huán)境惡化，自身生長(zhǎng)發(fā)育不良，產(chǎn)量與藥用品質(zhì)下降等現(xiàn)象，即連作障礙(continuous monoculture problem)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，大部分塊根類(lèi)藥材(如地黃、人參、三七、當(dāng)歸等)常會(huì)出現(xiàn)這種現(xiàn)象，因而稱(chēng)之為忌連作藥用植物[2- 5]。然而，與之相反的是，懷牛膝是一種非常耐連作的道地藥材。近些年來(lái)作者在調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，頭茬懷牛膝品質(zhì)較差，而連作5a后其品質(zhì)明顯改善。當(dāng)連作10a以上時(shí)，懷牛膝地下部即藥用部位生長(zhǎng)良好，主根又長(zhǎng)又粗，須根和側(cè)根少，產(chǎn)量高、品質(zhì)好[6-7]。

有研究表明，藥用植物連作障礙的產(chǎn)生與其根系分泌物介導(dǎo)下，根際微生物結(jié)構(gòu)變異，病原菌增多，有益菌下降有關(guān)[8]。而連作促進(jìn)的產(chǎn)生及其機(jī)制至今仍是個(gè)迷。李娟等[9]運(yùn)用HPLC等技術(shù)測(cè)定牛膝主要藥用活性成分甾酮和皂苷含量，結(jié)果顯示麥茬地中首次種植的牛膝藥材中甾酮含量(0.5401 mg/g)和皂苷含量(1.0462 mg/g)均低于多年懷牛膝-小麥復(fù)種連作地中牛膝的甾酮(0.7493 mg/g)和皂苷含量(2.4381 mg/g)，因而推斷連作促進(jìn)可能與連作引起土壤中藥用活性成分的累積有關(guān)。然而，這些物質(zhì)能否有效促進(jìn)藥用植物本身的生長(zhǎng)發(fā)育，未見(jiàn)直接的試驗(yàn)證據(jù)報(bào)道。此外，有研究結(jié)果表明，植物根系分泌物進(jìn)入土壤后易被土壤微生物降解，很難達(dá)到實(shí)驗(yàn)室條件下的有效作用濃度[10]，因而，產(chǎn)生直接化感(direct allelopathy)促進(jìn)或抑制作用的可能性不大[11]。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究結(jié)果認(rèn)為，植物化感作用(包括連作化感促進(jìn)或連作化感抑制作用)是由植物根系分泌物介導(dǎo)而間接產(chǎn)生的化學(xué)生態(tài)學(xué)現(xiàn)象。換一句話(huà)說(shuō)，植物化感作用是植物與土壤微生物相互作用的結(jié)果。在這一過(guò)程中，根際環(huán)境作為土壤微生物活動(dòng)的一個(gè)復(fù)雜的、動(dòng)態(tài)的微生態(tài)系統(tǒng)，在植物生長(zhǎng)、吸收、分泌過(guò)程中扮演著重要角色。諸多研究表明，根際土壤微生物多樣性參與根際生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)轉(zhuǎn)化和循環(huán)，在維持土壤健康方面扮演著越來(lái)越重要的角色[12-13]。因此，從植物-微生物根際互作角度，探討懷牛膝連作促進(jìn)的根際生態(tài)學(xué)效應(yīng)是一項(xiàng)亟待解決的問(wèn)題。

研究植物根際土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)變化是植物-微生物根際互作機(jī)制的重要內(nèi)容之一。通常可采用可培養(yǎng)微生物法、磷脂脂肪酸生物標(biāo)記法(PLFAs)和BIOLOG技術(shù)、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(T-RFLP)、變性梯度凝膠電泳(DGGE)、同位素標(biāo)記等方法[14]。磷脂脂肪酸生物標(biāo)記法(PLFA)主要根據(jù)不同類(lèi)群微生物的指示PLFAs不同，具有高度專(zhuān)一性，能夠快速、直接提供土壤微生物的生物量和群落結(jié)構(gòu)的信息，且實(shí)驗(yàn)步驟要求較低，因此，該方法仍是目前較為常用的和有效的一種微生物群落結(jié)構(gòu)分析方法[15-16]。馬琨等[17]采用PLFAs方法研究發(fā)現(xiàn)，連作與間作處理下，馬鈴薯根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)差異大，具體表現(xiàn)在馬鈴薯與蠶豆間作下，其根際效應(yīng)比馬鈴薯與玉米間作的明顯。李奇松等[18]研究也發(fā)現(xiàn)在無(wú)隔和網(wǎng)隔處理(即存在間作作物地下部根系互作)時(shí)，玉米和花生間作不僅是產(chǎn)量高而且根際微生物總PLFAs、細(xì)菌、真菌都高于全隔(即不存在間作作物地下部根系互作)處理。可見(jiàn)PLFAs至今仍是經(jīng)濟(jì)有效的方法。據(jù)此，本研究采用PLFAs技術(shù)，以不同連作年限牛膝根際土壤為研究對(duì)象，探討牛膝根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)隨連作年限增加的動(dòng)態(tài)變化，為闡明牛膝的連作促進(jìn)機(jī)理提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

以“核桃紋”牛膝為供試品種，同一時(shí)間種植在不同連作年限的土壤中，在其塊根膨大期，采用五點(diǎn)取樣法收集不同土壤樣本，即收集以下4個(gè)處理的土壤樣本：(1)對(duì)照土，即對(duì)應(yīng)于各處理，且只種前作作物小麥的土壤(CK)；(2)連作牛膝1a的土壤；(3)連作10a的土壤；(4)連作30a的土壤。田地種植模式采用不同年限的復(fù)種連作，即前茬種植小麥，收獲后種植牛膝。

懷牛膝播種期為7月20日，花期7—9月，果期9—10月。播種前，施有機(jī)復(fù)合肥1200kg/hm2，翻地約50cm左右再整地播種。之后在整個(gè)牛膝生長(zhǎng)發(fā)育期間均采用相同的田間管理措施。本試驗(yàn)于懷牛膝塊根膨大期(9月20日)取樣，土壤樣品采用五點(diǎn)取樣法，牛膝根際土壤取樣方法如下：首先用鏟子去除懷牛膝地上部表層土壤，然后用鏟子挖出地下部塊根，輕輕抖去根圍土，收集塊根表面根際土。收集的土壤樣品過(guò)2mm孔徑篩子后分成兩部分，一部分風(fēng)干用于測(cè)定土壤理化性質(zhì)，另一部分用于提取土壤微生物磷脂脂肪酸。

1.2 土壤理化性質(zhì)測(cè)定方法

1.2.1 土壤中大量元素的測(cè)定

稱(chēng)取風(fēng)干后土壤1.000g土裝入開(kāi)氏瓶中，加入5mL濃硫酸，電壓調(diào)制360V，消煮3h至土變白。待其稍冷卻后，加入500μL過(guò)氧化氫，將電壓調(diào)制230V，以后每隔5min加少于500μL 過(guò)氧化氫，直至上清液變澄清后取出開(kāi)氏瓶。加入20mL雙蒸水，過(guò)濾，定容100mL。濾液保存用于全N、全P和全K的測(cè)定。堿解N的測(cè)定：采用堿解擴(kuò)散法。速效P的測(cè)定：采用(碳酸氫鈉浸提)鉬銻抗比色法。速效K的測(cè)定：采用醋酸銨浸提原子吸收法[19]。

1.2.2 土壤中微量元素的測(cè)定

全量微量元素測(cè)定：將土壤風(fēng)干后過(guò)孔徑為2mm的塑料篩，稱(chēng)取0.1000g土樣，加入5mL濃硝酸和1mL的30%過(guò)氧化氫，經(jīng)微波消解，微波儀工作條件如表1。

表1 微波儀工作條件

待冷卻后，將液體轉(zhuǎn)移至10mL離心管，10000r/min離心3min。將上清液倒出，用超純水定容至25mL，最后過(guò)濾備用，同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)。測(cè)定時(shí)采用WFX- 130A原子吸收分光光度計(jì)來(lái)測(cè)量土壤中全量Fe、Mn、Zn、Cu、Ca、Mg的含量[20](表2)。

有效態(tài)銅、鋅、鐵、錳的測(cè)定：采用二乙三胺五乙酸(DTPA)浸提法[21]，稱(chēng)取風(fēng)干后懷牛膝根際土壤10.00g于50mL離心管中，加入新鮮配制的DTPA浸提液20mL，蓋好瓶蓋，置于25℃，180r/min條件的搖床上搖3h，立即過(guò)濾。濾液立即用原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定。除了標(biāo)曲用DTPA浸提液配置外，濃度及儀器工作條件與全量元素測(cè)定方法相同。

1.3 土壤微生物群落PLFA生物標(biāo)記分析

土壤微生物群落結(jié)構(gòu)分析：采用磷脂脂肪酸(PLFA)生物標(biāo)記法進(jìn)行測(cè)定[22]。操作步驟為：將20mL的0.2mol/L的KOH甲醇溶液和4g的新鮮土樣加到50mL的離心試管中，混合均勻，在37℃下溫育1h(磷脂脂肪酸釋放，并甲脂化，樣品10min搖勻1次)。加入3mL 1.0mol/L的醋酸溶液(中和pH值)，充分混勻后加10mL正己烷(使PLFAs轉(zhuǎn)到有機(jī)相中)，600rpm/min離心15min，然后將上層正己烷轉(zhuǎn)到干凈試管中，用冷凍干燥儀揮發(fā)掉溶劑。最后將PLFAs溶解在1mL體積比為1∶1的正己烷∶甲基丁基醚溶液中，再加入10μmol/L的內(nèi)標(biāo)19∶0，過(guò)濾后用作GC分析。

表2 WFX-130A原子吸收分光光度計(jì)火焰法工作條件

采用美國(guó)Agilent 6890N型氣相色譜儀，條件：二階程序升高柱溫，70℃起始1min，接著20℃/min升至170℃，持續(xù)2min，爾后5℃/min升溫至280℃，維持5min，最后以40℃/min升溫至300℃，1.5min后結(jié)束。進(jìn)樣量1μL，進(jìn)樣分流比100∶1。

1.4 數(shù)據(jù)分析

方差分析采用Excel和DPS 3.0結(jié)合，數(shù)據(jù)均采用單因子方差，多重比較方法選用Tukey法(P<0.05)來(lái)分析。當(dāng)分析不同連作年限牛膝土壤的4個(gè)樣本之間土壤微生物PLFAs的分布特性時(shí)，將數(shù)據(jù)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化，以歐氏距離為聚類(lèi)尺度，用(WPGMA)進(jìn)行系統(tǒng)聚類(lèi)。并采用Canoco軟件進(jìn)行主成分(PCA)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)分析

2.1.1 土壤中大量元素分析

從表3可見(jiàn)，除了全氮、全鉀并無(wú)明顯的變化趨勢(shì)外，牛膝連作下，土壤中全磷、堿解氮、速效磷和速效鉀的含量均上升。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在連作10a的土壤中這些營(yíng)養(yǎng)成分的含量已經(jīng)有明顯的增加，而在連作30a的土壤中最高?？梢?jiàn)，懷牛膝連作會(huì)使土壤大部分大量元素(特別是速效的元素)含量上升。

表3 不同連作年限懷牛膝根際土壤中大量元素的含量

CK:表示對(duì)照土壤CK stands for control soil; 同一列不同字母表示不同樣品差異水平達(dá) 0. 05

2.1.2 土壤中微量元素分析

試驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)：除了土壤的全量鈣、全量鎂、全量錳含量隨著連作年限的增加而增加外，其它3種元素(如全量鐵、全量鋅和全量銅)的含量并無(wú)明顯增加的趨勢(shì)，有的甚至還呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)(表4)。對(duì)土壤有效態(tài)微量元素分析還發(fā)現(xiàn)，除了土壤有效鋅含量隨著連作年限的增加而增加外，土壤中有效鐵、有效鋅和有效錳含量都呈先下降后上升變化的規(guī)律(表5)，這說(shuō)明懷牛膝連作會(huì)影響土壤中全量微量元素的變化，但是對(duì)于土壤有效態(tài)的微量元素卻影響不顯著。

表4 不同連作年限懷牛膝根際土壤中全量微量元素的含量

表5 不同連作年限懷牛膝根際土壤中有效態(tài)微量元素的含量

2.3 不同連作年限懷牛膝根際土壤微生物群落PLFAs檢測(cè)

磷脂脂肪酸結(jié)果顯示，共檢測(cè)到15種PLFAs的生物標(biāo)記(表6)。包括細(xì)菌的PLFAs生物標(biāo)記，如12：0、16：0；革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌PLFAs生物標(biāo)記，如i14：0、a15：0、a17：0；革蘭氏陰性細(xì)菌PLFAs生物標(biāo)記，如16：1ω9t、16：1 ω 7c、cy19：0；放線(xiàn)菌PLFAs生物標(biāo)記，如10Me18：0；真菌PLFAs生物標(biāo)記，如18：2 ω6,9、18：1 ω9c；嗜熱解氫桿菌和原生生物的PLFAs生物標(biāo)記，分別是18：0和20：4 ω6c(6,9,12,15)，種類(lèi)豐富。除了在1a的根際土壤里未檢測(cè)到原生生物和13：0的PLFAs標(biāo)記外，其他磷脂脂肪酸在所有土壤里均有分布。且種植過(guò)牛膝的根際土壤PLFAs豐富度大部分都高于對(duì)照土壤。進(jìn)一步分析還發(fā)現(xiàn)，特別是16：0這類(lèi)磷脂脂肪酸的含量隨著連作年限的增加而增加，且增長(zhǎng)幅度非常明顯。而i14：0的含量則呈下降趨勢(shì)。

表6 不同連作年限牛膝根際土壤中各PLFAs的濃度

濃度單位 concentration unit：(nmol/g d.m. soil);1a表示種植牛膝第1年土壤 1 year refering to the rhizospheric soils ofAchyranthesbidentatamonocultured for one year;10a表示種植牛膝第10年土壤 10 year refering to the rhizospheric soils ofA.bidentatamonocultured for ten years，30a表示種植牛膝第30年土壤 30 year refering to the rhizospheric soils ofA.bidentatamonocultured for thirty years

2.4 不同連作年限懷牛膝根際土壤PLFAs種類(lèi)和含量變化

從表7可以看出，不同連作年限懷牛膝根際土壤磷脂脂肪酸(PLFAs)生物標(biāo)記種類(lèi)和含量差異明顯。但是不同連作年限的懷牛膝土壤微生物種類(lèi)和含量變化趨勢(shì)相似，都呈現(xiàn)出細(xì)菌>革蘭氏陰性細(xì)菌G->真菌>革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌G+的趨勢(shì)。并且發(fā)現(xiàn)與連作1a的土壤相比，除了G+的含量下降之外，連作10a和30a的土壤中其他的微生物(包括總PLFAs、細(xì)菌、G-、真菌)含量都明顯上升。另外，G+/G-的比值隨著連作年限的增加而下降，而真菌/細(xì)菌得比值表現(xiàn)出相反的變化趨勢(shì)。

表7不同連作年限牛膝根際土壤中總PLFAs和各類(lèi)菌所占百分比

Table7ThetotalPLFAsandpercentageofdifferentspecificmicrobialPLFAstototalonesinrhizosphericsoilsofAchyranthesbidentatamonoculturedforthedifferentyears

項(xiàng)目Item對(duì)照CK1a10a30a總PLFATotalPLFA83.1863c110.0285b126.5162a123.5279a細(xì)節(jié)Bacteria54.933a56.504a57.4441a57.1649aG+10.3961b12.4356a9.2338b9.4127bG-20.0886a20.5265a21.3383a21.6644a真菌Fungi20.9642a17.7198b18.1142b20.5061a細(xì)菌/真菌G+/G-/%51.8839b60.5722a43.2946c43.48cFungi/Bacteria/%38.1893a31.367b31.5483b35.9248ab

Total PLFA濃度單位concent unit：(nmol/g d.m. soil);其它單位用“%”表示the other units indicated in “%”

2.5 基于PLFAs生物標(biāo)記的不同連作年限懷牛膝聚類(lèi)及主成分分析

將所有土壤樣品(6個(gè)處理，3次重復(fù))進(jìn)行主成分分析(圖1A)，發(fā)現(xiàn)牛膝連作對(duì)根際微生物群落結(jié)構(gòu)有明顯影響。主成分1(PC1)和主成分2(PC2)分別解釋總方差變量的44.3%和74.2%。對(duì)照和連作1a的懷牛膝根際土壤距離相近，均分布于主成分1的正端，連作10a與連作30a的距離較近，均分布于主成分1的負(fù)端。如圖1B所示，當(dāng)歐式距離為14.23時(shí)，不同連作年限懷牛膝根際土壤可聚為兩大類(lèi)，第一類(lèi)包括CK，連作1a懷牛膝根際土壤，而連作10a和連作30a的懷牛膝根際土壤則聚在第二類(lèi)中，說(shuō)明這些土壤微生物多樣性相類(lèi)似，生物量相近。這結(jié)果與主成分分析的結(jié)果相類(lèi)似。綜合主成分與聚類(lèi)分析結(jié)果可以看出，連作年限短的土壤樣品(如連作1a)明顯區(qū)別于連作年限長(zhǎng)的土壤樣品(如連作10a、連作30a)。

圖1 不同連作年限牛膝根際土壤中PLFAs生物標(biāo)記主成分分析(A)和聚類(lèi)分析(B)Fig.1 Classification of PLFAs biomarks in rhizospheric soils of Achyranthes bidentata monocultured for different years by principal component (A) and WPGMA cluster analysis (B)

2.6 不同連作年限牛膝根際土壤中各類(lèi)PLFAs和大量元素冗余分析(RDA)

圖2 不同連作年限牛膝根際土壤中各類(lèi)PLFAs和大量元素冗余分析Fig.2 Redundancy analysis (RDA) between group-specific phospholipid fatty acid (PLFAs) and soil nutrients variables in rhizospheric soils of Achyranthes bidentata monocultured for different years

從RDA(圖2)結(jié)果發(fā)現(xiàn)各類(lèi)PLFAs以及營(yíng)養(yǎng)元素均分布在3個(gè)象限內(nèi)。進(jìn)一步分析表明G+/G-和G+和絕大多數(shù)環(huán)境變量和各類(lèi)微生物菌群呈負(fù)相關(guān)，而與全氮呈正相關(guān)關(guān)系。細(xì)菌以及革蘭氏陰性菌的含量和絕大多數(shù)的元素(包括全磷、速效氮、速效磷、全鉀、速效鉀)含量密切相關(guān)。而真菌以及真菌/細(xì)菌的比值與元素含量關(guān)系不大。

3 討論

前人研究表明，在單一化種植模式下，農(nóng)作物減產(chǎn)的原因可大致總結(jié)為以下3點(diǎn)：(1)土壤養(yǎng)分匱乏或失調(diào)[28-29]；(2)根系分泌物中化感物質(zhì)的自毒效應(yīng)[30]；(3)連作土壤微生態(tài)結(jié)構(gòu)失衡[31-32]。對(duì)于這3個(gè)原因，不同的學(xué)者有不同研究結(jié)論與看法。孫冰玉[33]研究認(rèn)為，連作下，東北烤煙根際土壤肥力發(fā)生了很大變化，土壤有機(jī)質(zhì)含量、供鉀和供磷水平明顯不足，且必需元素等都顯著降低。但是，韓春麗等[34]發(fā)現(xiàn)連作大豆土壤中微量元素鋅、錳、鐵、銅含量的變化在不同年限中并無(wú)明顯下降變化規(guī)律。近年來(lái)，不少學(xué)者研究認(rèn)為同一種植物長(zhǎng)時(shí)間在同一田塊上種植，會(huì)造成了土壤中有益微生物數(shù)量的減少及有害病原菌數(shù)量的增長(zhǎng)，在此消彼長(zhǎng)的過(guò)程中影響植物體的正常功能、生長(zhǎng)發(fā)育等生命活動(dòng)。華菊玲等[35]發(fā)現(xiàn)，連作下芝麻根際土壤有益菌(芽孢桿菌Bacillus)的菌群數(shù)量明顯低于新種植地，而尖孢鐮孢菌(Fusariumoxysporum)、青枯勞爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)的含量顯著高于新種植地，正是這樣的微生物區(qū)系失衡導(dǎo)致了芝麻的連作障礙產(chǎn)生，因而導(dǎo)致減產(chǎn)降質(zhì)，其結(jié)果充分說(shuō)明了土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與功能多樣性的重要性。

本研究結(jié)果提供了一個(gè)作物連作促進(jìn)的特例。研究發(fā)現(xiàn)懷牛膝連作會(huì)使得土壤中有效態(tài)的大量元素含量增加，微量元素則相反。然而，對(duì)全量大量元素影響卻不明顯。郝慧榮等[36]和Chen等[6]研究結(jié)果也認(rèn)為，與牛膝連作2a土壤相比，連作20a的土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷、全鉀、速效氮(銨態(tài)氮)和速效磷均有所增加，尤其以全磷、速效氮(銨態(tài)氮)和速效磷增加較為顯著，說(shuō)明懷牛膝連作一定程度上改善了根際土壤環(huán)境，提高了土壤的保肥能力和補(bǔ)給能力，不僅有利于植株的生長(zhǎng)，還為根際微生物活動(dòng)提供營(yíng)養(yǎng)和能源。據(jù)此，本研究從土壤微生物角度入手，利用磷脂脂肪酸生物標(biāo)記法，研究連作下懷牛膝根際土壤微生物的變化情況。結(jié)果表明，在連作條件下，懷牛膝根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)明顯發(fā)生了改變，即連作年限越長(zhǎng)，微生物群落結(jié)構(gòu)差異越大，且土壤中細(xì)菌特別是革蘭氏陰性細(xì)菌的數(shù)量呈上升趨勢(shì)，革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的數(shù)量變化不大，所以G+/G-比值明顯下降。前人研究認(rèn)為該比值下降，說(shuō)明土壤中可利用養(yǎng)分逐漸增多，佐證了我們對(duì)牛膝土壤有效養(yǎng)分隨連作年限延長(zhǎng)而增多的結(jié)論[37]。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，隨連作年限的延長(zhǎng)，土壤中一些嗜熱解氫桿菌、放線(xiàn)菌和真菌等一些參與土壤物質(zhì)循環(huán)和木質(zhì)素降解菌[25- 27]的微生物類(lèi)群的數(shù)量也明顯提高，這是促進(jìn)牛膝連作土壤養(yǎng)分有效化不斷增強(qiáng)的生物學(xué)基礎(chǔ)。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，隨連作年限的延長(zhǎng)，土壤中一些有益微生物類(lèi)群如假單胞菌Psudomonas(PLFA16:0)[15]芽孢桿菌Bacillus(PLFAa15:0)[23-24]也顯著增多(表6)。作者所在的課題組郝慧榮等[36]和Chen等[6]在對(duì)牛膝根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，連作20a牛膝土壤微生物對(duì)氨基酸類(lèi)的代謝活性較高，對(duì)多聚物、酚酸類(lèi)、羧酸類(lèi)的代謝活性較低，放線(xiàn)菌和原生動(dòng)物的PLFA相對(duì)含量比連作2年分別高出1.4%和2.3%；T-RFLP分析發(fā)現(xiàn)，一些促生根際菌(PGPR，以芽孢桿菌屬Bacillus和類(lèi)芽孢桿菌屬Paenibacillus為主)，包括假單胞菌屬Pseudomonas、枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis、浸麻類(lèi)芽孢桿菌(Paenibacillusmacerans)、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)、球形芽孢桿菌(Bacillussphaericus)等和一些改善土壤質(zhì)地、防治植物病害的功能菌(如鏈霉菌屬Streptomycetes等)隨著連作年限的增加而不斷增加，而以支原體屬(Mycoplasma)為主的病原菌則不斷減少，這是牛膝連作促進(jìn)的重要根際生物學(xué)特性。

綜上所述，植物根際微生物結(jié)構(gòu)與功能多樣性對(duì)植物的健康生長(zhǎng)有著極其重要的作用。近年來(lái)，有學(xué)者[38]將植物根際微生物組稱(chēng)為植物的第二基因組學(xué)，已引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的普遍關(guān)注。眾所周知，植物根系分泌物是介導(dǎo)根際微生物變化的誘導(dǎo)因子。不同的植物以及植物在其生長(zhǎng)發(fā)育的不同階段，其根系會(huì)分泌各種次生代謝產(chǎn)物，而這些植物根系分泌物能產(chǎn)生間接的生態(tài)效應(yīng)，并有效抑制某些類(lèi)群微生物的生長(zhǎng)，同時(shí)也會(huì)有效促進(jìn)另一些類(lèi)群微生物的生長(zhǎng)，從而影響根際微生物的區(qū)系結(jié)構(gòu)和功能多樣性，最終導(dǎo)致土壤微生物群落的選擇性效應(yīng)[39- 41]。其中最為典型的就是豆科植物與根瘤菌的共生關(guān)系。豆科植物根系會(huì)分泌一種類(lèi)黃酮物質(zhì)，從而誘導(dǎo)根瘤菌在其根系表面定殖，從而形成共生關(guān)系，這就說(shuō)明根系分泌物與根際微生物之間存在著密切關(guān)系。覃逸明等[42]采用高效液相色譜法(HPLC)對(duì)藥用植物丹鳳(PaeoniaostiiT.)自毒物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)根系分泌物的濃度(包括阿魏酸、肉桂酸、香草醛、香豆素和丹皮酚)隨著連作年限的增加而上升，進(jìn)而影響丹鳳地下部根長(zhǎng)、根系活力以及地上部植株的生物量。Zolla等[43]在研究干旱脅迫對(duì)擬南芥植株生長(zhǎng)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，種植在同域土壤中的植物生物量要高于非同域土壤的，這是由于同域土壤中存在許多根際促生菌的原因。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著連作年限增加，總PLFAs生物量和細(xì)菌總量特別是革蘭氏陰性細(xì)菌和一些有益菌含量都在增加。這可能就是因?yàn)楦捣置谖锝閷?dǎo)下，植物根際促生菌(PGPR)在土壤中產(chǎn)生富集作用的結(jié)果。然而，究竟是何種牛膝根系分泌物，且如何介導(dǎo)連作牛膝根際土壤微生物差異變化及其作用的內(nèi)在機(jī)制尚需深入研究。

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WANG Juanying1,2,3, XU Jiahui2,3, WU Linkun1,2,3, WU Hongmiao1,2,3, ZHU Quan1,2,3, KONG Lufei1,2,3, LIN Wenxiong1,2,3 *

1Collegeoflifescience,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou350002,China2KeyLaboratoryofBiopesticideandChemicalBiology,MinistryofEducation,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou350002,China3FujianProvincialKeyLaboratoryofAgroecologicalProcessingandSafetyMonitoring,Fuzhou350002,China

國(guó)家自然科學(xué)基金(81303170，81573530，31401950，U1205021)；閩臺(tái)作物特色種質(zhì)創(chuàng)制與綠色栽培協(xié)同創(chuàng)新中心(2015- 75)

2016- 06- 07; < class="emphasis_bold">網(wǎng)絡(luò)出版日期

日期:2016- 12- 27

10.5846/stxb201606071097

*通訊作者Corresponding author.E-mail: wenxiong181@163.com

王娟英，許佳慧， 吳林坤， 吳紅淼， 朱銓, 孔露霏, 林文雄.不同連作年限懷牛膝根際土壤理化性質(zhì)及微生物多樣性.生態(tài)學(xué)報(bào),2017,37(17):5621- 5629.

Wang J Y, Xu J H, Wu L K, Wu H M, Zhu Q, Kong L F, Lin W X.Analysis of physicochemical properties and microbial diversity in rhizosphere soil ofAchyranthesbidentataunder different cropping years.Acta Ecologica Sinica,2017,37(17):5621- 5629.