SPG膜乳化法制備粒徑均勻的布比卡因P(L)GA微球

于洪丹，吳新霞，王俊偉，蔡晨辰，劉 力，徐 暉*

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SPG膜乳化法制備粒徑均勻的布比卡因P(L)GA微球

于洪丹1，吳新霞2，王俊偉3，蔡晨辰1，劉 力1，徐 暉1*

（1. 沈陽(yáng)藥科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110016；2. 豐潤(rùn)區(qū)第二人民醫(yī)院婦幼保健院，河北唐山 064000；3. 沈陽(yáng)藥科大學(xué)中藥學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110016）

目的以酰胺類(lèi)局部麻醉藥布比卡因?yàn)槟Ｐ退幬?，生物可降解的P(L)GA為骨架材料，采用SPG膜乳化法制備均一粒徑、高載藥量的緩釋布比卡因微球。方法以微球粒徑、表面形態(tài)、載藥量和包封率為考察指標(biāo)，篩選微球制劑處方，考察微球的體外釋放行為并探討藥物釋藥機(jī)制。結(jié)果采用孔徑40 μm的SPG膜所制備的布比卡因P(L)GA微球的粒徑均在15~20 μm內(nèi)，粒徑分布均勻；偏光顯微鏡觀察和XRPD分析結(jié)果表明，藥物以晶體形態(tài)存在于微球內(nèi)部；影響微球釋放的主要因素為投藥量、外水相體積及載體類(lèi)型；當(dāng)投藥量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%、外水相體積100 mL時(shí)制備的布比卡因PLA微球具有相對(duì)理想的藥物釋放行為；Ritger-Peppas擬合結(jié)果表明，布比卡因以擴(kuò)散方式從微球中釋放。結(jié)論這種高載藥量、粒徑均勻的布比卡因緩釋微球可望應(yīng)用于臨床的術(shù)后鎮(zhèn)痛。

藥劑學(xué)；緩釋微球；SPG膜乳化法；布比卡因；聚乳酸；術(shù)后疼痛

布比卡因 (BUP) 屬于酰胺類(lèi)局麻藥，化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。布比卡因起效快、作用強(qiáng)，被廣泛用于局部麻醉和術(shù)后鎮(zhèn)痛[1]。布比卡因在人體內(nèi)消除半衰期為(2.7±1.3) h，局麻作用持續(xù)時(shí)間較短，為實(shí)現(xiàn)局麻效果往往需要多次給藥，導(dǎo)致局部組織高濃度藥物經(jīng)吸收入血，產(chǎn)生不同程度的中樞神經(jīng)和心血管毒性[2]。新型藥物傳遞系統(tǒng)逐漸用于布比卡因的長(zhǎng)效制劑，包括微球、植入劑、脂質(zhì)體等，這些新型制劑對(duì)延長(zhǎng)局麻藥的作用時(shí)間、改善患者的順應(yīng)性等具有良好的效果[3]，如布比卡因脂質(zhì)體注射液EXPAREL?、布比卡因乙酸乙丁酸蔗糖酯（SABER）凝膠貯庫(kù)型注射液Posidur?、布比卡因膠原蛋白植入劑XaraColl?[4-6]，在臨床應(yīng)用中取得良好的術(shù)后鎮(zhèn)痛效果。

聚乳酸（PLA）和乙酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）為生物相容性、可生物降解的脂肪族聚酯，被廣泛應(yīng)用于微粒藥物傳遞系統(tǒng)[7-8]，也有研究報(bào)道P(L)GA包載局麻藥緩釋微球用作注射用植入劑，延長(zhǎng)局麻藥的作用時(shí)間[9-10]。微球的制備方法很多，其中乳化溶劑揮發(fā)法簡(jiǎn)單易行，方便控制，并被多數(shù)研究者采用，但是通過(guò)高速剪切分散或機(jī)械攪拌條件下制備的微球粒徑大小不一，粒度范圍寬，重現(xiàn)性差，這可能對(duì)微球的給藥、釋放行為和藥效產(chǎn)生很大的影響[11]。Shirasu porous glass (SPG) 膜乳化技術(shù)在控制粒度分布方面具有不可替代的優(yōu)越性，SPG膜是由親水性材料Al2O3-SiO2制成的一種多孔玻璃膜，通過(guò)SPG膜制備的脂溶性載體P(L)GA微球，粒徑均勻，不同孔徑大小的SPG膜制備的微球平均粒徑在1~100 μm內(nèi)可控[12]。

本研究的目的是制備高載藥量的布比卡因緩釋微球，以不同型號(hào)PL(G)A為載體，采用SPG膜乳化法制備微球，并考察微球的粒徑、載藥量、形貌和體外釋放等性質(zhì)。

Fig. 1 Chemical structure of bupivacaine

1 儀器與材料

BSA124S電子天平（德國(guó)Sartorius公司），T18 basic高速分散機(jī)（德國(guó)IKA公司），SPG膜乳化器、SPG膜（40μm）（日本SPG Technology株式會(huì)社），RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、B-220恒溫水浴鍋（上海亞榮生化儀器廠），SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司），BA300Pol偏光顯微鏡（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司，中國(guó)），IS09001往返式水浴恒溫?fù)u床（上海智城分析儀器制造有限公司），UV5100紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（安徽晥儀科技股份有限公司），S-3400掃描電鏡（日本Hitachi公司），XRD-6000X射線衍射儀（日本Shimadzu公司）

鹽酸布比卡因（上海三維制藥有限公司），氨水（分析純，沈陽(yáng)經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)試劑廠），聚乙烯醇（PVA-217，日本KURARAY公司），聚乳酸（PLA，IV=2.0 dL?g-1）、乙酸-羥基乙酸共聚物（PLGA, IV=1.6 dL?g-1或2.0 dL?g-1）（長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所），其他試劑（分析純或色譜純，市售）。

2 方法

2.1 布比卡因游離堿的制備和理化性質(zhì)考察

O/W型乳化溶劑揮發(fā)法適用于水不溶性藥物，需要將鹽酸布比卡因原料藥制備成脂溶性游離堿以提高包封率。稱(chēng)取適量鹽酸布比卡因原料藥，加水配成近飽和溶液，滴加過(guò)量氨水至完全沉淀，過(guò)濾，洗滌，干燥沉淀得布比卡因游離堿。取適量的布比卡因游離堿5份，分別加入水及pH值5.0、6.5、6.8、7.4的磷酸鹽緩沖液，37 ℃恒溫振搖24 h，過(guò)濾、適當(dāng)稀釋后于263 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算溶解度；用pH值7.4的磷酸鹽緩沖液溶解并稀釋成一定濃度的布比卡因溶液，37 ℃恒溫振搖，于不同時(shí)間點(diǎn)取樣測(cè)定吸光度，考察穩(wěn)定性；測(cè)定布比卡因在正辛醇和水中的油水分配系數(shù)，用正辛醇飽和的蒸餾水溶解適量的布比卡因，測(cè)得吸光度為1，計(jì)算質(zhì)量濃度為1，精密移取該溶液5 mL加至等體積的水飽和的正辛醇中，放入25 ℃恒溫水浴搖床中，24 h后靜置、分離出水相，測(cè)得吸光度為2，計(jì)算質(zhì)量濃度為2，根據(jù)公式O/W=(1-2) /2，計(jì)算油水分配系數(shù)logO/W。

2.2 布比卡因微球的制備

通過(guò)SPG膜乳化技術(shù)制備布比卡因微球，制備方法如下：將P(G)LA和BUP溶于二氯甲烷中作為有機(jī)相，將含質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%PVA和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.6%Tween80的水溶液作為水相，迅速將有機(jī)相加入到水相，8 000 r?min-1高速剪切乳化，形成O/W型初乳，在液氮的壓力下迅速將初乳經(jīng)過(guò)膜乳化器（圖2），形成粒徑均一的乳劑，將乳劑加入至質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%PVA水溶液中，40 ℃下旋蒸10 min，除去有機(jī)溶劑，得固化的微球經(jīng)洗滌、離心、冷凍干燥。通過(guò)改變布比卡因投藥量、外水相體積和載體PL(G)A型號(hào)，以微球粒徑、表面形態(tài)、載藥量及包封率為考察指標(biāo)進(jìn)行微球處方的篩選。

Fig. 2 Illustration of SPG membrane emulsification method

2.3 載藥量和包封率的測(cè)定

建立載藥量和包封率測(cè)定的紫外-可見(jiàn)分光光度法，符合方法學(xué)要求。精密稱(chēng)取布比卡因微球約10.0 mg，置于25 mL量瓶中，加入甲醇20 mL，超聲30 min使微球破裂，釋放藥物，甲醇稀釋至刻度，離心取上清液，于波長(zhǎng)263 nm處測(cè)定吸光度，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算溶液中藥物含量，按照下述公式計(jì)算載藥量（drug loading，DL）和包封率（entrapment efficiency，EE）。

DL=(微球包載藥量)/(微球總質(zhì)量)×100%；EE=(微球測(cè)定載藥量)/(微球理論藥量)×100%。

2.4 微球的表征

用偏光顯微鏡觀察微球，利用軟件測(cè)量微球平均粒徑。取少量微球鋪于導(dǎo)電膠上，噴金，用掃描電鏡觀察表面形態(tài)。分別對(duì)布比卡因游離堿、空白微球及PLA載藥微球進(jìn)行X射線衍射（XRD）分析，測(cè)試條件為：用Cu Kα作為衍射源，λ為1.540 6 nm，掃描范圍為5°～60°（2），步長(zhǎng)為0.016 7°。

2.5 微球體外釋放

精密稱(chēng)取布比卡因微球約10.0 mg，加入pH值7.4的PBS溶液50 mL，置于37 ℃恒溫水浴搖床中，100 r?min-1振蕩，分別于6、12、24、36、48、60、72、96和120 h（即5 d）取樣，同時(shí)補(bǔ)加5 mL新鮮釋放介質(zhì)，反復(fù)搖勻使微球充分分散，再放回?fù)u床中繼續(xù)釋放。所取樣品經(jīng)5 000 r?min-1下離心6 min，保證微球完全沉淀，再用注射器吸取上清液5 mL過(guò)濾，于263 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算釋放量，繪制累積釋放曲線。

3 結(jié)果與討論

3.1 布比卡因理化性質(zhì)

布比卡因游離堿在水及pH值5.0、6.5、6.8和7.4的PBS溶液中的溶解度（37 ℃）見(jiàn)表1。結(jié)果表明，布比卡因在不同介質(zhì)中，其飽和溶解度隨pH值的降低而增加，在水中溶解度為(177.24±0.44) mg?L-1，而在pH值7.4的PBS溶液中增加至(393.66±0.66) mg?L-1。溶液中穩(wěn)定性考察結(jié)果顯示，布比卡因在pH值7.4的PBS溶液中（37 ℃）7 d內(nèi)穩(wěn)定（RSD=0.86%）。實(shí)驗(yàn)測(cè)定布比卡因的油水分配系數(shù)logO/W為3.14，表明布比卡因游離堿具有很強(qiáng)的脂溶性，適合用O/W型乳化溶劑揮發(fā)法制備微球。

Table 1 Solubility of bupivacaine in different media

3.2 微球的制備與表征

采用SPG膜乳化技術(shù)制備布比卡因微球，為了得到粒徑適合注射給藥的微球，選擇孔隙為40 μm的SPG膜，P(L)GA為載體，其中制備初乳時(shí)水相體積為10 mL，通過(guò)改變布比卡因投藥量、外水相體積和載體PL(G)A型號(hào)，進(jìn)行微球處方的篩選，結(jié)果見(jiàn)表2和圖3。由于前期的實(shí)驗(yàn)，對(duì)表面活性劑Tween80進(jìn)行過(guò)考察，實(shí)驗(yàn)表明含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.6%的Tween80使微球的粒徑、載藥量略微降低，但是微球的表面更光滑，且對(duì)微球的體外釋放影響不大，因此作者直接選取質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.6%的Tween80作為輔助乳化劑，以改善微球外觀?；赟PG膜乳化技術(shù)的目的，通過(guò)顯微鏡照片可知，不同處方微球粒徑均一，均在15~20 μm內(nèi)。當(dāng)外水相體積為100 mL時(shí)，投藥量質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為60%、65%、75%、80%（處方1、2、4、6），微球載藥量和包封率依次增加。當(dāng)投藥量質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%（處方5、6、7）、外水相體積為150、100和50 mL時(shí)，其外水相為100 mL時(shí)載藥量和包封率最高。外水相中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5% NaCl（處方8），與處方6相比，微球的載藥量和包封率略有降低。以PLGA為載體制備的微球（處方9、10），PLGA黏度（分子質(zhì)量）越高，載藥量和包封率越高。

Table 2 Formulations and properties of the prepared microspheres

Notes: a—PLA, IV=2.0 dL?g-1; b—PLGA75/25, IV=1.6 dL?g-1; c—PLGA 85/15, IV=2.0 dL?g-1

Fig.3 Polarizing microscope images of BUP-MSs.

對(duì)處方3、4、10進(jìn)行掃描電鏡觀察（圖4）。處方4為PLA微球，其表明光滑圓整，無(wú)藥物晶體吸附，而處方10為PLGA微球，微球雖然圓整，但是表面存在少量藥物晶體吸附；處方3為投藥量質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%的PLA微球，但其外水相體積為50 mL，可觀察到其表面粘附大量藥物晶體。由此可知，外水相體積對(duì)微球包封率影響明顯。通過(guò)XRPD曲線（圖5）可知，微球中布比卡因以晶體形態(tài)存在。

Fig. 4 Typical SEM images of the prepared BUP-MSs

A—BUP; B—BUP-MS; C—Blank MS

3.3 微球的體外釋放

布比卡因微球的體外釋放行為見(jiàn)圖6。不同載藥量微球表現(xiàn)不同的釋放速度。由釋放曲線可知，隨著投藥量的增加，釋放速度增加，投藥量質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于70%（處方1、2）時(shí)，微球釋放速度很慢，5 d累積釋放量低于20%。處方3由于外水相體積的減少而導(dǎo)致表面存在大量的藥物晶體，其突釋現(xiàn)象很?chē)?yán)重；處方4為投藥量質(zhì)量分?jǐn)?shù)75%的微球，能持續(xù)緩慢釋放藥物；而處方6由于過(guò)高的載藥量而導(dǎo)致釋放速度加快。外水相體積對(duì)微球釋放速度存在一定的影響，當(dāng)水相體積為50 mL時(shí)，由于微球表面粘附大量藥物而導(dǎo)致嚴(yán)重的突釋現(xiàn)象，外水相體積為100 mL與150 mL時(shí)的釋放速度差別不大，為了提高產(chǎn)率，外水相體積為100 mL時(shí)更理想。處方8中由于NaCl的存在，其藥物釋放速度降低。載體材料的型號(hào)同樣對(duì)微球的藥物釋放有明顯影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PLGA微球的釋放速度快，且突釋嚴(yán)重；處方9采用PLGA (75/25, IV=1.6 dL?g-1)為載體，與處方10 PLGA (85/15, IV = 2.0 dL?g-1)相比，載體黏度降低或聚乳酸比例下降，藥物釋放速度加快，突釋現(xiàn)象更明顯。分析可能的原因?yàn)?，與PLA相比，PLGA脂溶性相對(duì)較低，微球包封率下降，大量藥物粘附于載體表面，導(dǎo)致突釋現(xiàn)象嚴(yán)重。PLGA中聚乳酸比例下降，其親脂性有所降低，同樣導(dǎo)致類(lèi)似的現(xiàn)象。

布比卡因用于術(shù)后鎮(zhèn)痛，要求其5 d左右的鎮(zhèn)痛效果，處方4的微球具有比較理想的釋放特征，5 d內(nèi)持續(xù)緩慢釋放80%的布比卡因。對(duì)于球形顆粒，可以用Ritger-Peppas方程，即=n擬合釋放數(shù)據(jù)。當(dāng)≤0.43時(shí)，藥物釋放為Fick 擴(kuò)散機(jī)理；當(dāng)0.43﹤﹤0.89，藥物釋放機(jī)制為非Fick擴(kuò)散，即擴(kuò)散與骨架溶蝕機(jī)制相結(jié)合；當(dāng)﹥0.89，藥物釋放制劑為骨架溶蝕作用[13]。處方4微球的釋放曲線經(jīng)Ritger-Peppas擬合得，=12.2640.384 1，2=0.998 8，擬合得到的=0.384，由此可以推斷，布比卡因載藥微球的藥物釋放機(jī)理為擴(kuò)散控制機(jī)制。

Fig. 6 In vitro drug release profiles of BUP-MSs

4 結(jié)論

以生物可降解的PLA為載體，采用SPG膜乳化技術(shù)制備的布比卡因微球，所制備的微球粒徑均一，在15~20 μm內(nèi)，載藥量大于60%，微球具有明顯的體外藥物緩釋作用。布比卡因PLA微球可望為術(shù)后鎮(zhèn)痛和局部麻醉提供一種理想的給藥途徑。

致謝：本研究得到沈陽(yáng)藥科大學(xué)中青年教師事業(yè)發(fā)展支持計(jì)劃資助。

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Uniform bupivacaine PL(G)A microspheres for sustained release prepared by SPG membrane emulsification method

YU Hongdan1, WU Xinxia2, WANG Junwei3, CAI Chenchen1, LIU Li1, XU Hui1*

(1.,,110016,; 2,064000; 3,,110016,)

Objective The aim of this study is to prepare biodegradable P(L)GA microspheres embedded with high content of bupivacaine, an amide type of local anesthetics by the Shirasu porous glass (SPG) membrane emulsification technique, for sustained drug release. Method The formulation was screened by evaluating particle size, surface morphology, drug loading and entrapment efficiency, and thedrug release behavior and the release mechanism were investigated. Result Polarizing microscope observation and XPRD analysis indicated that bupivacaine existed as crystal in the uniform microspheres (15-20 μm) prepared by the SPG membrane with pore size of 40 μm. The key factors which affect the release of drug in cludes feed ratio of drug to polymer, volume of aqueous phase and type of P(L)GA. When the feed ratio of drug to polymer was 75% and aqueous phase volume was 100 mL, the drug loaded PLA microspheres exhibited sustained drug release behavior. Ritger- Peppas equation was introduced to fit the release profiles, and the result suggested that the release of bupivacaine from microspheres followed a diffusion controlled mechanism. Conclusion Uniform-sized PLA microspheres of high drug loading was prepared for sustained drug release, which provides great potential for the treatment of postoperative pain.

pharmaceutics; sustained release microspheres; SPG membrane emulsification technique; bupivacaine; poly (lactic acid); postoperative pain

(本篇責(zé)任編輯：趙桂芝)

（2017）03–0058–09

10.14146/j.cnki.cjp.2017.03.002

R 94

A

2015-04-10

于洪丹(1989-), 女(漢族), 遼寧葫蘆島人, 碩士研究生, E-mailyuhongdan1116@126.com；

徐暉(1972-), 男(漢族), 遼寧法庫(kù)人, 副教授, 博士, 主要從事藥物制劑研究, Tel. 024-23986356, E-mailxuhui_lab@163.com。