黃酒酒曲中產(chǎn)生物胺細菌的分離鑒定

胡翠翠，李秋妍，朱曉娟，李長庚，齊星，張穎，張健，*

（1.工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457；2.食品營養(yǎng)與安全教育部重點實驗室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457）

黃酒酒曲中產(chǎn)生物胺細菌的分離鑒定

胡翠翠1，李秋妍1，朱曉娟1，李長庚1，齊星1，張穎2，張健1，*

（1.工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457；2.食品營養(yǎng)與安全教育部重點實驗室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457）

為探明黃酒酒曲中產(chǎn)生物胺細菌的菌相，深入研究黃酒中的生物胺形成機制，分別以4種黃酒酒曲（麥曲M、麥曲L、小曲Q、紅曲H）為研究對象，采用脫羧酶培養(yǎng)基對產(chǎn)生物胺細菌進行初篩，高效液相色譜法復(fù)篩，并通過16S rDNA基因序列分析，對分離得到的產(chǎn)生物胺細菌進行鑒定。共篩選出42株產(chǎn)生物胺細菌，包括腸桿菌屬（Enterobactersp.）17株，乳桿菌屬（Lactobacillussp.）6株，克雷伯氏菌屬（Klebsiellasp.）5株，沙門氏菌屬（Salmonellasp.）4株，腸球菌屬（Enterococcussp.）3 株，克羅諾菌屬（Cronobactersp.）3株，埃希菌屬（Escherichiasp.）菌株 2 株，檸檬酸桿菌屬（Citrobactersp.）1株，葡萄球菌屬（Staphylococcussp.）1株。分離的產(chǎn)生物胺細菌中多數(shù)可同時產(chǎn)生多種生物胺，其中產(chǎn)腐胺、尸胺、組胺的菌最多，但未分離到色胺和亞精胺產(chǎn)生菌。

黃酒；生物胺；酒曲；細菌；分離；鑒定

Abstract：In order to explore the bacterial phase of biogenic amines（BAs）-producing bacteria in Chinese rice wine Qu，so as to further study the formation mechanism of BAs in Chinese rice wine，potential BAs producers were isolated and screened using a decarboxylase broth from four kinds of rice wine Qu，including wheat Qu（M），wheat Qu（L），Xiao Qu（Q）and Hong Qu（H）.The presence of BAs from bacterial broth was determined by high performance liquid chromatography （HPLC）.BAs producers were identified by comparison of their 16S rDNA gene sequences with those included in the NCBI Databases.Forty-two BAs-producing bacteria were identified，including 17Enterobactersp.strains，6Lactobacillussp.strains，5Klebsiellasp.strains，4Salmonellasp.strains，3Enterococcussp.strains，3Cronobacteriumsp.strains，2Escherichiasp.strains，1Citrobactersp.strain and 1Staphylococcussp.strain.Many BAs-producers could produce more than one BAs，and most of them could produce putrescine，cadaverine and histamine，but none of them could produce tryptamine and spermidine.

Key words：Chinese rice wine；biogenic amines；rice wine Qu；bacteria；isolation；identification

黃酒是世界上最古老的酒類之一，是我國的民族特產(chǎn)。該酒種通常是以谷物為原料，經(jīng)過蒸料，拌以酒曲或酒藥，進行糖化和發(fā)酵釀制而成。其特有的開放式多菌種發(fā)酵造就了黃酒酒體風(fēng)味醇厚、豐滿、完整和馥香的特點，但發(fā)酵過程復(fù)雜且難以控制，極易產(chǎn)生生物胺[1]。相比其它發(fā)酵酒，黃酒中的生物胺含量更高，平均含量高達115 mg/L[2]。適量的生物胺在生物體內(nèi)具有重要的生理作用，但是，當(dāng)人體吸收過量的生物胺時，將產(chǎn)生一系列應(yīng)激反應(yīng)，可能引起頭痛、呼吸紊亂、心悸等不良癥狀，嚴重情況下，可以引起大腦出血，甚至死亡[3]。雖然目前缺乏黃酒中生物胺的限量標準，但共識是應(yīng)努力減少其中生物胺含量，從而降低黃酒攝入風(fēng)險[4]。

生物胺主要是由氨基酸經(jīng)脫羧酶類催化的脫羧反應(yīng)產(chǎn)生的，也有部分是通過醛或酮的胺化和轉(zhuǎn)胺作用形成的[5]。根據(jù)生物胺的合成機制，黃酒中生物胺的合成需要3個條件[6]：存在游離氨基酸，存在能夠產(chǎn)生氨基酸脫羧酶的微生物，具備相應(yīng)微生物生存、產(chǎn)酶、合成生物胺的環(huán)境因素。游離氨基酸主要來源于谷物原料，而產(chǎn)生氨基酸脫羧酶的微生物主要源于酒曲、原料和環(huán)境。其中酒曲尤為重要，不同的制曲原料和工藝造就了酒曲中特有的微生物種群結(jié)構(gòu)，這在很大程度上決定了黃酒的風(fēng)味和口感，以及其中的生物胺種類和含量。對黃酒酒曲中的生物胺產(chǎn)生菌進行分離鑒定，是深入研究黃酒中生物胺形成機制的必要前期基礎(chǔ)，有助于理解不同酒曲釀造黃酒中生物胺含量的差異。

產(chǎn)生物胺細菌的分離通常有3類方法：微生物學(xué)、化學(xué)和分子生物學(xué)方法。微生物學(xué)方法[7]是根據(jù)產(chǎn)生物胺菌株的生理特征及其生長過程中的生化變化，采用特異性選擇培養(yǎng)基來進行篩選、鑒別，此方法誤差大，只適合于初篩；化學(xué)法，即利用各種測定生物胺的化學(xué)手段測定菌株培養(yǎng)液中生物胺的含量?；瘜W(xué)法不僅可以定性判定產(chǎn)生物胺的菌株，而且還可以定量評價其生物胺的產(chǎn)生能力。分子生物學(xué)方法，根據(jù)目前已知的氨基酸脫羧酶的氨基酸保守序列設(shè)計特異性引物，通過PCR擴增來鑒別。

產(chǎn)生物胺細菌的鑒定，主要有表型特征和基因型鑒定兩種方法。前者是基于菌株形態(tài)學(xué)及生理生化特征的鑒定；后者是針對菌株16S rDNA序列同源性比對。很多情況下不同菌株的形態(tài)或生理生化差異極不顯著，而且形態(tài)特征有時還會受環(huán)境因素的影響，因此基于表型特征的鑒定常不準確。目前的主流方法是表型特征結(jié)合基因型的多相鑒定方法，通過該方法可將菌株鑒定到種。

目前，國內(nèi)外尚未見分離鑒定黃酒酒曲中生物胺產(chǎn)生菌的報道，但已有從浸米水中分離鑒定生物胺產(chǎn)生菌的報道[8]。本研究將以4種黃酒酒曲（麥曲M、麥曲L、小曲Q、紅曲H）為研究對象，采用脫羧酶培養(yǎng)基初篩、高效液相色譜復(fù)篩的方法來分離其中的產(chǎn)生物胺細菌，并通過16S rDNA序列同源性比對來初步鑒定這些菌株，旨在探明黃酒酒曲中產(chǎn)生物胺細菌的菌相，為后續(xù)黃酒中生物胺的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 酒曲

麥曲M、麥曲L、小曲Q、紅曲H：為不同黃酒生產(chǎn)企業(yè)提供。

1.1.2 主要試劑

尸胺（色譜純）：美國Sigma公司；色胺、苯乙胺、腐胺、組胺、酪胺、亞精胺（色譜純）：美國Genview公司；乙腈（色譜純）：上海安譜實驗科技股份有限公司；丹磺酰氯、L-組氨酸鹽酸鹽、色氨酸、酪氨酸（分析純）：北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；MRS瓊脂培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基：北京奧博生物科技有限責(zé)任公司；鳥氨酸鹽酸鹽（分析純）：上海源葉生物科技有限公司；賴氨酸、溴甲酚紫、磷酸吡哆醛、硫胺素（分析純）：美國Genview公司；DNA marker：北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；2×Taq PCR Master Mix：博邁德生物科技有限責(zé)任公司；PCR引物：北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 儀器與設(shè)備

Sorvall Legend Micro 17/17R冷凍離心機、ProFlex 3 x 32 well PCR system三頭PCR儀：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；LC-20AT高效液相色譜儀：日本島津公司；海能HN200多功能氮吹儀：北京博雅創(chuàng)新科技發(fā)展有限公司；瓊脂糖水平板電泳儀：北京六一公司。

1.2 培養(yǎng)基配方

LB液體培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10.0，酵母粉5.0，氯化鈉10.0，pH 7.0，121℃高壓蒸汽滅菌15 min。

液體脫羧酶培養(yǎng)基（g/L）[9]：在參考文獻[9]的基礎(chǔ)上加以改良，具體為胰蛋白胨5.0，酵母粉5.0，牛肉膏5.0，葡萄糖 0.5，氯化鈉 2.5，Tween-80 1 mL，檸檬酸銨2.0，K2HPO42.0，MnSO40.2，MgSO40.2，F(xiàn)eSO40.04，Ca－CO30.1，硫胺素0.01，磷酸吡哆醛0.05，溴甲酚紫0.06，賴氨酸5.0，鳥氨酸鹽酸鹽5.0，L-組氨酸鹽酸鹽2.0，色氨酸 2.0，酪氨酸 1.0，放線菌酮 0.05，pH 5.3，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

固體脫羧酶培養(yǎng)基（g/L）：瓊脂粉18.0，其它成分同液體脫羧酶培養(yǎng)基，pH 5.3，121℃高壓蒸汽滅菌15 min。

1.3 生物胺產(chǎn)生菌的分離

1.3.1 富集培養(yǎng)

取黃酒曲M、L、Q、H各1 g，分別接種于滅菌的100 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)4 h。

1.3.2 初篩

將富集培養(yǎng)后的菌液用無菌生理鹽水進行稀釋，取各個梯度的稀釋液100 μL于固體脫羧酶培養(yǎng)基上進行涂布，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d。挑取紫色陽性菌落并編號，接種于固體MRS試管，于37℃培養(yǎng)16 h后置于4℃冰箱保存。

1.4 高效液相色譜復(fù)篩

將初篩菌株接種于液體脫羧酶培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)4 d。對其發(fā)酵液進行HPLC檢測。

1.4.1 標準溶液的制備

準確稱取生物胺各50 mg，用丙酮配制成1 mg/mL的儲備液備用。分別取以上標準品儲備液1 mL，用丙酮配制成終濃度分別為 1.0、2.5、5.0、10、15、25、50 mg/L的混合標準溶液，鋁箔包住，4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 標準溶液的前處理

取1 mL各梯度的標準溶液于10 mL離心管中，加入1 mL丹磺酰氯溶液、1 mL飽和NaHCO3溶液，渦旋混勻，60℃水浴30 min，每隔10 min開蓋放氣搖勻。待溶液溫度降至室溫后，加入100 μL氨水，混勻，60℃水浴15 min，取出冷卻至室溫。向其中加入3 mL乙醚進行萃取，待渦旋混勻后靜置1 h，吸取上層有機層于新的離心管中，向下層溶液中重新加入3 mL乙醚，重復(fù)萃取2次。對所收集的上層液進行60℃氮吹，待吹干后，向離心管中加入1 mL乙腈，晃動使乙腈充分接觸離心管壁，用0.22 μm的有機膜過濾[10]。

1.4.3 樣品的前處理

把培養(yǎng)4 d的液體脫羧酶培養(yǎng)液進行12 000 r/min離心10 min，取1 mL上清液加入10 mL離心管中，再加入1 mL丹磺酰氯溶液、1 mL飽和NaHCO3溶液，進行衍生。衍生、萃取步驟同標準溶液。

1.4.4 色譜分析

色譜條件：GEMINI C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，美國 phenomenex公司），檢測波長 254 nm，進樣量20 μL，柱溫30℃，流速1 mL/min。流動相A為超純水，流動相B為乙腈，梯度洗脫程序為：0～1 min，B=65%（體積分數(shù)）；1 min～10 min，B=80%（體積分數(shù)）；10 min～15 min，B=90%（體積分數(shù)）；15 min～25 min，B=90%（體積分數(shù)）；25 min～30 min，B=65%（體積分數(shù)）。外標法定量。

1.5 產(chǎn)生物胺細菌的16S rDNA鑒定

上 游 引 物 為 27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物為 1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′[11]。反應(yīng)體系為 25 μL 包含：12.5 μL 2×Taq PCR Master Mix，0.5 μL（10 μM） 上游/下游引物，11.5 μL ddH2O，用無菌的槍頭輕輕蘸取單菌落后在體系中輕輕攪拌幾下。反應(yīng)條件為：95℃，5 min，一個循環(huán)；94 ℃、45 s，55 ℃、45 s，72 ℃、90 s，35 個循環(huán)；72 ℃，10 min，一個循環(huán)。PCR產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳驗證成功后送樣測序，把測序結(jié)果在NCBI上進行相似性比對，確定該菌株的種屬。

2 結(jié)果與分析

2.1 固體脫羧酶培養(yǎng)基初篩

典型的脫羧酶平板篩選結(jié)果如圖1所示。

圖1 典型的脫羧酶平板分離結(jié)果Fig.1 Representative isolation result in decarboxylase plate

通過初篩共得到42株疑似產(chǎn)生物胺細菌，其中由M中得到9株菌，編號為M1-M9；由L中得到10株菌，編號為L1-L10；由Q中得到6株菌，編號為Q1-Q6；由H中得到17株菌，編號為H1-H17。

2.2 HPLC檢測復(fù)篩

為了確認陽性菌株，采用HPLC法檢測42株菌發(fā)酵液中的生物胺含量，結(jié)果如表1所示。

表1 分離菌株發(fā)酵液中生物胺的含量Table 1 BAs content in decarboxylase broth mg/L

續(xù)表1 分離菌株發(fā)酵液中生物胺的含量Continue table 1 BAs content in decarboxylase brothmg/L

初篩的42株菌均能產(chǎn)生生物胺，但均不產(chǎn)生色胺和亞精胺。產(chǎn)腐胺、尸胺和組胺的細菌最為常見，且很多菌株可以同時產(chǎn)生多種生物胺，僅有少量的菌株產(chǎn)苯乙胺和酪胺。具體來說，從麥曲M中篩出來的菌M1-M9都產(chǎn)腐胺和尸胺，其中有個別幾株還產(chǎn)組胺。而從L中篩出的菌株L1-L10所產(chǎn)的生物胺種類和含量差距較大，其中有3株L5，L6，L8最為特殊，只產(chǎn)苯乙胺和酪胺，并不產(chǎn)腐胺，尸胺和組胺，L1，L2，L3，L7，L10都產(chǎn)大量的腐胺，而產(chǎn)尸胺和組胺的量相對較少，L4和L9則會產(chǎn)生大量的尸胺。從紅曲H中所篩得的17株菌H1-H17，主要產(chǎn)腐胺和尸胺，個別菌株會產(chǎn)生相對較少量的組胺，其中 H1，H2，H4，H5，H7，H8，H9，H10，H11，H13，H14，H15，H17 會產(chǎn)大量的腐胺，其余菌株則產(chǎn)大量尸胺。從小曲Q中共篩得6株菌，這6株菌產(chǎn)生物胺量較低，且除了Q1會產(chǎn)少量酪胺，其它均只產(chǎn)少量的苯乙胺。

2.3 菌株鑒定結(jié)果

將測得的16S rDNA基因序列通過網(wǎng)絡(luò)與NCBI數(shù)據(jù)庫序列進行同源性分析，結(jié)果如表2所示。

表2 產(chǎn)生物胺細菌的鑒定結(jié)果Table 2 Identification of the BAs-producers

42株產(chǎn)生物胺細菌，包括腸桿菌屬（Enterobactersp.）17 株，乳桿菌屬（Lactobacillussp.）6 株，克雷伯氏菌屬（Klebsiellasp.）5 株，沙門氏菌屬（Salmonellasp.）4株，腸球菌屬（Enterococcussp.）3株，克羅諾菌屬（Cronobactersp.）3 株，埃希菌屬（Escherichiasp.）菌株2株，檸檬酸桿菌屬（Citrobactersp.）1株，葡萄球菌屬（Staphylococcussp.）1株，腸桿菌屬為黃酒酒曲中主要的產(chǎn)生物胺細菌。4種曲中，小曲釀酒相對安全性更高，其中的產(chǎn)生物胺細菌均為乳桿菌屬，且產(chǎn)生生物胺含量很少。這可能與小曲相對精細的制作環(huán)境有關(guān)。麥曲和紅曲中的產(chǎn)生物胺細菌種類很多，這說明麥曲和紅曲在制作和儲存中可能受到了更多的污染，而且其中有些菌屬（如：克雷伯氏菌屬和沙門氏菌屬）中的很多菌種都有致病的可能，這對黃酒的產(chǎn)品安全性構(gòu)成了嚴重的威脅。

鑒于菌株較多，本研究只采用針對16S rDNA基因序列的分子鑒定方法，但由于16S rDNA序列的長度有限，通常認為該方法鑒定到屬比較可靠，而只有部分能鑒定到種的水平?？梢越Y(jié)合其它的生理生化實驗，或微生物鑒定系統(tǒng)來進一步鑒定菌株。

3 結(jié)論

黃酒酒曲中產(chǎn)生物胺細菌的種類很多，此次發(fā)現(xiàn)的有腸桿菌屬，乳桿菌屬，克雷伯氏菌屬，沙門氏菌屬，腸球菌屬，克羅諾菌屬，埃希菌屬，檸檬酸桿菌屬和葡萄球菌屬。腸桿菌屬是酒曲中主要的產(chǎn)生物胺細菌，個別菌屬菌種對人有潛在的致病性。在本試驗條件下，很多產(chǎn)生物胺細菌可產(chǎn)生多種生物胺，但未分離到色胺和亞精胺產(chǎn)生菌。試驗結(jié)果反映出小曲的制作和儲藏過程中，環(huán)境的衛(wèi)生條件較好，細菌污染較少。小曲釀酒相對安全性更高，原因有二，一是乳桿菌屬細菌是公認的安全菌株，二是在本試驗的發(fā)酵條件下，這些乳桿菌產(chǎn)生的生物胺含量較低。

黃酒釀造時生物胺含量受原料、工藝、環(huán)境條件和多菌種互作等因素的影響，本試驗的結(jié)果并不能反映黃酒中的生物胺含量。但酒曲是黃酒之魂，本研究為探究不同黃酒中生物胺的差異，對建立酒曲和成品酒中生物胺的聯(lián)系提供了理論參考。

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Isolation and Identification of Biogenic Amine-Producing Bacteria in Chinese Rice Wine Qu

HU Cui-cui1，LI Qiu-yan1，ZHU Xiao-juan1，LI Chang-geng1，QI Xing1，ZHANG Ying2，ZHANG Jian1，*
（1.Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science&Technology，Tianjin 300457，China；2.Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education，College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science&Technology，Tianjin 300457，China）

2017-01-18

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.19.037

國家自然科學(xué)基金資助項目（31471725）；天津科技大學(xué)大學(xué)生實驗室創(chuàng)新基金資助項目（1614A216）

胡翠翠（1990—），女（漢），碩士研究生，主要從事發(fā)酵食品安全方面的研究。

*通信作者：張?。?978—），男（漢），副研究員，博士，主要從事發(fā)酵食品安全方面的研究。