季節(jié)性溫度對短程硝化系統(tǒng)微生物群落的影響

趙昕燕,卞 偉,侯愛月,闞睿哲,趙 青,李 軍*

?

季節(jié)性溫度對短程硝化系統(tǒng)微生物群落的影響

趙昕燕1,卞 偉1,侯愛月2,闞睿哲1,趙 青1,李 軍1*

(1.北京工業(yè)大學(xué)建筑工程學(xué)院,北京 100124；2.北京國環(huán)清華環(huán)境工程設(shè)計研究院有限公司,北京 100084)

為了研究季節(jié)性溫度對短程硝化生物膜系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)的影響,以平均水溫分別為28.3,23.3,21.6,9.6,-0.2℃條件下MBBR反應(yīng)器的短程硝化生物膜為對象,利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳技術(shù)(PCR-DGGE)對比分析上述生物膜中的微生物群落結(jié)構(gòu),結(jié)果表明: 在控制合適的水力停留時間(HRT)條件下,水溫降低會影響微生物活性,但不影響短程硝化穩(wěn)定性,平均水溫在21.6~-0.2℃變化過程中總細(xì)菌和AOB的多樣性及均勻性基本不變,芽孢桿菌、黃桿菌、亞硝化單胞菌等污水處理功能微生物都得到保留.平均水溫28.3~-0.2℃條件下生物膜中的優(yōu)勢菌群主要分布于變形菌門(Proteobacteria) 和擬桿菌門(Bacteroidetes).其中AOB均屬于β-Proteobacteria的亞硝化單胞菌屬().本試驗(yàn)僅調(diào)控反應(yīng)器水力停留時間(HRT)就可以實(shí)現(xiàn)低溫短程硝化,對于短程硝化工藝廣泛應(yīng)用于工程實(shí)踐具有重要意義.

低溫；短程硝化；PCR-DGGE；微生物群落結(jié)構(gòu)；MBBR

以短程硝化為基礎(chǔ)的自養(yǎng)脫氮工藝較傳統(tǒng)工藝具有諸多優(yōu)點(diǎn),但其目前多用于處理污泥消化液、高氨氮工業(yè)廢水等,且大部分需要在30~40℃高溫下進(jìn)行[1-3].高溫(>30℃)可以維持短程硝化的穩(wěn)定運(yùn)行已得到了中外學(xué)者的一致認(rèn)可,而低溫條件下短程硝化能否穩(wěn)定維持尚存在爭議.將生活污水加熱到較高溫度需要消耗大量的能源,對于大型污水處理廠,具體實(shí)施的難度以及增加的能耗均不容輕視.因此,探求在常、低溫條件下實(shí)現(xiàn)并維持穩(wěn)定短程硝化的方法,建立相應(yīng)的控制策略,對于短程硝化工藝廣泛應(yīng)用于工程實(shí)踐具有重要意義.

然而低溫環(huán)境中應(yīng)用活性污泥法處理生活污水效果下降,是目前我國北方城市低溫生活污水處理所面臨的主要問題.生物膜法由于能在生物處理系統(tǒng)中保有較高的生物量而受到廣泛關(guān)注[4-5].近來各國對生物膜的研究興趣逐漸向微觀方面[6],由原來探索水力條件來獲取最佳的處理效果轉(zhuǎn)向生物膜的微觀結(jié)構(gòu)等方面[7].聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳技術(shù)(PCR-DGGE),可以同時快速地對多個環(huán)境樣品的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較分析,提供微生物群落調(diào)控方面的理論依據(jù),已成為水處理中微生物檢測的常用方法之一.

本試驗(yàn)采用移動床生物膜反應(yīng)器(MBBR),投加鮑爾環(huán)為懸浮填料,在室外水溫為32.6~ -3.3℃條件下通過及時控制反應(yīng)器水力停留時間(HRT)維持短程硝化的穩(wěn)定運(yùn)行.為了研究季節(jié)性溫度對短程硝化生物膜系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)的影響,以平均水溫分別為28.3,23.3,21.6, 9.6,-0.2℃條件下的短程硝化生物膜為研究對象,利用PCR-DGGE技術(shù)對比分析不同生物膜中的微生物群落結(jié)構(gòu)的異同,以期從微觀方面為低溫條件下穩(wěn)定實(shí)現(xiàn)短程硝化提供新的思路和方法.

1 材料與方法

1.1 樣品采集

試驗(yàn)采用MBBR反應(yīng)器,長180mm,寬120mm,高260mm,有效體積約為5.6L,如圖1所示,反應(yīng)器上部進(jìn)水,蠕動泵控制,下部溢流出水.采用底部曝氣盤曝氣,曝氣量控制和計量采用微電腦曝氣裝置控制,通過探頭精確測量和微調(diào),溫度傳感器在線監(jiān)測反應(yīng)器內(nèi)水溫的變化．實(shí)驗(yàn)采用人工配水(自來水中加入12.8mg/L CH3COONa、11mg/L KH2PO4、229mg/L NH4Cl和720mg/L NaHCO3配制而成).反應(yīng)器內(nèi)的接種污泥均取自北京某污水處理廠曝氣池,其硝化性能良好,值在0.7左右,污泥指數(shù)(SVI)值在90mL/g左右,污泥濃度(MLSS)在3500mg/L左右,向反應(yīng)器內(nèi)投加鮑爾環(huán)作為懸浮填料.實(shí)驗(yàn)過程中控制溶解氧(DO)>5mg/L,進(jìn)水pH值約為7.8,出水pH值約為7.3,整個反應(yīng)階段室外水溫從32.6℃降低到-3.3℃.

本試驗(yàn)從2015年7月11日啟動掛膜,反應(yīng)器運(yùn)行半年直至2016年1月14日,分子生物學(xué)取樣分別在平均水溫為28.3,23.3,21.6,9.6,-0.2℃條件下,分別記為R1、R2、R3、R4和R5.

1.2 樣品總DNA提取

將包埋菌樣品使用研缽研碎,超聲波破碎儀(AMPLITUDE 50%)破碎60s,在1.5mL離心管中靜沉30min后舍去上清液,之后15000r/min高速離心5min后,去除上層清液,取0.3g污泥用于總DNA提取,剩余污泥冷凍備用.采用上海生工提供的“Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒(土壤)”提取DNA后,取5μL提取的DNA用1.2%瓊脂糖凝膠檢測.

1.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)

針對總細(xì)菌的PCR擴(kuò)增,以提取的總DNA作為模板,采用對大多數(shù)細(xì)菌16S rRNA基因V3區(qū)都具有特異性的引物對[8]F357-GC(5'- CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCCCTACGGGAGGCAGCAG-3')和R518(5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3').反應(yīng)體系(50μL)為:10×PCR buffer5μL,dNTP(各2.5mmol/L)4μL,F357-GC(20μmol/L)1μL,R518(20μmol/L)1μL,Taq DNA聚合酶(5U)0.5μL,DNA模板0.25μL,加ddH2O至50μL.反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性5min;94℃變性1min,65℃退火1min,72℃延伸1min,共進(jìn)行20個循環(huán),每個循環(huán)降低0.5℃;94℃變性1min,55℃退火1min,72℃延伸1min,共進(jìn)行10個循環(huán);72℃延伸8min.

針對亞硝化細(xì)菌(AOB)的PCR擴(kuò)增,采用巢式PCR擴(kuò)增,第1輪擴(kuò)增以提取的總DNA作為模板,采用特異性引物對[9]CTO189fA/B/C (CTO189fA:5'-GGAGAAAAGCAGGGGATCG-3'、CTO189fB:5'-GGAGGAAAGCAGGGGATC- G-3'、CTO189fC:5'-GGAGGAAAGTAGGGGA- TCG-3')和CTO654r(5'-CTAGCYTTGTAGTTT-CAAACGC-3');第2輪擴(kuò)增以第一輪PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物為模板,采用引物對F357-GC和R518.第1輪反應(yīng)體系(50μL)為:10×PCR buffer5μL, dNTP (各2.5mmol/L)4μL,CTO189fA/B/C(20μmol/L)0.5μL,CTO654r(20μmol/L)0.5μL,Taq DNA聚合酶(5U) 0.5μL,DNA模板1μL,加ddH2O至50μL.反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性5min;94℃變性45s,57℃退火45s,72℃延伸90s,共進(jìn)行35個循環(huán),72℃延伸10min.第2輪反應(yīng)體系(50μL)為:10×PCR buffer5μL,dNTP(各2.5mmol/L)2μL, F357-GC (20μmol/L)3μL,R518(20μmol/L)3μL,Taq DNA聚合酶(5U)0.5μL,DNA模板0.25μL,加ddH2O至50μL.反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性5min; 94℃變性1min,65℃退火1min,72℃延伸1min,共進(jìn)行20個循環(huán),每個循環(huán)降低0.5℃;94℃變性1min,55℃退火1min,72℃延伸1min,共進(jìn)行10個循環(huán);72℃延伸8min.

1.4 變性梯度凝膠電泳(DGGE)

采用DCodeTM基因突變檢測系統(tǒng)(Bio- Rad,USA)對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離.經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn),本試驗(yàn)的DGGE電泳使用8%的聚丙烯酰胺凝膠,總細(xì)菌和AOB的電泳條件均為:凝膠變性梯度為30%~60%,電壓150V,電泳緩沖液為1×TAE,電泳溫度60℃,電泳時間7h.電泳結(jié)束后,用Gel Red核酸凝膠染料染色30min,在凝膠成像系統(tǒng)(Gel DocTMXR+,Bio-Rad)中進(jìn)行拍照.

1.5 克隆與測序

對DGGE電泳后圖譜上的優(yōu)勢條帶進(jìn)行切膠回收.對于選定的每個條帶,只選擇其中間部分進(jìn)行切割.回收的條帶轉(zhuǎn)移到1.5mL 離心管中,用槍頭擠碎,加入50μL的滅菌超純水,4℃浸泡過夜,使DNA片段溶解于水中,取其溶液為模板,采用不帶GC夾結(jié)構(gòu)的F357和R518引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增體系和程序與之前帶GC夾的引物對F357-GC和R518相同.PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測并采用上海生工提供的SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒純化,將純化后的DNA片段連接至pMD18-T Vector(TaKaRa, Japan) .轉(zhuǎn)化到JM109感受態(tài)細(xì)胞中,在含有Amp/X- Gal/IPTG的LB平板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選.挑選白斑做菌落PCR驗(yàn)證,片段大小正確的PCR產(chǎn)物送往上海生工生物公司進(jìn)行測序.將測序所得基因序列輸入到NCBI網(wǎng)站,利用BLAST程序與數(shù)據(jù)庫中已有的序列進(jìn)行比對鑒定,并利用MEGA5.0軟件中的鄰接算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.

1.6 樣品的生物多樣性分析

采用凝膠分析軟件Quantity One對掃描所得的DGGE圖譜進(jìn)行分析.根據(jù)DGGE技術(shù)原理,圖譜中分離出來的條帶都是不同種類的微生物16S rDNA基因V3區(qū)的DNA片段,每個條帶理論上可以代表一個微生物種屬,條帶的多寡可以反映系統(tǒng)中微生物種群的多樣性程度.Shannon多樣性指數(shù)(SDI)由樣品中微生物種屬的數(shù)量和豐度所決定,SDI 數(shù)值越大,種群的多樣性越高.Pielou均勻性指數(shù)(EI)表示菌種分布的均勻程度.因此可利用Shannon多樣性指數(shù)(SDI)和Pielou均勻性指數(shù)(EI)討論活性污泥中微生物多樣性特征.SDI和EI計算公式[8]如下:

(2)

式中:P為菌種在菌落中所占的百分比,P=n/,n為峰面積,為所有峰的總面積;為是樣品中所有菌種的總數(shù),即Patrick豐富度指數(shù).

2 結(jié)果與討論

2.1 溫度對短程硝化性能的影響

2.1.1 不同溫度條件下系統(tǒng)的短程硝化效果 從圖2可以看出,MBBR反應(yīng)器從7月11日開始運(yùn)行,此時反應(yīng)水溫為30.3℃,通過逐步縮短反應(yīng)器HRT為3.7h的方式,反應(yīng)器中逐漸出現(xiàn)NO2--N的積累,至7月27日,反應(yīng)器中的NO2--N積累率達(dá)到93.3%,出水NH4+-N和NO2--N質(zhì)量濃度分別為3.48mg/L和56mg/L,氨氮去除率達(dá)到94.2%,基本所有NH4+-N都轉(zhuǎn)化為NO2--N,反應(yīng)器達(dá)到穩(wěn)定的短程硝化.反應(yīng)器在8月21日~9月11日停止運(yùn)行,9月11日運(yùn)行一周后活性恢復(fù)到之前的水平.反應(yīng)器運(yùn)行這一階段室外水溫從32.6℃降低至-0.2℃,通過調(diào)節(jié)反應(yīng)器HRT維持出水氨氮在6~12mg/L.11月24日以后室外水溫過低導(dǎo)致連續(xù)流出水口堵塞,所以后期采用SBR形式運(yùn)行,反應(yīng)器運(yùn)行至1月14日.選取6d取樣測定,11月26日~12月28 日HRT為24h,氨氮去除率為60%左右,12月29日~1月14日 HRT為48h,氨氮去除率為50%左右,但亞氮積累率一直維持在90%以上,SBR形式運(yùn)行期間最低溫度低至-3.3℃.R1~R5階段平均水溫分別為28.3,23.3,21.6,9.6,-0.2℃對應(yīng)的氨氧化速率分別為22.4,17.7,16.2,7.1,1.9mgNH4+-N/(L·h),可以看出隨著溫度的降低氨氮氧化速率下降,表明微生物活性下降.

2.1.2 短程硝化實(shí)現(xiàn)與穩(wěn)定的原因 (1)反應(yīng)器HRT精準(zhǔn)的控制是短程硝化實(shí)現(xiàn)的主要因素.按照出水氨氮在6~12mg/L來調(diào)節(jié)反應(yīng)器HRT,能夠靈活、準(zhǔn)確的確定曝氣時間.這樣一方面可以使大部分氨氮被徹底氧化,另一方面防止了過度曝氣引起亞硝酸鹽氮進(jìn)一步氧化為硝酸鹽氮,從而抑制了亞硝酸氧化菌的生長.

(2)從溫度的角度考慮,在實(shí)現(xiàn)短程硝化的階段,溫度正處于30~33℃,而這個溫度正是實(shí)現(xiàn)短程硝化的最佳溫度[10],此時AOB的生長速率高于NOB的生長速率,將快速實(shí)現(xiàn)短程硝化.

在短程硝化的穩(wěn)定階段,通過出水中的FA和FNA協(xié)同抑制,進(jìn)一步增大AOB在硝化菌群中的優(yōu)勢,同時又盡可能減少了NOB的生長機(jī)會,使NOB逐漸從系統(tǒng)中被淘汰出去,從而逐漸優(yōu)化了硝化菌群的結(jié)構(gòu),為在低溫條件下實(shí)現(xiàn)短程硝化奠定基礎(chǔ).

2.1.3 低溫條件下短程硝化的實(shí)現(xiàn)途徑與機(jī)理 本試驗(yàn)隨著溫度下降氨氧化速率降低,細(xì)菌活性減小,但短程硝化一直很穩(wěn)定,分析其原因:主要是低溫短程硝化的實(shí)現(xiàn)要從中溫、常溫狀態(tài)入手,通過調(diào)節(jié)運(yùn)行方式、控制手段等方法使AOB成為硝化菌群中絕對的優(yōu)勢菌種,并將NOB盡可能多的從系統(tǒng)中淘汰出去[11].

2.2 溫度對總細(xì)菌的影響

2.2.1 樣品總DNA提取和總細(xì)菌PCR擴(kuò)增結(jié)果 污泥樣品提取的DNA經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,得到的總DNA片段大小約為23kbp,屬于比較完整的細(xì)菌總DNA,適合做下一步PCR擴(kuò)增.針對總細(xì)菌16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果大約為240bp,符合預(yù)期的長度,適合做下一步DGGE.

2.2.2 DGGE指紋圖譜結(jié)果 如圖3所示,顯示了樣品R1~R5所代表的溫度條件分別為28.3, 23.3,21.6,9.6,-0.2℃的短程硝化污泥中微生物群落結(jié)構(gòu)的差異和演替.

圖3是總細(xì)菌DGGE圖譜,將條帶對應(yīng)的微生物可以分為3類,第1類是條帶14、15、19代表的微生物,它們在整個實(shí)驗(yàn)階段都存在,能夠適應(yīng)水溫從32.6~-3.3℃溫度變化大的環(huán)境,對反應(yīng)器的穩(wěn)定運(yùn)行起著至關(guān)重要的作用;第2類是條帶2、3、4、6、7、11、12、17、18對應(yīng)的微生物,它們隨著水溫的逐步降低而逐漸減少至最后被淘汰,表明這類細(xì)菌在水溫低的條件下受到抑制,適合生存于較高溫度環(huán)境中;第3類是條帶5、8、9對應(yīng)的微生物,它們在水溫高的條件下為非優(yōu)勢菌,隨著水溫逐步降低,這類微生物逐漸增多或出現(xiàn),適合生存于低水溫環(huán)境中.

2.2.3 總細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)多樣性特征 如圖4所示,樣品R1到樣品R2的SDI值和EI值均上升,這是反應(yīng)器從啟動到穩(wěn)定的過程,故微生物種群趨于豐富和分布均勻.R2到R3階段SDI值和EI值均下降,一方面是這一階段反應(yīng)器停止運(yùn)行,使得DO和營養(yǎng)物質(zhì)無法供應(yīng)抑制微生物生長繁殖;另一方面R2到R3平均水溫從23.3~ 21.6℃,水溫降低微生物表現(xiàn)出生長速度放緩的趨勢[12],故R2到R3微生物種群多樣性變低,分布趨于集中.

表1 總細(xì)菌部分條帶 16S rDNA 序列比對結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)中樣品R3、R4和R5的平均水溫分別為21.6、9.6和-0.2℃,溫度跨越比較大,但這3個樣品的SDI值和EI值幾乎相同.分析原因:一是平均水溫從21.6~-0.2℃階段該污水處理系統(tǒng)中耐冷菌漸漸保留了下來,這部分耐冷菌可以適應(yīng)溫度逐漸降低而不被淘汰;二是本試驗(yàn)采用鮑爾環(huán)懸浮填料,對微生物有截留作用,使得大部分細(xì)菌不會流失,故上述3個樣品的多樣性和均勻性幾乎相同.

2.2.4 特征條帶的回收測序和系統(tǒng)發(fā)育分析 將總細(xì)菌的DGGE圖譜中部分優(yōu)勢條帶進(jìn)行切膠測序,在Genbank中進(jìn)行比對,獲得各條序列的同源性信息,總細(xì)菌的部分條帶16S rDNA序列比對結(jié)果見表1.總細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖5.

由表1可以看出,本次試驗(yàn)5個樣品中的微生物群落主要分布于變形菌門(Proteobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes).Wagner等[14]對多篇關(guān)于廢水生物處理反應(yīng)器中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的研究表明變形菌門和擬桿菌門一直是廢水處理系統(tǒng)中的優(yōu)勢菌群.其中5個樣品的共有條帶中,條帶1、13、14、16和19均與Bacillus的同源性達(dá)到98%以上,微生物同源性大于97%就可以判斷為是同一種屬,郝桂玉等[15]認(rèn)為芽孢桿菌(Bacillus)對硝化階段氨氮的去除有很明顯的作用;條帶9與Flavobacterium sp. (HQ000016.1)的同源性達(dá)到98%,黃桿菌屬(Flavobacterium)和芽孢桿菌(Bacillus)均為生物膜污水處理系統(tǒng)的常見優(yōu)勢細(xì)菌,且都是在低溫條件下高效降解生活污水的耐冷菌[16].條帶2、3、4和5均與Nitrosomonas的同源性達(dá)到97%以上,亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)在反應(yīng)器內(nèi)將氨氧化為亞硝酸鹽,為短程硝化系統(tǒng)中的優(yōu)勢菌群[17-18].

2.3 溫度對AOB的影響

2.3.1 AOB PCR擴(kuò)增結(jié)果 針對AOB 16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果大約為500bp(第1輪)和250bp(第2輪),符合預(yù)期的長度,適合做下一步DGGE.

2.3.2 DGGE指紋圖譜結(jié)果與分析 圖6為針對AOB的16S rRNA基因所得DGGE圖譜.將條帶對應(yīng)的微生物可以分為2類,第一類微生物隨室外溫度逐步降低一直存在,如條帶2、3、8、9、10,這部分亞硝酸細(xì)菌能夠適應(yīng)短程硝化溫度逐漸降低的各個階段,如果能篩選出這些菌種并加以富集大規(guī)模的培養(yǎng)馴化,則穩(wěn)定的短程硝化系統(tǒng)可以應(yīng)對低溫的惡劣環(huán)境.第二類微生物隨水溫逐步降低而逐漸減少遭到淘汰,如條帶1、4、5、6、7代表的微生物,且這幾類微生物均只存在于R1和R2階段,表明這類亞硝酸鹽細(xì)菌在水溫逐漸降低的條件下受到抑制,適合生存于水溫較高的環(huán)境中.

2.3.3 AOB種群結(jié)構(gòu)多樣性特征 如圖7所示.可以看出:樣品R1~R5的EI值幾乎相同,表明在穩(wěn)定的生物膜短程硝化系統(tǒng)中,水溫從32.6~-3.3℃微生物分布的均勻性幾乎沒有受到影響.對于SDI值,樣品RI和樣品R2較高且相同,表明平均水溫為23.3~28.3℃環(huán)境中AOB多樣性豐富.

樣品R3、R4和R5的SDI值較前2個樣品低且?guī)缀跸嗤?即反應(yīng)平均水溫從21.6~-0.2℃系統(tǒng)內(nèi)AOB的多樣性幾乎保持不變.在懸浮生長的活性污泥中,硝化細(xì)菌在低溫條件下生長會受到很大程度上的抑制[19-23],但試驗(yàn)所得結(jié)果卻是上述3個樣品的SDI值幾乎不變.分析原因:一是本試驗(yàn)采用MBBR工藝,V. Hoang[13]等認(rèn)為MBBR反應(yīng)器有快速適應(yīng)和快速恢復(fù)能力,在溫度變化下硝化細(xì)菌保持在生物膜中不丟失也不溶解;二是本試驗(yàn)采用鮑爾環(huán)懸浮填料,硝化細(xì)菌具有強(qiáng)烈的親和依附固體生長的特性,使得硝化細(xì)菌可以依附填料生長和繁殖,不再因其世代時間較長而受制于HRT造成硝化細(xì)菌流失[24];三是Jones等[25]認(rèn)為,如果將AOB從30℃的條件下直接轉(zhuǎn)移到5℃的環(huán)境中,會導(dǎo)致它們失活,但若逐步適應(yīng),AOB能夠根據(jù)溫度變化逐漸調(diào)整細(xì)胞膜中的脂肪酸類型,使其中的飽和長鏈脂肪酸部分轉(zhuǎn)化為短鏈不飽和脂肪酸以使其在低溫條件下不易“凍結(jié)”,但這需要一定時間的培養(yǎng)和馴化.

2.3.4 AOB特征條帶的回收測序和系統(tǒng)發(fā)育分析 將AOB的DGGE圖譜中部分優(yōu)勢條帶進(jìn)行切膠測序,在Genbank中進(jìn)行比對,獲得各條序列的同源性信息,AOB的部分條帶16S rDNA序列比對結(jié)果見表2. AOB的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖8.

從表2的AOB部分條帶16S rDNA序列比對結(jié)果和圖8的AOB系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出,本研究中分離到的亞硝化細(xì)菌(AOB)均與Proteobacteria的亞硝化單胞菌屬()有較高的相似性(90%~99%),而沒有與亞硝化螺菌屬()有一定相似性的序列,已有研究證實(shí)絕大多數(shù)的生物反應(yīng)器里是AOB中的優(yōu)勢菌屬,而只出現(xiàn)在個別反應(yīng)器里[26-28].由表2可以看出,條帶2和條帶9與sp.的同源性均達(dá)到99%,itrosomonas sp.在氨氮轉(zhuǎn)化為羥胺的過程中起主導(dǎo)作用,造成反應(yīng)器內(nèi)亞硝酸鹽積累,溫室氣體N2O排放增加[29],是影響系統(tǒng)內(nèi)含氮污染物轉(zhuǎn)化途徑的關(guān)鍵菌屬.條帶6和條帶8分別與(NR_117368.1)和(HM446362.1)的同源性達(dá)到98%和99%,可利用氨氧化過程中的電子轉(zhuǎn)移能量,可將CO2固定在植物中,在氮循環(huán)中有重要作用.本研究中的優(yōu)勢AOB均屬于亞硝化單胞菌屬(),且出現(xiàn)在短程硝化穩(wěn)定時期溫度不同階段的不同菌種,表明該反應(yīng)器生物膜內(nèi)部形成的環(huán)境條件在溫度從32.6~-3.3℃均能夠?yàn)槎喾NAOB提供生存環(huán)境.

表2 AOB部分條帶16S rDNA序列比對結(jié)果

3 結(jié)論

3.1 在合理HRT控制的前提下,水溫降低會影響微生物活性,但不會影響短程硝化穩(wěn)定性.

3.2 試驗(yàn)平均水溫21.6~-0.2℃總細(xì)菌的多樣性和均勻性沒有改變,芽孢桿菌、黃桿菌、亞硝化單胞菌等污水處理功能微生物都得到保留.5個樣品中的優(yōu)勢菌群主要分布于變形菌門()和擬桿菌門().

3.3 試驗(yàn)平均水溫21.6~-0.2℃ AOB的多樣性和均勻性沒有改變.AOB種群分析表明優(yōu)勢AOB均屬于亞硝化單胞菌屬().

[1] 高春娣,王惟肖,李 浩,等.SBR法交替缺氧好氧模式下短程硝化效率的優(yōu)化 [J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2015,35(2):403-409.

[2] 孫洪偉,楊 慶,董國日,等.游離氨抑制協(xié)同過程控制實(shí)現(xiàn)滲濾液短程硝化 [J]. 中國科學(xué):化學(xué), 2010,40(8):1156-1162.

[3] 張功良,李 冬,張肖靜,等.低溫低氨氮SBR短程硝化穩(wěn)定性試驗(yàn)研究 [J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2014,34(3):610-616.

[4] Rivasim, Arvin F. Side stream biofilm for im-proved biofouling control in cooling water system [J]. Water Science & Technology, 2001,41:445-451.

[5] Paul L B, Tong Y.A microelectrode study of redox potential chain biofilms [J]. Water Science & Technology, 1999,39(7):179-185.

[6] Massoldeya A A, Whallon J, Hickey R F, et al. Channel structures in aerobic biofilms of fixed –film reactors treating contaminated groundwater [J]. Applied and Environmental Microbiology, 1995,61(3):769-777.

[7] Chrysi S L, Bruce E R. Modeling the development of biofilm density including active bacteria, inert bio-mass, and extracellular polymeric substances [J]. Water Research, 2004,38:3349-3361.

[8] 侯愛月,李 軍,卞 偉,等.不同好氧顆粒污泥中微生物群落結(jié)構(gòu)特點(diǎn)[J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2016,36(2):428-436.

[9] Kowalchuk G A, Bodelier P L E, Heilig G H J, et al. Community analysis of ammonium-oxidizing bacteria,in relation to oxygen availability in soils and root-oxygenated sediments, using PCR, DGGE and oligonucleotide probe hybridization [J]. FEMS Microbiology Ecology, 1998,24:339-350.

[10] Hellinga C, Schellen A A, Mulder J W, et al. The sharon process: An innovative method for nitrogen removal from ammonium-rich wastewater [J]. Water Science & Technology, 1998,37(9): 135-142.

[11] 楊 慶,彭永臻,王淑瑩,等.SBR法低溫短程硝化實(shí)現(xiàn)與穩(wěn)定的中試研究[J]. 化工學(xué)報, 2007,58(11):2901-2905.

[12] 崔 迪.寒區(qū)污水生化處理系統(tǒng)微生物群落結(jié)構(gòu)與功能解析 [D]. 哈爾濱::哈爾濱工業(yè)大學(xué), 2014.

[13] Hoang V, Delatolla R, Abujamel R, et al. Nitrifying moving bed biofilm reactor (MBBR) biofilm and biomass response to long term exposure to 1℃ [J]. Water Research, 2014,49:215-224.

[14] Wagner M, Loy A. Bacterial community composition and function in sewage treatment systems [J]. Current Opinion in Biotechnology, 2002,13(3):218-227.

[15] 郝桂玉,徐亞同,黃民生,等.芽孢桿菌脫氮作用的研究[J]. 環(huán)境科學(xué)與技術(shù), 2004,27(1):20-21,37.

[16] 韓曉云.低溫生物膜及其微生物特性研究 [D]. 哈爾濱:哈爾濱工業(yè)大學(xué), 2006.

[17] Flores III A, Nisola G M, Cho E, et al. Bioaugmented sulfur- oxidizing denitrification system with Alcaligenes defragrans B21forhigh nitrate containing wastewater treatment [J]. Bioprocess and Biosystems Engineering, 2007,30(3):197-205.

[18] Limpiyakorn T, Kurisu F, Sakamoto Y, et al. Effects of ammonium and nitrite oncommunities and populations of ammonia-oxidizing bacteria in laboratory-scale continuous-flow reactors [J]. Fems Microbiology Ecology, 2007,60(3):501-512.

[19] Van Dyke S, Jones S, Ong S K. Cold weather nitrogen removal deficiencies of aerated lagoons [J]. Environmental Technology, 2003,24(6):767-777.

[20] Buswell A M, Shiota T, Lawrence N, et al. Laboratory studies on the kinetics of the growth of Nitrosomonas with relation to the nitrification phase of the B.O.D test [J]. Applied Microbiology, 1954,2(1):21-25.

[21] Mc Cartney D M, Oleszkiewicz J A. Carbon and nutrient removal in a sequencing batch reactor at low temperatures [J]. Environmental Technology, 1990,11(2):99-112.

[22] Painter H A,Loveless J E. Effect of temperature and pH value on the growth-rate constants of nitrifying bacteria in the activated- sludge process [J]. Water Research, 1983,17(3):237-248.

[23] Delatolla R, Tufenkji N, Comeau Y, et al. Effects of long exposure to low temperatures on nitrifying biofilm and biomass in wastewater treatment [J]. Water Environment Research, 2012, 84(4):328-338.

[24] 張 巖,孫鳳俠,謝杭冀,等.四區(qū)一體反應(yīng)器冬季啟動脫氮特性及硝化菌群結(jié)構(gòu)分析[J]. 環(huán)境科學(xué), 2015,36(9):3339-3344.

[25] Jones R D, Mo ri ta R Y, Koops H P, et al. A new marine am monium-oxidizing bacterium Nitrosomonas cryotolerans sp. nov. [J]. Can. J. Microbiol., 1988,34(10):1122-1128.

[26] Purkhold U, Pommerening-r?ser A, Juretschko S. Phylogeny of all recognized species of ammonia oxidizers based on comparative 16S rRNA and amo A sequence analysis: implications for molecular diversity surveys [J]. Applied Environmental Microbiology, 2000,66(12):5368–5382.

[27] Wells G F, Park H D, Yeung C H, et al. Ammonia-oxidizing communities in a highly aerated full-scaleactivated sludge bioreactor: betaproteobacterial dynamics and low relative abundance of Crenarchaea [J]. Environmental Microbiology, 2009,11(9):2310–2328.

[28] Zhang T, Ye L, Tong A, et al. Ammonia-oxidizing archaea and ammonia-oxidizing bacteria in six full-scale wastewater treatment bioreactors [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2011,91(4):1215-7660.

[29] Yu T, He P J, Lü F, et al. Mediating N2O emissions from municipal solid waste landfills: Impacts of landfill operating conditions on community structure of ammonia-oxidizing bacteriain cover soils [J]. Ecological Engineering, 2009,35(5): 882-889.

Characteristics of microbial community structure in the stable operation of the partial cut nitrification system with seasonal temperature.

ZHAO Xin-yan1, BIAN Wei1, HOU Ai-yue2, KAN Rui-zhe1, ZHAO Qing1, LI Jun1*

(1.College of Architecture Engineering, Beijing University of Technology, Beijing 100124, China；2.Beijing Guohuan Tsinghua Environment Engineering Design and Research Institute, Beijing 100084, China).

In order to investigate the effect of seasonal temperature on microbial community structure of nitrification biofilm system, the nitrification biofilm system in MBBR reactor under the temperature of 28.3,23.3,21.6,9.6 and -0.2℃ were studied by using denatures gradient gel electrophoresis polymerase chain reaction(PCR-DGGE) technique. The activity of bacteria affected by loss of the water temperature, but did not affect stability of nitrification. During the change of water temperature(21.6~0.2℃), the total bacteria and AOB stayed stable; and the waste-water treatment of Bacillus, Flavobacterium and Nitrosomonas also stayed stable. The dominant bacteria in biofilm mainly was Proteobacteria and Bacteroidetes under the average temperature of 28.3~-0.2℃, and the AOB was Nitrosomonas that was the part of β-Proteobacteria. The partial nitrification under low temperature was achieved by controlling HRT merely, and it made great sense for the application of shortcut nitrification process.

low temperature；partial nitrification；PCR-DGGE；microbial community structure；MBBR

X172

A

1000-6923(2017)04-1366-09

2016-08-29

水體污染控制與治理科技重大專項(xiàng)2015ZX07202-013

趙昕燕(1992-),女,山西臨汾人,北京工業(yè)大學(xué)碩士研究生,主要從事污水生物處理研究.

* 責(zé)任作者, 教授, jglijun@bjut.edu.cn

, 2017,37(4)：1366~1374