Slug與KISS-1在肝細(xì)胞癌的表達(dá)與意義

趙延兵，秦 雯，張 偉，牛馨苗，付俊敏，李世朋

Slug與KISS-1在肝細(xì)胞癌的表達(dá)與意義

趙延兵1，秦 雯1，張 偉1，牛馨苗1，付俊敏2，李世朋1

目的 探討Slug與KISS-1在肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)與意義。方法 采用qRT-PCR與免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肝細(xì)胞癌組織和正常肝臟組織中Slug與KISS-1的mRNA及蛋白水平的表達(dá)。結(jié)果 肝細(xì)胞癌組織中Slug mRNA表達(dá)明顯高于正常肝臟組織，而肝細(xì)胞癌組織中KISS-1 mRNA表達(dá)明顯低于正常肝臟組織（均P＜0.05）；肝細(xì)胞癌組織中Slug蛋白陽(yáng)性率高于正常組織，而KISS-1蛋白陽(yáng)性率低于正常組織（均P＜0.05）；且兩者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r＝-0.877，P＜0.05）。結(jié)論 Slug與KISS-1在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，二者在肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中可能存在拮抗作用。

Slug；KISS-1；肝細(xì)胞癌；mRNA；

Abstract：Objective To investigate the expression and its significance of Slug and KISS-1 in hepatocellular carcinomas. Methods qRT-PCR and immunohistochemistry were used to detect the mRNA and protein expression of Slug and KISS-1 in the cancer tissues from hepatocellular carcinomas and normal tissues. Results The expression of Slug mRNA in hepatocellular carcinoma was higher than that in normal liver tissues.However，the expression of KISS-1 mRNA in hepatocellular carcinoma was lower than that in normal liver tissues（all P＜0.05）.The positive rate of Slug protein was significantly higher in the cancer tissues than that in normal tissues，but the positive rate of KISS-1 protein was significantly lower in cancer tissues than that in normal tissues（all P＜0.05）.There was a negative correlation between the two expressions（r＝-0.877，P＜0.05）. Conclusion The expression of Slug was negative correlation to KISS-1 in hepatocellular carcinomas，and they might play antagonistic action in the process of development and metastasis of hepatocellular carcinomas.

Key words：Slug；KISS-1；hepatocellular carcinoma；mRNA

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，因其惡性程度高、侵襲力強(qiáng)而易發(fā)生轉(zhuǎn)移，肝癌患者預(yù)后較差［1］。近些年來(lái)，發(fā)現(xiàn)核因子Slug在骨肉瘤發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)生作用［2］。而KISS-1基因是在人類(lèi)黑色素細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，其異常表達(dá)與結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展存在著密切的關(guān)系［3］。本文通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)Slug、KISS-1在肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)，分析兩者的相關(guān)性，為肝細(xì)胞癌浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的研究提供理論依據(jù)，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本 本研究標(biāo)本收集于焦作市人民醫(yī)院2004年9月至2014年12月接受肝癌切除手術(shù)治療的30例患者。其中新鮮凍存的肝癌組織12例與存檔的石蠟標(biāo)本30例。另取20例正常肝臟組織標(biāo)本（新鮮凍存的組織標(biāo)本9例與存檔石蠟標(biāo)本20例），所有病例均由兩位病理醫(yī)師診斷，病理類(lèi)型均為肝細(xì)胞癌，所有病例均有完整臨床病歷資料。

1.2 主要試劑與儀器 總RNA提取試劑盒（Sigma-Aldrich公司，美國(guó)），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司，日本），引物（Slug，F(xiàn)：GGCACTTAGACCACCTTA，R：AAATCCCTCATAATAGACAC；KISS-1，F(xiàn)：ACCTGCCGAACTACAACTGG，R：TCCCTTAGCCCTACGTCCC；β-actin，F(xiàn)：CATGTACGTTGCTATCCAGGC，R：CTCCTTAATGTCACGCACGAT）購(gòu)于上海生工公司，熒光定量試劑盒（Roche公司，瑞士），兔源一抗 Slug（CST公司，美國(guó)）和KISS-1（CST公司，美國(guó)），二步法免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。主要儀器：iQ5熒光定量 PCR檢測(cè)系統(tǒng)（Bio-Rad，美國(guó)），LabWorksTM凝膠成像及分析系統(tǒng)（UVP，美國(guó)），F(xiàn)-4500型熒光檢測(cè)儀（HITACHI，日本），UV-2000型可見(jiàn)／紫外分光光度計(jì)（UNICO，美國(guó)）。

1.3 QRT-PCR檢測(cè) Slug與 KISS-1 mRNA表達(dá)肝臟組織總RNA提取參照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，然后逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA作為模板，qRT-PCR反應(yīng)條件：56℃，10 s；95℃，5 min；95℃；20 s；循環(huán) 35次，60℃，1 min，50μL反應(yīng)體系。目的基因量 ＝2-△△CT，2-△△CT表示的是實(shí)驗(yàn)組目的基因表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組變化的倍數(shù)。△△CT ＝實(shí)驗(yàn)（CT目的基因-CTβactin）-對(duì)照（CT目的基因-CTβ-actin）。

1.4 免疫組化檢測(cè) Slug與 KISS-1表達(dá)與分布將肝臟石蠟標(biāo)本作連續(xù)切片，63℃烤片，然后脫蠟、水化、3%H2O2孵育 22 min；微波爐抗原修復(fù) 12 min，然后自然緩慢冷卻至室溫。然后按照免疫組化試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色，一抗（Slug與 KISS-1）4℃濕盒中孵育過(guò)夜。然后滴加含有二抗的工作液，最后DAB試劑盒顯色，然后復(fù)染、脫水、透明、封片與鏡檢拍照。采用半定量積分法依據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分率判斷染色結(jié)果［3］。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。獨(dú)立樣本的比較采用t檢驗(yàn)，構(gòu)成比的比較采用 χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用 Spearman相關(guān)檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 qRT-PCR結(jié)果 肝細(xì)胞癌組織中Slug mRNA表達(dá)水平（19.75±2.45）明顯高于正常肝臟組織（6.15±1.65），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.5）；而肝細(xì)胞癌組織中 KISS-1 mRNA表達(dá)水平（13.75±3.79）明顯低于正常肝臟組織（1.95±0.35），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 免疫組化結(jié)果 Slug蛋白染色主要定位于肝癌細(xì)胞核內(nèi)，KISS-1蛋白染色主要存在于肝癌細(xì)胞漿內(nèi)，見(jiàn)圖1。Slug在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)明顯高于正常肝臟組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝12.167，P＜0.001），見(jiàn)表1。KISS-1蛋白在肝細(xì)胞癌組織中的陽(yáng)性率顯著低于正常肝組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝25.301，P＜0.001），見(jiàn)表 2。采用配對(duì)資料的檢驗(yàn)；表明兩種蛋白在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)存在負(fù)相關(guān)（rs＝-0.877，P＜0.001），見(jiàn)表 3。

圖1 Slug和KISS-1蛋白在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)

表1 Slug在不同肝臟組織中的表達(dá) 例

表2 KISS-1在不同肝臟組織中的表達(dá) 例

表3 Slug與KISS-1在肝癌組織表達(dá)的相關(guān)性 例

3 討論

癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移是影響肝細(xì)胞癌預(yù)后的重要因素之一，遺傳表觀學(xué)與分子生物學(xué)研究表明腫瘤細(xì)胞一些基因活性的改變及其表達(dá)產(chǎn)物在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移和預(yù)后等一系列病理生理過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用［4-5］。研究發(fā)現(xiàn)Slug的異常激活可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、侵襲能力，同時(shí)抑制細(xì)胞凋亡［6］。Snail、Slug和KAI1蛋白的表達(dá)水平在宮頸鱗狀細(xì)胞癌（cervix squamous cell carcinoma，CSCC）組織中與腫瘤組織的分化程度、國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，IFGO）分期、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否及預(yù)后等均有關(guān)，在 CSCC組織中早期聯(lián)合檢測(cè) Snail、Slug和 KAI1對(duì)判斷預(yù)后有價(jià)值［7］。RT-PCR半定量結(jié)果顯示 HIF-1α、MT、Slug和E-鈣黏附蛋白在乳腺癌中的表達(dá)可作為監(jiān)測(cè)乳腺癌發(fā)展的指標(biāo)［8］。本研究在肝細(xì)胞癌組織中 Slug mRNA表達(dá)明顯高于正常肝臟組織，同時(shí)，肝細(xì)胞癌組織中的Slug蛋白水平明顯高于肝臟正常組織。結(jié)果提示，Slug的異常表達(dá)在促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖，促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、侵襲過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用。

KISS-1基因是一種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，能明顯抑制腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，并有限制腫瘤細(xì)胞侵襲與遷移的能力。過(guò)表達(dá)的KISS-1可明顯抑制大腸癌細(xì)胞的侵襲能力，并通過(guò) PI3K／AKT NF-κB通路降低基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloprotein 9，MMP-9）的表達(dá)［9］。將過(guò)表達(dá) KISS-1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至SW480結(jié)腸癌細(xì)胞，過(guò)表達(dá)KISS-1組細(xì)胞增殖率明顯低于對(duì)照組，且高表達(dá)KISS-1組細(xì)胞劃痕損傷愈合的速度明顯下降。因此，高表達(dá)KISS-1可抑制結(jié)腸癌 SW480細(xì)胞的增殖，降低細(xì)胞遷移速度［10］。KISS-1基因甲基化狀態(tài)有望成為評(píng)估結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的重要指標(biāo)［11］。而且，KISS-1對(duì)宮頸癌的浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移有抑制作用，聯(lián)合檢測(cè)KISS-1和MMP-2的表達(dá)有望成為判定宮頸癌浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移能力的重要指標(biāo)之一［12］。在肝癌組織中，KISS-1和MMP-9的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性，KISS-1和MMP-9的表達(dá)失衡與肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)，KISS-1的缺失表達(dá)可作為預(yù)測(cè)HCC轉(zhuǎn)移潛能的參考指標(biāo)［13］。

本研究中肝細(xì)胞癌組織中KISS-1 mRNA及蛋白水平較正常肝臟組織均降低。同時(shí)，本研究表明Slug與KISS-1在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r＝-0.877，P＜0.001）。因此推測(cè) Slug和 KISS-1在肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中可能存在拮抗作用。

［1］ 湯釗猷.肝癌診治現(xiàn)狀與前景［J］.中國(guó)普外基礎(chǔ)與臨床雜志，2003，10（3）：191.

［2］ 伍鋒，尹科，龍秋平，等.骨肉瘤組織中 Slug和 E鈣粘蛋白的表達(dá)意義［J］.中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2014，24（13）：28-32.

［3］ 蔡陽(yáng)陽(yáng)，何濤，張新，等.Smo和 Gli1蛋白在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及其臨床意義［J］.河南科技大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2016，34（4）：247-251.

［4］ Fan X，Ma X，Cui L，et al.CARF activates beta-catenin／TCF signaling in the hepatocellular carcinoma［J］.Oncotarget，2016，7（49）：80404-80414.

［5］ Yada M，Miyazaki M，Motomura K，et al.The prognostic role of lactate dehydrogenase serum levels in patients with hepatocellular carcinoma who are treated with sorafenib：the influence of liver fibrosis［J］.J Gastrointest Oncol，2016，7（4）：615-623.

［6］ Jue C，Zhifeng W，Zhisheng Z，et al.Vasculogenic mimicry in hepatocellular carcinoma contributes to portal vein invasion［J］.Oncotarget，2016，7（47）：77987-77997.

［7］ 龔曉萌，陶儀聲，周蕾，等.宮頸癌中 Snail、Slug和 KAI1的表達(dá)及臨床意義［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，35（12）：1733-1738.

［8］ 龍方懿，印國(guó)兵，劉智敏，等.HIF-1α、MT、Slug和 E-cadherin在人乳腺癌中的表達(dá)及其意義［J］.中國(guó)免疫學(xué)雜志，2012，28（6）：502-506.

［9］ Chen S，Chen W，Zhang X，et al.Overexpression of KISS-1 reduces colorectal cancer cell invasion by downregulating MMP-9 via blocking PI3K／Akt／NF-kappaB signal pathway［J］.Int J Oncol，2016，48（4）：1391-1398.

［10］鐘華，劉迪群，吳雪艷.高表達(dá) KISS-1對(duì)結(jié)腸癌 SW480細(xì)胞增殖和遷移的影響［J］.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，49（12）：1697-1700.

［11］陳志華，林素勇，陳紹勤，等.結(jié)直腸癌組織中 KISS-1基因啟動(dòng)子甲基化對(duì)其表達(dá)水平的影響及其臨床意義［J］.吉林大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2014，40（5）：1074-1079.

［12］張小平，李明玉.KISS-1蛋白和 MMP-2在宮頸癌中的表達(dá)及臨床意義［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2013，17（3）：507-510.

［13］ 臧盛兵，劉景豐，王斌，等.KISS-1、KISS-1R及 MMP-9表達(dá)與肝細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系及意義［J］.中華肝膽外科雜志，2011，17（3）：223-227.

Expression and Its Significance of Slug and KISS-1 in Hepatocellular Carcinomas

ZHAO Yan-bing1，QIN Wen1，ZHANG Wei1，NIU Xin-miao1，F(xiàn)U Jun-min2，LI Shi-peng1
（1.Second Department of General Surgery，Jiaozuo People′s Hospital，Jiaozuo 454002，China；2.Key Laboratory of Pharmacology and Medical Molecular Biology，Medical College，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471003，China）

R735.7

A

1672-688X（2017）03-0166-03

10.15926／j.cnki.issn1672-688x.2017.03.002

河南省教育廳自然科學(xué)研究項(xiàng)目（2007310002）

2017-01-14

1.焦作市人民醫(yī)院普外二區(qū)，河南焦作454002 2.河南科技大學(xué)藥理學(xué)與醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南洛陽(yáng)471003

趙延兵（1975—），男，河南溫縣人，副主任醫(yī)師，從事普外疾病的診治與研究工作。