陳琦 杜玉明 楊德全 楊君 袁聰俐 俞向前 周錦萍*
(1,上海市動物疫病預(yù)防控制中心 201103;2,上海交通大學農(nóng)業(yè)與生物學院 200240;3,上海市浦東新區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心 201200)
上海市犬類巴爾通體感染情況調(diào)查
陳琦1杜玉明2楊德全1楊君2袁聰俐2俞向前3周錦萍1*
(1,上海市動物疫病預(yù)防控制中心 201103;2,上海交通大學農(nóng)業(yè)與生物學院 200240;3,上海市浦東新區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心 201200)
為了解上海市犬類巴爾通體感染情況,根據(jù)已發(fā)表的巴爾通體保守基因序列合成1對PCR引物,對上海市6個區(qū)縣采集149份犬全血樣品進行檢測。25份樣品擴增出特異性條帶,陽性率為16.78%,對陽性樣品進行測序,證實為B.vinsoniiberkhoffii菌株。結(jié)果表明,上海市犬的中存在不同程度的巴爾通體感染情況。
犬;巴爾通體;感染;檢測;上海市
巴爾通體(Bartonella)是由秘魯科學家Alberto Barton在1909年從Oroya熱病人的紅細胞中發(fā)現(xiàn)的一種微生物,并于1913年正式命名為巴爾通體。巴爾通體屬于細菌域(Bacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、 α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)、根瘤菌目(Rhizobiales)、巴爾通體科(Bartonellaceae)、巴爾通體屬(Bartonella)。巴爾通體的宿主范圍比較廣泛,目前已發(fā)現(xiàn)確認的宿主或潛在宿主的有貓、犬、兔、牛和鼠以及野生動物如蝙蝠、美洲獅和狐貍等[1]。昆蟲是大部分巴爾通體菌的傳播媒介,如白蛉、虱、跳騷、蜱和螨蟲等。目前已發(fā)現(xiàn)至少發(fā)現(xiàn)30個種及亞種,其中至少有9種對人有致病性。人類可能通過與攜帶巴爾通體的犬、貓接觸或被跳蚤、虱子叮咬而感染[2]。隨著城市犬、貓的增多,接觸日益密切,了解城市犬中的巴爾通體感染狀況具有一定的獸醫(yī)公共衛(wèi)生意義。
巴爾通體標準菌株Bartonella henselae作為對照(來源于上海交通大學)。
2016年2月到2016年6月,在上海市6個區(qū)縣,包括寶山區(qū)、虹口區(qū)、楊浦區(qū)、普陀區(qū)、浦東新區(qū)和崇明縣,采集家養(yǎng)寵物犬和農(nóng)村犬全血裝于抗凝管中,共采集犬血液樣本149份,置-70℃超低溫冰柜保存。
采用OMEGA公司的BloodDNA kit抽提血液樣本中的DNA,具體步驟按試劑盒說明書進行。
通過查閱相關(guān)文獻,找到巴爾通體基因組的保守基因RpoB,根據(jù)基因序列,利用Premier6.0設(shè)計一對引物RpoB Forwards和RpoB Rewards。 參見表1。
表1 PCR反應(yīng)引物
根據(jù)2×HieffTMPfu Master Mix的說明書配制25μl反應(yīng)體系, 反應(yīng)條件是:95℃,2min; 95℃,10s; 60℃,20s;72℃,30s; 34cycles; 72℃,7min; 12℃保存。
對PCR陽性樣本進行記錄之后,再進行大體系擴增RpoB片段,對片段切膠回收之后,按照TA克隆的說明書構(gòu)建TA克隆,鑒定出克隆陽性樣品送測序,對測序結(jié)果進行BLAST分析,確定巴爾通體種屬,利用軟件MEGA7.0進行了進化關(guān)系的分析,構(gòu)建進化樹。
PCR檢測犬的血液樣本149份,其中感染巴爾通體的陽性樣本25份,總陽性率為16.78%。各區(qū)縣的犬均有不同程度的感染情況,感染陽性率從6.67~23.53%。具體情況見表2。部分樣品電泳圖見圖1。
在犬的血液樣本檢測過程中,我們將2份陽性PCR樣品構(gòu)建TA克隆之后送去上海鉑尚生物公司測序。我們對測序結(jié)果進行分析,利用Clusta W進行序列比對,發(fā)現(xiàn)一株新的菌株,命名為Bartonella SH.CN strain1。利用Blast在線軟件和MEGA7.0構(gòu)建進化樹(圖2)。根據(jù)進化樹結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn)的這株巴爾通體菌與B.vinsoniiberkhoffii的同源性較高,所以Bartonella SH.CN strain1是B.vinsoniiberkhoffii菌株,是上海地區(qū)犬感染的主要的巴爾通體。
表2 巴爾通體感染狀況檢測結(jié)果
圖1 部分樣品的PCR電泳圖
圖2 進化樹圖譜
巴爾通體是一種人畜共患病病原大多數(shù)哺乳動物如犬科、貓科、嚙齒類、反芻類等動物,包括人類都是不同亞種巴爾通體的宿主。巴爾通氏體感染后可以引起菌血癥、淋巴結(jié)炎癥、中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂、關(guān)節(jié)炎等癥狀[3]。對人類有致病性的巴爾通體主要有漢賽巴爾通體(B.henselae)、伊麗莎白巴爾通體(B.elizabethae)、克氏巴爾通體(B.clarridgeiae)、五日熱巴爾通體(B.quintana))等9種,可引起人類戰(zhàn)壕熱、貓抓病 (cat scratch diease,CSD)、卡瑞恩病、心內(nèi)膜炎、菌血癥和桿菌樣血管瘤等疾病[4-5]。
犬類是巴爾通體的自然宿主,已被確認能夠感染包括Bartonella vinsonii berkhoffii,Bartonella henselae,Bartonella clarridgeiae等在內(nèi)的多種巴爾通體亞型。中國山東從犬中分離到B.vinsonii berkhoffi;美國在犬中檢出2.2~8.7%抗體陽性,巴西在犬中檢出1.0~5.9%抗體陽性;研究表明,狗抗體陽性率與虱子感染嚴重程度有關(guān)[6-7]。巴爾通體感染犬導(dǎo)致的疾病主要有心內(nèi)膜炎、心律失常、心肌炎、肉芽腫性淋巴結(jié)炎等[8-9]。文章調(diào)查顯示在心內(nèi)膜炎患者的瓣膜中擴增出文森巴爾通體,證實文森巴爾通體對于人類是有致病性的,也證實犬科動物是文森巴爾通體特異性宿主[9-10]。
本文中各區(qū)縣犬感染巴爾通體的陽性率為6.67~23.53%不等,而從樣品來源上看,普陀區(qū)等3個中心城區(qū)的犬只均為家庭飼養(yǎng)的寵物犬,飼養(yǎng)管理條件較好,而其他3個區(qū)縣的犬只均為散養(yǎng)農(nóng)村犬,飼養(yǎng)管理條件較差,帶有跳蚤等體外寄生蟲的可能性較大,故陽性率明顯高于另3個區(qū)。這提醒我們應(yīng)加強犬只衛(wèi)生條件及體表寄生蟲的去除,從而減少巴爾通體的感染情況。
隨著上海等大城市中寵物犬只的數(shù)量日益增多,寵物與人類的接觸也日漸頻繁,同時流浪犬貓的數(shù)量也在急劇增長,與犬貓相關(guān)人畜共患病發(fā)生的概率也越來越高,相關(guān)疫病也越來越引起人們注意,其城市公共衛(wèi)生安全的意義得以日益凸顯。
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上海市市級農(nóng)口系統(tǒng)青年人才成長計劃 〔滬農(nóng)青字(2015)第2-5號〕。
陳琦(1979-),男,漢族,湖南省攸縣人,碩士,獸醫(yī)師,研究方向:預(yù)防獸醫(yī)學。
*為通訊作者。