VITEK-MS質(zhì)譜儀直接檢測(cè)BacT/ALER T3D儀陽(yáng)性血培養(yǎng)瓶微生物的實(shí)驗(yàn)研究*

李聰，丁守甫，黃穎，王中新，沈繼錄，徐元宏

（安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科，安徽 合肥 230022）

VITEK-MS質(zhì)譜儀直接檢測(cè)BacT/ALER T3D儀陽(yáng)性血培養(yǎng)瓶微生物的實(shí)驗(yàn)研究*

李聰，丁守甫，黃穎，王中新，沈繼錄，徐元宏

（安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科，安徽 合肥 230022）

目的 評(píng)估基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（VITEK-MS）儀直接檢測(cè)BacT/ALERT 3D儀陽(yáng)性培養(yǎng)瓶微生物方法的可行性與準(zhǔn)確性。方法 選取2016年9月-2016年11月安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院微生物室BacT/ALERT 3D全自動(dòng)培養(yǎng)儀當(dāng)天報(bào)告陽(yáng)性的血培養(yǎng)瓶，差速離心法處理后直接用VITEK-MS進(jìn)行檢測(cè)，并與常規(guī)鑒定法進(jìn)行比較。結(jié)果 150例陽(yáng)性培養(yǎng)瓶中，除13例培養(yǎng)瓶中無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)外，VITEK-MS直接鑒定法正確檢測(cè)出97例（70.8%）菌株，錯(cuò)誤檢測(cè)出10例（7.3%）菌株，30例（21.9%）鑒定無(wú)結(jié)果。其中，革蘭陰性桿菌正確鑒定出61例（88.4%）菌株，鑒定無(wú)結(jié)果8例（11.6%）；革蘭陽(yáng)性球菌正確鑒定出36例（52.9%）菌株，鑒定錯(cuò)誤10例（14.7%），鑒定無(wú)結(jié)果22例（32.4%）。結(jié)論 利用VITEK-MS直接鑒定陽(yáng)性血培養(yǎng)瓶的方法準(zhǔn)確性高、特異性強(qiáng)，革蘭陰性桿菌鑒定準(zhǔn)確率遠(yuǎn)高于革蘭陽(yáng)性球菌，且鑒定時(shí)間短（只需2 h）。該方法可以作為快速診斷陽(yáng)性血培養(yǎng)瓶的新方法。

基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜；血培養(yǎng)；直接鑒定法

Abstract:Objective To evaluate the performance of matrix-assisted laser desorption/ionization time-offlight mass spectrometry system (VITEK-MS)for direct detection of bacteria in the positive bottles by BacT/ALERT 3D blood culture system and its identification rate.Methods All positive blood culture botlles reported by BacT/ALERT 3D blood culture system that had been obtained from the patients in the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University from September to November 2016 were selected.The bacteria were directly detected by VITEK-MS after differential centrifugation,and compared with the results by traditional biochemical identification.Results Among 150 positive blood culture bottles,there was no bacteria growth in 13 bottles;in the rest 137 bottles,VITEK-MS correctly identified 97 (70.8%),wrongly detected 10(7.3%),and could not identify 30 (21.9%).For Gram-negative bacilli,the correct identification rate was 88.4% (61 cases)and 8 cases (11.6%)were not identified.In Gram-positive cocci,the correct and wrong identification rate were 52.9% (36 cases)and 14.7% (10 cases),and 22 cases (32.4%)could not be identified.Conclusions The method of using VITEK-MS to identify the positive blood culture bottles is accurate and specific.The accurate identification rate of Gram-negative bacilli is much higher than that of Gram-positive cocci.The time for identification is reduced to 2 h.Thus,this method can provide rapid andreliable identification of microorganisms in blood culture bottles.

Keywords:matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry;blood culture;direct identification

血流感染在臨床有很高的發(fā)病率和病死率，快速診斷出致病菌并進(jìn)行對(duì)應(yīng)的抗生素治療至關(guān)重要，不僅可以減少血流感染的死亡率，而且可以降低患者的費(fèi)用[1]?；|(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system，VITEK-MS）的原理是采用激光照射微生物與基質(zhì)形成的結(jié)晶，使其發(fā)生電離形成特異的質(zhì)量圖譜，然后與數(shù)據(jù)庫(kù)中的圖譜進(jìn)行比較，鑒定出微生物的種屬[2]。VITEK-MS對(duì)純菌落菌種快速鑒定具有很高的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，鑒定時(shí)間從常規(guī)生化鑒定的48～72 h縮短為24 h，對(duì)常見(jiàn)細(xì)菌和酵母菌種屬的鑒定率能達(dá)85%～99%，已常規(guī)應(yīng)用于臨床微生物室[3]。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者均有嘗試用VITEK-MS直接法檢測(cè)陽(yáng)性血培養(yǎng)瓶中的微生物，如細(xì)胞裂解法和分離膠促凝管輔助法等[4-5]。本實(shí)驗(yàn)將采用VITEK-MS直接法鑒定陽(yáng)性培養(yǎng)瓶中的微生物，同時(shí)進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)程序，培養(yǎng)的單個(gè)菌落用VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀系統(tǒng)（以下簡(jiǎn)稱VITEK-2 Compact）進(jìn)行檢測(cè)，并以其結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)。將差速離心法結(jié)果與常規(guī)法比較，確定該方法的可行性與準(zhǔn)確率。

1 材料與方法

1.1 細(xì)菌來(lái)源

選取2016年9月1日-2016年11月30日安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院微生物室BacT/ALERT 3D全自動(dòng)培養(yǎng)儀報(bào)告陽(yáng)性的需氧血培養(yǎng)瓶（同一患者只選取1瓶陽(yáng)性瓶納入研究），并于當(dāng)天完成處理后進(jìn)行直接鑒定，共收集150例報(bào)告陽(yáng)性的需氧血培養(yǎng)瓶。

1.2 儀器和試劑

無(wú)水乙醇、甲酸及乙腈購(gòu)于合肥颯英斯生物科技有限公司（所用70%甲酸均使用當(dāng)天配制），VITEKMS質(zhì)譜儀及配套的靶板、α-氰基-4-羥基肉桂酸（a-Cyano-4-hydroxy-cinnamic acid，CHCA）基質(zhì)液、BacT/ALERT 3D儀、VITEK-2 Compact儀，以及相應(yīng)配套的革蘭陰性桿菌鑒定卡（gram-negative，GN）購(gòu)于法國(guó)生物梅里埃有限公司，質(zhì)控菌株為ATCC8739菌株（北京中原公司）。

1.3 VITEK-MS直接法

抽取陽(yáng)性血培養(yǎng)瓶中2.0 ml樣本，700 r/min離心10 min，上清液吸入新的離心管中，6 000 r/min離心15 min，棄去上清液。沉淀物加1 ml去離子水，6 000 r/min離心15 min，棄去上清液。再加300 μl去離子水和900 ul無(wú)水乙醇，渦旋至均勻，13 000 r/min離心2 min，棄去上清液，沉淀干燥。加入25 μl 70%甲酸和25 μl乙腈，渦旋至均勻，13 000 r/min離心1 min。取1 μl上清液液涂于VITEK-MS的靶板上，待完全干燥后加1 μl CHCA完全覆蓋點(diǎn)種的菌膜，待完全干燥后用VITEK-MS進(jìn)行檢測(cè)[6-7]。

1.4 常規(guī)鑒定方法

收集當(dāng)天報(bào)告陽(yáng)性的需氧血培養(yǎng)瓶，取1或2滴分別接種于血平板和巧克力平板上，在37℃、5%二氧化碳CO2培養(yǎng)18～24 h后，挑取純菌落，調(diào)取0.5麥?zhǔn)蠞岫炔迦隚N卡，放入VITEK-2 Compact進(jìn)行鑒定，以其結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，將常規(guī)細(xì)菌鑒定方法所得出的結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)，差速離心提取法所測(cè)的結(jié)果與其比較，根據(jù)VITEK-MS檢測(cè)結(jié)果，將置信度＞85%的數(shù)據(jù)作為其鑒定結(jié)果，其余均視為鑒定無(wú)結(jié)果，如鑒定無(wú)結(jié)果、頻譜采集錯(cuò)誤、波峰不足、鑒定出≥2種菌種且置信度低[7]。

2 結(jié)果

2.1 革蘭菌檢測(cè)結(jié)果

150例陽(yáng)性血培養(yǎng)瓶，用VITEK-2 Compact常規(guī)法鑒定出69例革蘭陰性桿菌，68例革蘭陽(yáng)性球菌（13例無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)）。VITEK-MS直接法正確鑒定97例（70.8%），錯(cuò)誤鑒定 10例（7.3%），鑒定無(wú)結(jié)果30例（21.9%）。見(jiàn)附表。

2.2 腸桿菌科細(xì)菌檢測(cè)結(jié)果

56株腸桿菌科中，經(jīng)VITEK-MS直接法檢測(cè)后，有48株（85.7%）與 VITEK-2 Compact檢測(cè)相同，7株（12.5%）鑒定無(wú)結(jié)果。見(jiàn)附表。

2.3 非發(fā)酵革蘭陰性桿菌檢測(cè)結(jié)果

11株非發(fā)酵菌中，經(jīng)VITEK-MS直接法檢測(cè)后，有10株（90.1%）與 VITEK-2 Compact檢測(cè)相同，1株（9.1%）鑒定無(wú)結(jié)果。其中鮑曼不動(dòng)桿菌與銅綠假單胞菌鑒定準(zhǔn)確率均達(dá)100%。見(jiàn)附表。

2.4 其他革蘭陰性桿菌檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)VITEK-MS直接法鑒定出2株（100%）嗜水/豚鼠氣單胞菌，1株（100%）副溶血嗜血桿菌，其與VITEK-2 Compact鑒定結(jié)果一致。見(jiàn)附表。

2.5 革蘭陽(yáng)性球菌檢測(cè)結(jié)果

68株革蘭陽(yáng)性球菌經(jīng)VITEK-MS直接法檢測(cè)后，正確鑒定36株（52.9%），錯(cuò)誤鑒定10株（14.7%），鑒定無(wú)結(jié)果22株（32.5%）。用VITEK-2 Compact鑒定主要分為葡萄球菌屬、鏈球菌屬、腸球菌屬，其經(jīng)VITEK-MS直接法鑒定正確的分別為31株（54.4%）、2株（40.0%）和 2株（50.0%）；錯(cuò)誤鑒定分別為 7株（22.6%）、3株（60.0%）和0株（0.00%）；鑒定無(wú)結(jié)果分別為 19株（33.3%）、0株（0.00）和 2株（50.0%）。對(duì)于2株藤黃微球菌，1株鑒定正確，1株鑒定無(wú)結(jié)果。見(jiàn)附表。

2.6 鑒定錯(cuò)誤的結(jié)果

與常規(guī)方法比較，VITEK-MS直接法共有10株菌株鑒定錯(cuò)誤，且全為革蘭陽(yáng)性球菌。其中，葡萄球菌屬鑒定錯(cuò)誤7株，3株表皮葡萄球菌分別錯(cuò)誤鑒定為金黃色葡萄球菌、人型葡萄球菌及溶血葡萄球菌；3株人型葡萄球菌分別錯(cuò)誤鑒定為2株表皮葡萄球菌和1株溶血葡萄球菌；1株耳葡萄球菌錯(cuò)誤鑒定為人型葡萄球菌。鏈球菌屬錯(cuò)誤鑒定3株，將唾液鏈球菌、格氏鏈球菌及草綠色鏈球菌分別錯(cuò)誤鑒定為前庭鏈球菌、毗鄰顆粒鏈球菌及溶血葡萄球菌。

附表 150例陽(yáng)性培養(yǎng)瓶VITEK-MS直接檢測(cè)與VITEK-2 C om pact檢測(cè)結(jié)果比較

2.7 VITEK-MS直接鑒定法的方法學(xué)特點(diǎn)

本實(shí)驗(yàn)以VITEK-2 Compact常規(guī)鑒定法結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果，將VITEK-MS直接鑒定法結(jié)果與其比較。VITEK-MS直接法鑒定陽(yáng)性97例，且全部常規(guī)鑒定結(jié)果陽(yáng)性；VITEK-MS直接法鑒定陰性53例，其中常規(guī)鑒定結(jié)果陽(yáng)性40例。該實(shí)驗(yàn)方法的準(zhǔn)確性為 73.3%（110/150），敏感性為 70.8%（97/137），特異性為100.0%（13/13）。其準(zhǔn)確性、敏感性及特異性的95%CI分別為（66.3，80.4）、（63.2，78.4）和（100.0，100.0）。

續(xù)附表

3 討論

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)是近年才發(fā)展起來(lái)的新型軟電離技術(shù)，采用該技術(shù)的VITEK-MS因其高通量的微生物鑒定系統(tǒng)和強(qiáng)大、可靠的數(shù)據(jù)庫(kù)，已成為一種快速、準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)單的鑒定微生物的新方法[8]。本院目前對(duì)報(bào)告陽(yáng)性血培養(yǎng)瓶中微生物的鑒定方法為取陽(yáng)性培養(yǎng)瓶中標(biāo)本接種于血平板和巧克力平板中，置于35℃、CO2培養(yǎng)箱需氧或厭氧培養(yǎng)24～48 h，取培養(yǎng)出的單個(gè)菌落經(jīng)過(guò)VITEK-MS鑒定得出結(jié)果。VITEK-MS不僅可以鑒定單個(gè)純菌落，而且可以鑒定細(xì)菌的蛋白提取物。本實(shí)驗(yàn)采用差速離心法來(lái)提取細(xì)菌蛋白，因培養(yǎng)瓶中的血細(xì)胞、蛋白、活性炭等均會(huì)影響鑒定結(jié)果，所以筆者采用低速離心去除細(xì)胞和大顆粒，高速離心獲取細(xì)菌沉淀物，經(jīng)過(guò)洗滌和離心后進(jìn)行蛋白提?。ǔＳ眉姿岷鸵译妫?/p>

本實(shí)驗(yàn)收集的培養(yǎng)瓶均在2 h內(nèi)完成檢驗(yàn)，保證細(xì)菌的活性，真菌和≥2種細(xì)菌的感染均不在研究范圍內(nèi)。VITEK-MS直接法正確鑒定率為70.8%（97/137），其中革蘭陰性桿菌的正確鑒定率為88.4%（61/69），革蘭陽(yáng)性球菌的正確鑒定率為52.9%（36/68），表明該方法革蘭陰性桿菌的鑒定結(jié)果優(yōu)于革蘭陽(yáng)性球菌，與國(guó)外研究基本相符[9]。本方法的準(zhǔn)確性為 73.3%（110/150），敏感性為 70.8%（97/137），特異性為100.0%（13/13）。對(duì)于13例用傳統(tǒng)方法培養(yǎng)無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)且VITEK-MS直接法也未檢測(cè)出的原因可能是：①血培養(yǎng)瓶為假陽(yáng)性，所以2種方法均未測(cè)出；②培養(yǎng)瓶中為一些苛養(yǎng)菌、厭氧菌、結(jié)核桿菌、真菌等一些難培養(yǎng)的微生物，常規(guī)方法培養(yǎng)時(shí)間短，未生長(zhǎng)出菌落；③VITEK-MS直接法鑒定無(wú)結(jié)果，可能是數(shù)據(jù)庫(kù)中缺少譜圖；④對(duì)真菌及一些少見(jiàn)菌和難培養(yǎng)菌用菌蛋白檢測(cè)鑒定率低；⑤培養(yǎng)瓶中菌濃度低等原因[10-11]。

針對(duì)用常規(guī)方法檢測(cè)出菌種，而本實(shí)驗(yàn)的21.9%（30/137）鑒定無(wú)結(jié)果和7.3%（10/137）鑒定錯(cuò)誤可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)瓶中碳粒的存在[12]。預(yù)處理提取細(xì)菌蛋白的不同，導(dǎo)致仍有細(xì)胞碎片的存在，干擾圖譜過(guò)多，影響分析[13]；也可能洗滌過(guò)程中的蛋白質(zhì)丟失或蛋白提取不足等原因的存在，導(dǎo)致分析圖譜收集的不足。而實(shí)驗(yàn)中革蘭陽(yáng)性球菌鑒定正確率較低的具體原因還不確切，可能是由于以下幾個(gè)方面[14-15]：①革蘭陽(yáng)性球菌的細(xì)胞壁較厚，抗溶菌作用強(qiáng)，導(dǎo)致提取的蛋白量過(guò)少；②革蘭陽(yáng)性球菌的蛋白結(jié)構(gòu)相似，形成的蛋白圖譜相似，導(dǎo)致VITEK-MS難以鑒別；③污染菌的存在，VITEK-MS是分析細(xì)菌大量的核糖蛋白來(lái)進(jìn)行鑒定的，最適宜的檢測(cè)是細(xì)菌處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，大量活菌存在并大量表達(dá)核糖蛋白，當(dāng)是污染菌造成的培養(yǎng)瓶報(bào)告陽(yáng)性時(shí)，通常其生長(zhǎng)緩慢，需要長(zhǎng)時(shí)間的孵育時(shí)間，這將導(dǎo)致VITEK-MS的錯(cuò)誤鑒定或檢測(cè)不出，如常見(jiàn)污染菌表皮葡萄球菌。無(wú)論是何種原因造成的革蘭陽(yáng)性球菌檢測(cè)率低下，筆者對(duì)革蘭陽(yáng)性球菌的檢測(cè)都要重視并探索解決方法。

本實(shí)驗(yàn)方法的優(yōu)點(diǎn)是較常規(guī)方法檢測(cè)迅速（只需2 h）、操作簡(jiǎn)單、不需要特殊設(shè)備、價(jià)格低廉、準(zhǔn)確性高等?？傊摲椒▽?shí)用性強(qiáng)，可以臨床推廣使用，但仍然不能完全替代傳統(tǒng)的鑒定方法。未來(lái)應(yīng)該進(jìn)一步探索其實(shí)驗(yàn)室的操作標(biāo)準(zhǔn)及對(duì)革蘭陽(yáng)性球菌的鑒定和用VITEK-MS進(jìn)行耐藥性的分析，幫助臨床更快、更準(zhǔn)確地得到結(jié)果。

[1] FEBBRARO F,RODIO D M,PUGGIONI G,et al.MALDI-TOF MS versus VITEK 2:comparison of systems for the identification of microorganisms responsible for bacteremia[J].Curr Microbiol,2016,73(6):843-850.

[2] CROXATTO A,PROD'HOM G.Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology[J].FEMS Microbiology Reviews,2012,36(2):380-407.

[3] 陳飛,胡玢婕,趙虎.MALDI-TOF MS在臨床微生物樣本直接檢測(cè)中的應(yīng)用[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2015,30(7):750-756.

[4] TANNER H,EVANS J T,GOSSAIN S.Evaluation of three sample preparation methods for the direct identification of bacteria in positive blood cultures by MALDI-TOF[J].BMC Research Notes,2017,10(1):48.

[5] 陳峰,李媛睿,皇甫昱嬋,等.分離膠促凝管聯(lián)合MALDI-TOF MS直接檢測(cè)血培養(yǎng)陽(yáng)性細(xì)菌[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2015(2):113-121.

[6] MARCH-ROSSELLó G A,MU?OZ-MORENO M F,GARCíALOYGORRI-JORDáN de URRIéS M C.A differential centrifugation protocol and validation criterion for enhancing mass spectrometry (MALDI-TOF)results in microbial identification using blood culture growth bottles[J].European Journal of Clinical Microbiology Infectious Diseases,2013,32(5):699-704.

[7] MESTAS J,FELSENSTEIN S.Direct identification of bacteria from positive BacT/ALERT blood culture bottles using matrixassisted laser desorption ionization-time-of-flight mass spectrometry[J].Diagnostic Microbiology and Infectious Disease,2014,80(3):193-196.

[8] CROXATTO A,PROD'HOM G.Applications of MALDI-TOF mass spectrometry inclinical diagnostic microbiology[J].FEMS Microbiol Rev,2012,36(2):380-407.

[9] RODRíGUEZ-SáNCHEZ B,SáNCHEZ-CARRILLO C,RUIZ A,et al.Direct identification of pathogens from positive blood cultures using matrix-assisted laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrometry[J].Clinical Microbiology and Infection,2014,20(7):421-427.

[10] IDELEVICH E A,GRüNASTEL B.Rapid detection and identification of candidemia by direct blood culturing on solid medium by use of lysis-centrifugation method combined with matrixassisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS)[J].Journal of Clinical Microbiology,2017,55(1):97-100.

[11] CHIEN J Y,LEE T F,DU S H,et al.Applicability of an inhouse saponin-based extraction method in bruker biotyper matrixassisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry system for identification of bacterial and fungal species in positively flagged blood cultures[J].Frontiers in Microbiology,2016,7:1432.

[12] ROMERO-GóMEZ M P.The effect of the blood culture bottle type in the rate of direct identification from positive cultures by matrix-assisted laser desorption/ionisation time-of-flight(MALDITOF)mass spectrometry[J].The Journal of Infection,2011,62(3):251-253.

[13] THOMIN J,AUBIN G G,FOUBERT F.Assessment of four protocols for rapid bacterial identification from positive blood culture pellets by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry (VitekMS)[J].Journal of Microbiological Methods,2015,115:54-56.

[14] YONETANI S,OHNISHI H,OHKUSU K,et al.Direct identification of microorganisms from positive blood cultures by MALDITOF MS using an in-house saponin method[J].Int J Infect Dis,2016,52:37-42.

[15] RANDAZZO A,SIMON M,GOFFINETP,etal.Optimal turnaround time for direct identification of microorganisms by mass spectrometry in blood culture[J].Journal of Microbiological Methods,2016,130:1-5.

（童穎丹 編輯）

VITEK-MS direct identification of bacteria from positive BacT/ALERT 3D blood culture bottles*

Cong Li,Shou-fu Ding,Ying Huang,Zhong-xin Wang,Ji-lu Shen,Yuan-hong Xu
(Clinical Laboratory,the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University,Hefei,Anhui 230022,China)

R446.5

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.23.003

1005-8982（2017）23-0013-05

2017-02-13

國(guó)家自然科學(xué)基金（No：81171606）

徐元宏，E-mail：xyhong1964@163.com