殼聚糖沒食子酸衍生物酶法制備及對鮮切蘋果的保鮮效果

吳 昊，甄天元，陳存坤，王藝穎，羅 丹，張 瀟，王成榮

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殼聚糖沒食子酸衍生物酶法制備及對鮮切蘋果的保鮮效果

吳 昊1，甄天元1，陳存坤2，王藝穎1，羅 丹1，張 瀟1，王成榮1※

（1. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，青島 266109； 2. 國家農(nóng)產(chǎn)品保鮮工程技術(shù)研究中心，天津 300384）

為提高殼聚糖水溶性和保鮮性能，該文以沒食子酸為配體，漆酶為催化劑催化殼聚糖與沒食子酸發(fā)生接枝反應(yīng)，得到殼聚糖沒食子酸衍生物，對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步表征，并初步探討了其對鮮切蘋果的保鮮效果。結(jié)果表明，衍生物接枝率為72.80%，溶解度達(dá)到92.77%，沒食子酸中的羧基與殼聚糖分子的氨基發(fā)生了邁克爾加成反應(yīng)，在殼聚糖的C2位生成了酰胺鍵。14 ℃下貯藏4 d后，10 mg/mL衍生物處理的蘋果硬度損失率僅為10.23%，比空白組、殼聚糖處理組和殼聚糖沒食子酸物理復(fù)合物處理組分別低20.90% (<0.05)、16.60% (<0.05)和15.60% (<0.05)；可溶性固形物、維生素C、谷胱甘肽和多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為12.93%， 1.23 mg/(100 g)， 6.26 mg/(100 g)和6.24 mg/(100 g)，分別比空白組高16.47% (<0.05)，48.78% (<0.05)，24.92% (<0.05)和43.75% (<0.05)；多酚氧化酶和過氧化物酶活性分別比空白組低36.73% (<0.05)和76.94% (<0.05)；菌落總數(shù)為16.00 ×104CFU/g，顯著低于空白組、殼聚糖處理組和殼聚糖沒食子酸物理復(fù)合物處理組 (<0.05)。結(jié)果表明，漆酶可催化殼聚糖與沒食子酸發(fā)生接枝反應(yīng)，得到的殼聚糖沒食子酸衍生物對鮮切蘋果具有較好的保鮮效果。

貯藏；品質(zhì)控制；水果；殼聚糖；沒食子酸；漆酶；保鮮

0 引 言

殼聚糖（chitosan，CTS）是甲殼素（chitin）脫乙?；蟮玫降囊环N無毒的、生物可降解的多糖，具有成膜性和廣譜抗菌性，被廣泛應(yīng)用于食品保鮮領(lǐng)域[1]。但是殼聚糖分子間的強(qiáng)氫鍵作用致使高分子質(zhì)量的殼聚糖不溶于水，并且殼聚糖的抗氧化能力主要是來源于氨基上N的螯合能力以及氨基和羥基較弱的給電子能力，屬于次級型抗氧化劑[2]，在一定程度上限制了它在食品保鮮中的應(yīng)用。因此，對殼聚糖進(jìn)行改性，在提高其溶解度的同時并賦予其新的特性，已成為研究開發(fā)殼聚糖衍生物的方向之一[3]。

沒食子酸（gallic acid，GA）是一種從植物特別是綠茶中提取的天然酚類抗氧化劑，具有較強(qiáng)的清除自由基和抗氧化作用。沒食子酸作為初始型抗氧化劑，可以很好地提供氫原子或電子以抑制氧化鏈的反應(yīng)[4]，但是沒食子酸作為小分子抗氧化劑的穩(wěn)定性較差，在高溫、光照等條件下易分解。已有研究者采用化學(xué)方法將其結(jié)合到殼聚糖分子上來增強(qiáng)殼聚糖的抗氧化性[4-7]并提高沒食子酸的穩(wěn)定性[5]，本課題組前期也對殼聚糖沒食子酸衍生物的化學(xué)合成進(jìn)行了研究，并將其應(yīng)用于鮮切果蔬的保鮮試驗(yàn)中，取得了理想的結(jié)果[6]。但化學(xué)方法存在著反應(yīng)步驟多、專一性差等特點(diǎn)，隨著人們環(huán)保意識的增強(qiáng)，作為綠色化學(xué)研究的一個重要部分，生物催化劑-酶用于高分子的合成及改性正成為一個新的研究熱點(diǎn)。酶法制備的殼聚糖沒食子酸衍生物無任何化學(xué)殘留和毒副作用，符合人們對食品保鮮綠色、環(huán)保的要求。

漆酶（EC1.10.3.2）是一種含銅的多酚氧化酶，在果汁加工、生物漂白、物質(zhì)合成和廢水處理等方面有廣泛應(yīng)用，它利用銅離子特有的氧化還原能力氧化酚類和芳香類化合物，利用自由基反應(yīng)機(jī)理完成4個電子的轉(zhuǎn)移，同時將分子氧還原成水[8]，酚類化合物是典型的漆酶底物，它們的氧化還原電勢較低，可以允許電子傳遞給CuI，反應(yīng)過程中，酚被氧化成苯氧自由基，根據(jù)反應(yīng)條件的不同，可以進(jìn)一步通過自由基耦合反應(yīng)產(chǎn)生聚合或重排產(chǎn)生苯醌，漆酶可以使酚型結(jié)構(gòu)單元失去一個電子形成酚氧游離基，進(jìn)而形成醌型結(jié)構(gòu)[9]，醌可以與殼聚糖上的氨基基團(tuán)產(chǎn)生化學(xué)鍵連接，目前普遍認(rèn)為醌與氨基通過席夫堿或邁克爾加成反應(yīng)機(jī)理發(fā)生共價作用。

鮮切蘋果又稱輕度加工蘋果，是一種具有廣闊開發(fā)前景的新興加工產(chǎn)品。與新鮮蘋果相比，鮮切蘋果由于加工過程中的切分，在貯藏保鮮過程中，更易遭受微生物侵染、發(fā)生褐變，導(dǎo)致外觀品質(zhì)下降[10]，營養(yǎng)價值也有不同程度的降低，保鮮難度增加，貨架期縮短，大大降低商品價值，因而探索如何防止鮮切蘋果品質(zhì)劣變至關(guān)重要。果蔬貯藏品質(zhì)與其抗氧化能力和抗菌活性密切相關(guān)，多數(shù)果蔬中含有多糖、萜類、黃酮類、多酚類等具有抗氧化作用的活性物質(zhì)，能誘導(dǎo)果蔬抗氧化酶系統(tǒng)中與活性氧清除相關(guān)酶活性的上升，從而延長果蔬貯藏期。

本文以殼聚糖為原料，采用漆酶催化殼聚糖與沒食子酸反應(yīng)，確定產(chǎn)物的接枝率和溶解性能，利用傅利葉紅外光譜、核磁共振等譜學(xué)表征方法對產(chǎn)物結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。并將其用于處理鮮切蘋果，研究鮮切蘋果在貯藏期間各項(xiàng)指標(biāo)變化的情況，從而探索其在食品防腐保鮮中應(yīng)用價值的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅富士蘋果，購于青島城陽區(qū)大潤發(fā)春陽路店，果實(shí)成熟度為八成熟，人工選擇成熟度一致，大小適中、無病蟲害、無機(jī)械損傷的果實(shí)。

殼聚糖（脫乙酰度為90.8%），青島云宙生物科技有限公司；沒食子酸，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；漆酶，由米曲霉制得，酶活力1 000 U/g，北京索萊寶科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AR 2140型電子分析天平，奧豪斯國際商貿(mào)有限公司；81-2型恒溫磁力攪拌器，國華電器有限公司；pH計(jì)，瑞士METTLER TOLEDO公司；真空循環(huán)水式真空泵，鄭州科工貿(mào)有限公司；真空冷凍干燥機(jī)，Christ Alpha 1-2 LD plus，德國Marin Christ公司；透析袋，北京索萊寶科技有限公司，截留分子量8 000～14 000 Da；傅利葉紅外光譜儀，美國Thermo公司；CT3-4500質(zhì)構(gòu)分析儀，美國BROOKFIELD公司；阿貝斯折光儀，上海精密科學(xué)儀器有限公司；Anke TGL-16C高速臺式離心機(jī)，上海安亭科技儀器廠；HH-501電熱恒溫水浴鍋，龍口市先科儀器有限公司；TU-1810紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；傅利葉紅外光譜儀，美國Thermo公司；X-射線多晶衍射儀，德國布魯克Axs有限公司；500 MHz超導(dǎo)核磁共振波譜儀，瑞士布魯克公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 殼聚糖沒食子酸衍生物的制備

根據(jù)前期試驗(yàn)條件，將1.0 g殼聚糖粉末溶于100 mL pH值為4.5的0.1 mol/L的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液中，磁力攪拌器中攪拌至完全溶解后再加入2.8 g沒食子酸，溶解完全后加入漆酶（4 U），于25 ℃氣浴搖床中反應(yīng)5 h，反應(yīng)完成后加300 mL無水乙醇醇沉24 h，布氏漏斗抽濾，將產(chǎn)物溶于超純水中，透析24 h，每隔8 h換一次水，?40 ℃下真空冷凍干燥后得到殼聚糖沒食子酸衍生物（chitosan-gallic acid，CTS-GA）。

1.3.2 接枝率的測定

用線性電位滴定法測定。

根據(jù)反應(yīng)前后自由氨基含量的變化即可測得接枝率，即

式中為空白CTS的脫乙酰度（自由氨基含量）；0為CTS對照樣（緩沖溶液處理樣）的脫乙酰度；1為CTS-GA的脫乙酰度（游離氨基含量）。

1.3.3 溶解度測定

取20 mg干燥至恒定質(zhì)量的CTS-GA于錐形瓶中，37 ℃的氣浴搖床中震蕩溶解24 h，肉眼觀察溶解情況，將不溶解的樣品過濾干燥后稱質(zhì)量，比較前后質(zhì)量差，計(jì)算溶解度。

式中0為衍生物原干燥質(zhì)量，g；W為溶解時間時衍生物干燥質(zhì)量，g。

1.3.4 紅外光譜分析

將CTS、GA和CTS-GA完全干燥，稱取樣品1 mg，與100 mg干燥的KBr在瑪瑙研缽中研磨，研細(xì)混勻。將研好的粉末均勻放入壓膜器中，抽真空加壓制得透明薄片，用紅外光譜儀測定其紅外光譜，不加樣品的KBr薄片進(jìn)行空白實(shí)驗(yàn)調(diào)整基線，掃描范圍為500～4 000 cm-1，掃描次數(shù)32次，研究衍生物中沒食子酸與殼聚糖的結(jié)合情況。

1.3.5 核磁共振波譜分析

取適量的CTS、GA和CTS-GA溶于D2O中，500 MHz頻率照射，20 ℃下超導(dǎo)核磁共振波譜儀記錄圖譜。

1.3.6 材料處理

將蘋果清洗去皮，用不銹鋼刀切分成5 mm厚薄片，不銹鋼刀用濃度為200mol/L的次氯酸鈉溶液浸泡2 min后用蒸餾水清洗，晾干。各保鮮劑配置方法見表1（由于沒食子酸溶液較易氧化褐變影響鮮切蘋果顏色，感官上失去商品價值，所以本文中未將沒食子酸處理作為對照組），選擇大小及規(guī)格一致的鮮切蘋果片，隨機(jī)分成4組，分別浸泡于表1各保鮮劑配方中2 min后取出瀝干，對照組在去離子水中同樣浸泡處理，分裝于市購的PE保鮮袋中，置于(14±1.0) ℃恒溫庫（與超市鮮切果蔬銷售展示柜溫度相同）中貯藏，每天測定各項(xiàng)指標(biāo)。

1.3.7 指標(biāo)測定

硬度的測定：采用CT3-4500質(zhì)構(gòu)分析儀測定，參考文獻(xiàn)[11]的方法，選取測試參數(shù)：預(yù)壓速度2.0 mm/s、下壓速度0.5 mm/s和壓后上行速度0.5 mm/s，觸發(fā)點(diǎn)負(fù)載為6.8 g，探頭測試距離4.0 mm。

維生素C含量的測定：采用2,6-二氯酚靛酚滴定法[12]。

表1 鮮切蘋果處理方法

多酚含量的測定：采用福林酚比色法[13]。

還原型谷胱甘肽含量（glutathione，GSH）的測定：采用DTNB法。

多酚氧化酶（polyphenoloxidase，PPO）、過氧化物酶（peroxidase，POD）的測定：參照曹建康[14]的方法。以每克樣品每分鐘吸光度變化0.001為1個多酚氧化酶酶活力單位；以每克樣品每分鐘吸光度變化0.01為1個過氧化物酶酶活力單位。

過氧化氫酶（catalase，CAT）的測定：參照高俊鳳[15]的方法。以每克樣品每分鐘吸光度變化0.001為1個過氧化氫酶酶活力單位。

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的測定：采用鄰苯三酚自氧化法[16]。在每毫升反應(yīng)液中，每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率達(dá)50%的酶量為1個超氧化物歧化酶酶活力單位。

菌落總數(shù)的測定，參考GB 4789.2-2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)-食品微生物學(xué)檢驗(yàn)-菌落總數(shù)測定[17]，采用平板計(jì)數(shù)法，活菌數(shù)用CFU/g表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)重復(fù)3次，采用Origin 8.5繪圖，SPSS 19.0進(jìn)行方差分析和顯著性分析，<0.05表示差異有顯著變化，<0.01表示差異有極顯著變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 CTS-GA的接枝率和溶解性

接枝率是指殼聚糖進(jìn)行接枝反應(yīng)生成殼聚糖衍生物時，氨基被接枝的比例，采用線性電位滴定法對產(chǎn)物進(jìn)行滴定。結(jié)果表明，殼聚糖沒食子酸衍生物的接枝率為72.80%±0.96%，溶解度為92.77%±2.50%。

2.2 CTS-GA的結(jié)構(gòu)表征

2.2.1 紅外光譜分析

圖1所示，CTS和CTS-GA都在3 419cm-1處出現(xiàn)了一個寬峰，是-OH基的伸縮振動峰[18]，對比原料CTS，CTS-GA的峰強(qiáng)度有所增加，這表明CTS-GA中羥基的量有所增加，CTS-GA在1 384、1 353 cm-1處出現(xiàn)O-H的面內(nèi)變形振動[18]以及1 149 cm-1處出現(xiàn)的C-O伸縮振動[18]能進(jìn)一步證明-OH的存在，同時CTS-GA在737 cm-1處形成了一個與GA相類似的峰，該峰為O-H的面外彎曲振動所致[19]，這與-OH的引入密切相關(guān)，而CTS-GA在1 702 cm-1處并未出現(xiàn)-COOH的特征峰[20]，這說明在CTS引入的基團(tuán)中并不含有GA中的-COOH，GA分子中的-COOH可能全部參與了接枝反應(yīng)，而CTS能與GA的-COOH發(fā)生反應(yīng)的基團(tuán)包含-OH和-NH2，與原料CTS相比，CTS-GA在1 260 cm-1處并未出現(xiàn)C-NH2吸收峰[20]，即CTS-GA分子中不存在-NH2，說明CTS與GA發(fā)生反應(yīng)時，CTS分子中的C-N鍵全部斷裂與GA中的-COOH反應(yīng)，發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)，以酰胺鍵結(jié)合，CTS-GA在1 600 cm-1處出現(xiàn)的酰胺鍵特[20]征峰印證了該假設(shè)。CTS-GA在1 600 cm-1處的吸收峰減弱，表明殼聚糖主鏈引入了苯基，并且殼聚糖原料中的-NH2減少；878 cm-1處出現(xiàn)的糖環(huán)伸縮振動吸收峰[20]說明CTS與GA的反應(yīng)并沒有改變殼聚糖的骨架。以上分析表明，CTS與GA反應(yīng)以酰胺鍵結(jié)合，且反應(yīng)并未改變殼聚糖的骨架結(jié)構(gòu)。

2.2.2 核磁共振波譜分析

用1H-NMR分析技術(shù)進(jìn)一步確定CTS-GA與原料CTS分子的結(jié)構(gòu)是否存在差異。CTS、GA及CTS-GA結(jié)構(gòu)單元上的主要質(zhì)子信號如圖2所示，CTS氫譜表明，=1.99處的吸收峰是D2O的存在引起的，=2.99處的峰歸因于H-2的存在，=3.53～3.72區(qū)間的吸收峰屬于H-3，H-4，H-5，H-6，=4.75處吸收峰則屬于H-1的作用[21]。經(jīng)對比分析，=3.11～3.84 之間的信號峰是由于CTS-GA分子中H-2～H-6振動引起的，CTS-GA在低場=7.08處出現(xiàn)了苯環(huán)質(zhì)子的信號峰[22]，=4.88處出現(xiàn)了酚羥基的質(zhì)子峰[22]，這兩個峰的出現(xiàn)說明CTS-GA分子存在GA的苯環(huán)結(jié)構(gòu)，能夠證實(shí)GA與CTS發(fā)生了接枝反應(yīng)，低場=1.10～1.19為醇羥基歸屬峰[23]，且該峰的積分面積與CTS相等，說明CTS分子C3和C6位醇羥基未參與接枝反應(yīng)，以上譜圖結(jié)果表明，GA成功接枝到CTS分子鏈上，在C2位發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)形成酰胺鍵。

2.3 CTS-GA對鮮切蘋果的保鮮作用

2.3.1 CTS-GA對鮮切蘋果理化品質(zhì)的影響

在果實(shí)貯藏期間，由于纖維素和果膠的分解加之水分的蒸發(fā)，導(dǎo)致果實(shí)硬度下降，果實(shí)硬度反映了果實(shí)的成熟與衰老。由圖3a可以看出，若鮮切蘋果的硬度小于6N就被判定失去商品價值[24]，則CK組蘋果在第4天就失去了商品價值，而CTS-GA處理的蘋果貯藏至第6天才失去商品價值。隨著貯藏時間的延長，各試驗(yàn)組的果肉硬度逐漸降低。CK組硬度由初始的7.32N下降至第4天的5.79N，下降了20.9%，CTS和CTS.GA處理貯藏至第4天時硬度分別下降16.6%、15.6%，而10mg/mL CTS-GA處理的蘋果硬度損失率僅為10.23%，比CK、CTS和CTS.GA分別低20.90% (<0.05)、16.60% (<0.05)和15.60% (<0.05)，并且用CTS-GA處理的鮮切蘋果貯藏至第6天時，硬度僅下降18.0%，下降程度低于貯藏至第4天的CK處理（<0.05），說明CTS-GA能有效地減緩果實(shí)的軟化速度，推測是因?yàn)镃TS-GA能減少水分蒸發(fā)，抑制腐敗菌繁殖[25]，使得維持果實(shí)硬度的纖維素和果膠分解速度降低，從而保持果實(shí)硬度。

蘋果受到切割損傷后，由于缺乏相應(yīng)的保護(hù)機(jī)制，呼吸作用瞬間加強(qiáng)，達(dá)到呼吸高峰，消耗大量可溶性固形物，因此各組處理的可溶性固形物含量均出現(xiàn)一定程度的降低，由圖3b可以看出，可溶性固形物含量除CK組在貯藏期間呈逐漸下降趨勢外，其他3組均出現(xiàn)一定程度的波動。貯藏第4天，CTS-GA處理可溶性固形物含量為12.93%，明顯高于CK處理16.47%（<0.01），CTS與CTS.GA物理復(fù)合物處理差異并不顯著（>0.05）。貯藏后期CTS和CTS.GA物理復(fù)合物處理可溶性固形物含量出現(xiàn)明顯上升可能是由于組織嚴(yán)重失水，干縮造成的。在整個貯藏期間，CTS-GA處理的可溶性固形物含量始終高于其他3組且下降速度最緩慢（<0.05），可能是由于CTS-GA在一定程度上抑制了鮮切蘋果的生理代謝，使其呼吸消耗作用減弱[26]。因此，CTS-GA可有效降低鮮切蘋果的可溶性固形物的消耗，保持其貯藏特性。

維生素C不但是果實(shí)的重要營養(yǎng)成分之一，同時也是清除果實(shí)內(nèi)活性氧的重要抗氧化劑。由圖3c可知，各處理蘋果的維生素C因被氧化分解造成其含量逐漸減少，各處理維生素C含量均高于CK處理，但CTS-GA處理的維生素C含量始終處于最高水平（<0.05），14 ℃下貯藏4天后，10mg/mL衍生物處理的蘋果維生素C含量為1.23 mg/(100 g)，高于CK處理48.78% (<0.05)，較好的抑制了維生素C含量的下降，對維持鮮切蘋果的營養(yǎng)物質(zhì)起到了有效的作用，這可能歸因于CTS-GA分子中含較多的酚羥基，酚羥基對維生素C具有保護(hù)作用[27]，可以減緩果實(shí)維生素C的氧化進(jìn)程。

還原型谷胱甘肽（GSH）作為抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)中的重要中間物質(zhì)，可通過提高超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和抗壞血酸過氧化物酶（APX）等酶活性、增加抗壞血酸的含量，與抗壞血酸協(xié)同作用發(fā)揮抗氧化作用；也可通過清除自由基生成氧化型谷胱甘肽，從而阻止膜脂過氧化[28]。由圖3d可以看出，各處理組鮮切蘋果GSH含量在貯藏期間都呈現(xiàn)整體下降趨勢，可能的原因是，GSH的前體物質(zhì)-抗壞血酸在貯藏過程中不斷消耗，從而使GSH含量在貯藏期間降低。與抗壞血酸相比，國內(nèi)外對于鮮切果蔬中GSH的研究和報道較少。CK處理的GSH始終低于其他3組處理，貯藏至第4天時，CK處理的GSH質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.7mg/(100 g)，而CTS-GA處理的GSH質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到了6.26 mg/(100 g)，高于CK處理24.92%，存在顯著差異（<0.05），CTS.GA物理復(fù)合物處理與CTS處理效果無顯著差異（>0.05），但與CK處理差異顯著（<0.05），說明3組處理均能維持GSH含量，抵御活性氧的侵害，CTS-GA處理效果最佳。

由圖3e所知，在整個貯藏過程中，酚類物質(zhì)呈緩慢下降的趨勢。在貯藏至第1天，處理組就與CK組呈現(xiàn)顯著差異（<0.05），其中CTS-GA處理的鮮切蘋果的多酚類物質(zhì)下降最為緩慢，在貯藏至第4天時，多酚含量為6.24 mg/(100 g)，高于CK處理43.75% (<0.05)，表明CTS-GA能抑制多酚物質(zhì)的氧化。

果實(shí)處理后品質(zhì)下降很大程度上是由于受到了微生物的侵染而引起腐爛變質(zhì)，由圖3f可以看出，在整個貯藏期，CTS-GA處理的鮮切蘋果微生物數(shù)量上升幅度較為平緩，貯藏至第3天時，CK和CTS處理的鮮切蘋果菌落總數(shù)增長速度明顯快于CTS-GA處理，CK與CTS處理在第4天時菌落總數(shù)已分別達(dá)到了33×104CFU/g和28×104CFU/g，而CTS-GA處理在第4天菌落總數(shù)為16.00×104CFU/g，第6天菌落總數(shù)仍低于28×104CFU/g，說明CTS-GA處理能很好的抑制鮮切果蔬表面微生物的滋生。

2.3.2 CTS-GA對鮮切蘋果衰老相關(guān)酶活性的影響

果實(shí)褐變是多酚氧化酶和過氧化物酶氧化多酚類底物所引起的一種病理反應(yīng)。在采后的貯藏過程中，多酚氧化酶（PPO）活性與果實(shí)的褐變密切相關(guān)，PPO能催化多酚氧化生成黑色素，影響外觀品質(zhì)。由圖4a可知，在貯藏過程中，CTS-GA組的PPO活性始終低于其他3組，貯藏至第4天時，CTS-GA組多酚氧化酶活性比CK低36.73% (<0.05)，由于PPO能夠催化酚類底物發(fā)生酶促褐變，因此CTS-GA處理能有效減輕鮮切蘋果在貯藏期間的酶促褐變程度，這可能是由于CTS-GA分子中含有的酚類還原物質(zhì)起到了主要的抗氧化作用，在鮮切蘋果表明形成一層抗氧化的保護(hù)膜[29]，建立保護(hù)屏障，避免了空氣中O2的氧化作用。

有研究表明，許多果蔬組織中的過氧化物酶（POD）活性都伴隨著機(jī)械傷害而上升，并且還產(chǎn)生新的POD同工酶[30]。如圖4b所示，在整個貯藏期，CK組的POD活性一直高于其他3組處理（<0.05），貯藏4 d時，CK組POD活性達(dá)到了11.01 U/(g·min)，而CTS-GA組POD活性比CK組低76.94% (<0.05)，這說明CTS-GA能有效抑制POD酶活性，降低切分對蘋果造成的損傷。

超氧化物歧化酶（SOD）是果實(shí)后熟衰老過程中保護(hù)性酶類，能夠清除植物體內(nèi)過量的活性氧，從而在一定程度上延緩果實(shí)的衰老過程。過氧化氫酶（CAT）能催化植物體內(nèi)積累的過氧化氫分解為水和氧，從而減少過氧化氫對果蔬組織可能造成的傷害。由圖4c和4d可知，SOD活性和CAT活性的總體趨勢為先升高后降低。在貯藏前期，CK組CAT活性高于其他3組處理（<0.05），SOD活性在貯藏前期出現(xiàn)躍變式上升，CTS處理和CTS.GA物理復(fù)合物處理SOD值在第一天達(dá)到最大值，分別為23.7 U/(mL·min)、16.8 U/(mL·min)，CK最大值推遲一天出現(xiàn)，貯藏后期，SOD活性和CAT活性下降，CK組活性氧清除能力減弱，而CTS-GA處理SOD活性和CAT活性升高，說明CTS-GA可有效提高SOD和CAT保護(hù)酶活性，增強(qiáng)活性氧的清除能力，從而減少對膜的損傷，提高抗衰老能力，從而延長果實(shí)貨架期。

2.4 成本分析與應(yīng)用成本

目前關(guān)于殼聚糖衍生物作為食品保鮮劑的研究大部分僅限于實(shí)驗(yàn)室，在將其應(yīng)用于商業(yè)化生產(chǎn)方面缺乏相關(guān)報道。本項(xiàng)目產(chǎn)品的主要原料為殼聚糖、沒食子酸、漆酶和無水乙醇等，食品級殼聚糖和沒食子酸參考價格分別為200元/kg和100元/kg左右，其中漆酶添加量極少，成本可忽略，無水乙醇可以回收反復(fù)利用。根據(jù)前期試驗(yàn)結(jié)果，每千克殼聚糖和沒食子酸原料可以生產(chǎn)衍生物0.5 kg，配制保鮮液50 L。按1 L保鮮液可處理100～150 kg鮮切果蔬計(jì)，即鮮切果蔬需要衍生物原料的成本為0.04～0.06元/kg；另計(jì)衍生物生產(chǎn)所消耗的水、電、生產(chǎn)資料及人工費(fèi)用0.20元/kg左右，所以每千克鮮切果蔬所需保鮮劑成本為0.25元/kg左右。根據(jù)上述計(jì)算方法，使用殼聚糖進(jìn)行保鮮的成本為0.12元/kg左右，殼聚糖沒食子酸物理復(fù)合物的保鮮成本為0.15元/kg左右。雖然衍生物使用成本略高于其他處理，但是根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，衍生物處理可減少鮮切果蔬損失30%以上，可挽回經(jīng)濟(jì)損失數(shù)十元，經(jīng)濟(jì)效益可觀，具有實(shí)際應(yīng)用價值。

殼聚糖沒食子酸酶法合成衍生物操作工藝簡單，設(shè)備投資少，并且該衍生物作為生物保鮮劑可生物降解，對環(huán)境無污染，因此適用于鮮切果蔬的運(yùn)輸和銷售，具有巨大的工業(yè)化生產(chǎn)潛力和廣闊的應(yīng)用前景。在后續(xù)研究中可以對衍生物制備工藝進(jìn)一步優(yōu)化，使其更適用于工業(yè)化的批量生產(chǎn)。

3 結(jié) 論

1）以沒食子酸為小分子配體，漆酶為催化劑，對殼聚糖進(jìn)行改性，反應(yīng)條件溫和，得到的衍生物接枝率為72.80%±0.96%，溶解度為92.77%±2.50%。光譜學(xué)分析結(jié)果表明，沒食子酸分子中的羧基與殼聚糖分子氨基上發(fā)生了邁克爾加成反應(yīng)，在殼聚糖的C2位生成酰胺鍵。

2）殼聚糖沒食子酸衍生物(CTS-GA)對鮮切蘋果的保鮮試驗(yàn)結(jié)果表明，14 ℃下貯藏4d后，10 mg/mL衍生物處理的蘋果硬度損失率僅為10.23%，比對照（CK）、殼聚糖（CTS）和殼聚糖沒食子酸物理復(fù)合物（CTS.GA）分別低20.90% (<0.05)、16.60% (<0.05)和15.60% (<0.05)；可溶性固形物、維生素C、谷胱甘肽和多酚含量分別為12.93%，1.23 mg/(100 g)，6.26 mg/100g和6.24 mg/(100 g)，分別高于CK16.47% (<0.05)，48.78% (<0.05)，24.92% (<0.05)和43.75% (<0.05)；多酚氧化酶和過氧化物酶活性分別比CK低36.73% (<0.05)和76.94% (<0.05)；菌落總數(shù)為16.00 ×104CFU/g，顯著低于CK、CTS和CTS.GA處理組(<0.05)。說明CTS-GA可有效抑制過氧化物酶和多酚氧化酶活性，減少可溶性固形物、維生素C和多酚含量的損失，提高超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性，很好的保持其色澤，抑制微生物的生長。

3）殼聚糖沒食子酸酶法合成衍生物成本低廉，每千克鮮切果蔬所需衍生物成本僅為0.25元/kg左右，保鮮效果顯著，可減少鮮切果蔬損失30%以上，操作簡單。

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Enzymatic synthesis of chitosan-gallic acid derivative and its preservation effect on fresh-cut apple

Wu Hao1, Zhen Tianyuan1, Chen Cunkun2, Wang Yiying1, Luo Dan1, Zhang Xiao1, Wang Chengrong1※

(1.266109,; 2.300384,)

In order to broad the application scope and improve the preservation effect of chitosan (CTS) and gallic acid (GA), CTS derivative with GA was synthesized by laccase catalysis method. The grafting rate and solubility, structural characterization and preservation effect of derivative on fresh-cut apple were investigated. Results showed that the grafting rate and solubility were respective 72.80% and 92.77%. The preliminary characterization of derivative was studied through a series of testing methods including ultraviolet spectrum, FTIR (Fourier transform infrared spectroscopy), X-ray diffraction spectra and superconducting magnetic resonance spectrum. Ultraviolet spectrum analysis result showed that benzene ring and auxochrome -OH were introduced into CTS molecules. FTIR result showed that -NH2of CTS molecules decreased, which reacted with GA by amid linkage and did not change the main chain structure of CTS. X-ray diffraction analysis result indicated that with the addition of GA, CTS conformation was changed, a new kind of crystal was formed gradually, the area of amorphous area increased, the order of the structure reduced, the intermolecular and intramolecular hydrogen bonding in polymer were destroyed, and the crystallinity of CTS reduced.13C-NMR (nuclear magnetic resonance) analysis result demonstrated that CTS-GA exhibited the resonance absorption peak of C=O.1H-NMR analysis result proved that CTS-GA exhibited the benzene ring and alcoholic hydroxyl proton peaks. All above analysis results confirmed the successful grafting of GA onto CTS. The conjugation of GA onto CTS probably occurred between amine (C-2) and carboxyl groups of GA, forming amide linkage. Effects of chitosan (CTS), derivative of chitosan and gallic acid (CTS-GA), physical compound of chitosan and gallic acid (CTS.GA) and deionized water (CK) treatment on fresh-cut apples’ biochemical properties, such as hardness, soluble solid, polyphenol, vitamin C, glutathione (GSH) content, activities of polyphenol oxidase (PPO), peroxidase (POD), superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and total number of bacteria colony. Analytical determinations were made every day. After 4-day storage at 14 ℃, the loss of hardness of CTS-GA group was only 10.23%, which was significant lower than those of CK (20.90%), CTS (16.60%) and CTS.GA (15.60%). The soluble solid, vitamin C, GSH and polyphenol content of CTS-GA group were 12.93 %, 1.23 mg/100g, 6.26 mg/100g and 6.24 mg/100g, which were 16.47%, 48.78%, 24.92% and 43.75% respectively higher than those of CK, while the activity of PPO and POD of CTS-GA group were 36.73% and 76.94% lower than CK treatment. And the amount of microorganism in CTS-GA group was 16.00×104CFU/g, obviously lower than CK, CTS and CTS.GA groups. These results suggested appropriate CTS-GA treatment provided better maintenance of hardness, effectively reduced the loss of vitamin C, soluble solid content, polyphenol content and GSH, inhibited the PPO activities, and also maintained higher activity of SOD and CAT, and suppressed the microbial growth. Therefore CTS-GA treatment can delay the senescence rate and exert an excellent effect on fresh keeping of fresh-cut apple. The results clearly indicate that enzyme-mediated pattern of CTS and GA can provide a novel ‘green’ pathway of preparing and broaden the application fields of CTS and GA such as food preservation industry.

storage; quality control; fruits; chitosan; gallic acid; laccase; preservation

10.11975/j.issn.1002-6819.2017.04.039

TS255.3

A

1002-6819(2017)-04-0285-08

2016-08-01

2017-01-20

國家自然基金青年基金（31401549）；山東省現(xiàn)代蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（SDAIT-05-21）；山東省農(nóng)業(yè)重大應(yīng)用技術(shù)創(chuàng)新項(xiàng)目子課題（SDNYCX-2015-ZD06-02）；山東省高等學(xué)?？萍加?jì)劃項(xiàng)目（J14LE11）；青島市科技計(jì)劃項(xiàng)目（14-2-4-71-jch）；青島農(nóng)業(yè)大學(xué)高層次人才科研基金（1207）。

吳昊，女，黑龍江人，副教授，博士，研究方向?yàn)楣呒庸づc貯藏。青島 山東省青島市青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，266109。 Email：wuhaoqau@163.com

王成榮，男，山東人，教授，研究方向?yàn)楣呒庸づc貯藏。青島 山東省青島市青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，266109。 Email：qauwcr@126.com

吳 昊，甄天元，陳存坤，王藝穎，羅 丹，張 瀟，王成榮. 殼聚糖沒食子酸衍生物酶法制備及對鮮切蘋果的保鮮效果[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2017，33(4)：285－292. doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2017.04.039 http://www.tcsae.org

Wu Hao, Zhen Tianyuan, Chen Cunkun, Wang Yiying, Luo Dan, Zhang Xiao, Wang Chengrong. Enzymatic synthesis of chitosan-gallic acid derivative and its preservation effect on fresh-cut apple[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2017, 33(4): 285－292. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2017.04.039 http://www.tcsae.org