超聲處理大豆分離蛋白-殼聚糖復(fù)合物結(jié)構(gòu)性質(zhì)研究

丁 儉 齊寶坤 姜 楠 隋曉楠 王中江 李 楊

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院， 哈爾濱 150030)

超聲處理大豆分離蛋白-殼聚糖復(fù)合物結(jié)構(gòu)性質(zhì)研究

丁 儉 齊寶坤 姜 楠 隋曉楠 王中江 李 楊

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院， 哈爾濱 150030)

為研究超聲處理大豆分離蛋白與殼聚糖相互作用及其對(duì)復(fù)合物結(jié)構(gòu)性質(zhì)的影響，利用紫外-可見(jiàn)吸收光譜和熒光光譜研究超聲處理大豆分離蛋白與殼聚糖的相互作用，通過(guò)SDS-PAGE電泳(十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳)、復(fù)合物動(dòng)態(tài)光散射粒度分析、表面電荷和濁度等測(cè)定，解析了超聲處理對(duì)大豆分離蛋白-殼聚糖復(fù)合物結(jié)構(gòu)變化與功能性質(zhì)之間的關(guān)系。結(jié)果表明，隨著超聲功率的增加，復(fù)合物的紫外-可見(jiàn)吸收光譜的最大吸收峰逐漸升高且發(fā)生紅移；熒光強(qiáng)度先降低后增加，超聲600 W處理時(shí)內(nèi)源熒光強(qiáng)度最大；超聲處理影響了大豆分離蛋白亞基組成，主要促進(jìn)了7S亞基與殼聚糖的相互作用；復(fù)合物的粒徑先降低后增大；300～500 W處理的復(fù)合物ζ-電位表面電荷密度較大，濁度明顯降低且溶液分散均勻、性質(zhì)穩(wěn)定。說(shuō)明相對(duì)低功率時(shí)復(fù)合物形成得較為穩(wěn)定，但超聲處理進(jìn)一步增大后，蛋白質(zhì)發(fā)生不溶性聚集和重排，影響了大豆分離蛋白與殼聚糖之間的相互作用，不同復(fù)合物中蛋白質(zhì)與殼聚糖的相互作用影響了氨基酸殘基的微環(huán)境、蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)和分子柔性，進(jìn)而影響復(fù)合物結(jié)構(gòu)和功能特性。

大豆分離蛋白； 殼聚糖； 復(fù)合物； 相互作用； 超聲處理

引言

大豆分離蛋白作為天然大分子，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和功能特性，在食品工業(yè)中廣泛應(yīng)用[1]。但是，由于天然大豆分離蛋白分子結(jié)構(gòu)是一種球狀模型，分子之間的相互作用可能僅是一些球形亞基之間的摩擦力，其分子結(jié)構(gòu)的柔韌性較差，很難滿足作為功能性乳化劑和具有較好凝膠特性的加工要求。因此，對(duì)大豆分離蛋白進(jìn)行改性和功能特性修飾尤為重要[2]。目前，許多研究利用物理方法(如加熱、超聲、微波和超高壓等技術(shù))改變蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和分子排布，進(jìn)而改善蛋白質(zhì)的功能特性[3-5]。近年來(lái)，伴隨著超聲技術(shù)在食品工業(yè)中的廣泛應(yīng)用，利用超聲處理過(guò)程中產(chǎn)生的動(dòng)態(tài)剪切、空化等作用，可以改變大豆蛋白的柔性空間結(jié)構(gòu)，促進(jìn)蛋白質(zhì)與其他功能性物質(zhì)及小分子物質(zhì)的結(jié)合[6-8]。

殼聚糖是天然生物材料中少有的堿性多糖，具有長(zhǎng)鏈糖分子特性，其分子鏈上的游離氨基可以在較溫和的條件下發(fā)生化學(xué)反應(yīng)[9]。殼聚糖溶于酸后，糖鏈上的氨基發(fā)生質(zhì)子化，可形成強(qiáng)大的正電荷陽(yáng)離子基團(tuán)，具有良好的生物相容性、可降解性和無(wú)毒等特性，現(xiàn)已應(yīng)用在多種領(lǐng)域[10-11]。

近年來(lái)，對(duì)于蛋白和多糖的相互作用已有較多的研究，多糖作為一種天然的生物大分子，與蛋白質(zhì)的相互作用對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能、界面性質(zhì)和乳化性質(zhì)等都有較大影響[11]。其相互作用可形成可溶性復(fù)合物、不可溶性復(fù)合物、凝聚物、靜電凝膠等作用模式[12]。蛋白-多糖復(fù)合物的結(jié)構(gòu)類(lèi)型主要通過(guò)蛋白與多糖的綁定親和力，分子構(gòu)型、鏈的長(zhǎng)度、鏈的柔韌性和分子量及環(huán)境的pH值、離子強(qiáng)度、溫度等因素決定蛋白與多糖的電荷密度[13-17]；蛋白質(zhì)和多糖相互作用主要驅(qū)動(dòng)力是靜電相互作用和部分氫鍵，兩者之間的排斥和吸引就會(huì)形成生物大分子的可溶物、不相溶物和絡(luò)合等狀態(tài)[18]。LE等[19]研究發(fā)現(xiàn)蛋白和多糖可以通過(guò)靜電作用形成復(fù)合物，其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性由靜電相互作用所決定。ELMER等[20]研究表明在很多情況下，其復(fù)合物的形成不僅依賴(lài)于電荷密度和相互作用分子的柔韌性，其外部環(huán)境和離子強(qiáng)度也會(huì)對(duì)其有所影響。同時(shí)，多糖類(lèi)物質(zhì)的加入也會(huì)改善蛋白質(zhì)的相關(guān)性質(zhì)，ZHANG等[21-22]研究表明復(fù)合物的相互作用可以提升蛋白的熱穩(wěn)定性。同時(shí)，蛋白的部分展開(kāi)與多糖結(jié)合的特殊位點(diǎn)都會(huì)影響復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，多糖的加入會(huì)抑制其蛋白的聚集現(xiàn)象[23]。

蛋白和多糖都作為聚電解質(zhì)，兩者之間不同的相互作用，會(huì)形成不同的功能特性，構(gòu)建不同的食品體系，這種生物大分子可溶性復(fù)合物常被用作包埋載體，具有特殊的生物活性。但關(guān)于超聲處理大豆蛋白-殼聚糖相互作用及復(fù)合物結(jié)構(gòu)性質(zhì)的影響研究目前仍然有限，而且大多研究集中在蛋白與陰離子多糖的相互作用。因此，本文利用超聲處理作用控制大豆蛋白與殼聚糖所形成的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，構(gòu)建蛋白質(zhì)與多糖的相互作用體系，解析超聲處理對(duì)大豆蛋白與殼聚糖交互作用的影響。以不同超聲處理的復(fù)合物為研究對(duì)象，采用凝膠電泳分析超聲處理蛋白的分子量，并對(duì)復(fù)合物的粒徑、電位和濁度進(jìn)行研究，運(yùn)用紫外-可見(jiàn)吸收光譜和熒光光譜法，研究超聲處理大豆蛋白與殼聚糖之間的相互作用。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

大豆分離蛋白，實(shí)驗(yàn)室自制；食品級(jí)殼聚糖(平均分子量150～500 kDa，脫乙酰度90%以上，含水率8.0%)，鄭州優(yōu)然食品配料有限公司；氫氧化鈉，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；鹽酸，北京新光化工試劑廠；乙酸磷酸二氫鈉，天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠；磷酸氫二鈉，天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器設(shè)備

超聲波細(xì)胞破碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；AL204型分析天平，梅勒特-托利多儀器(上海)有限公司；Labconco FreeZone 6 L型落地式凍干機(jī)，上海匯分電子科技有限公司；pHSJ-4A 型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)，中國(guó)上海雷磁公司；GL-20G-II 型高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；凝膠成像分析系統(tǒng)，美國(guó)伯樂(lè)北京賽百奧科技有限公司；Master-sizer 2000 型激光粒度儀，英國(guó)馬爾文儀器有限公司；UV-2600型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，島津(中國(guó))有限公司；F-4500 型熒光分光光度計(jì)，日本 HITACHI 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1大豆分離蛋白的制備

采用PETRUCCELLI等[24]的方法，將大豆粉碎后用正己烷萃取，得脫脂豆粕。脫脂豆粕與水混合(料液比20 mL/g)，用2 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值至8.0，25℃下攪拌2 h，進(jìn)行離心(10 000g，30 min，4℃)，離心后的上清液用2 mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH值至4.5。靜置后再次離心(6 000g，20 min，4℃)，將下層沉淀再溶解到5倍的蒸餾水洗滌3次，最后用水溶解沉淀，用2 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)溶液pH值為7.0后離心(10 000g，30 min，4℃)，取上清液在4℃下用去離子水透析48 h脫鹽，后進(jìn)行冷凍干燥處理，即為大豆分離蛋白，其蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90.11%， 粗脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.43%，灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.51%。

1.3.2大豆分離蛋白的超聲處理

將大豆分離蛋白溶解在去離子水中，在室溫(20℃)下攪拌2 h ，得到的蛋白質(zhì)溶液在不同的超聲功率(0、200、300、400、500、600 W)下處理15 min，超聲處理方法和條件參照文獻(xiàn)[25]。將超聲處理器的鈦探頭(直徑0.636 cm)插入液面，超聲時(shí)間4 s，間隔時(shí)間2 s，在此條件下300 W超聲處理12 min時(shí)蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性最好，而450 W超聲處理24 min時(shí)，過(guò)高功率和長(zhǎng)時(shí)間處理會(huì)造成蛋白性質(zhì)的下降。因此對(duì)此方法進(jìn)行修改，選擇在20 kHz下，輸出功率為 200、300、400、500、600 W 超聲處理 15 min，然后得到大豆分離蛋白溶液。

1.3.3SDS-PAGE電泳

參考LAEMMLI[26]方法，SDS-PAGE電泳的分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%，濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%。將不同超聲功率處理后的大豆分離蛋白溶于水，質(zhì)量濃度為3 mg/mL，取樣品加上樣緩沖液煮沸5 min(上樣量為15 μL)，凝膠電泳濃縮膠80 V條件下運(yùn)行30 min，進(jìn)入分離膠后增至120 V。采用考馬斯亮藍(lán)R250溶液進(jìn)行染色，脫色后利用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.3.4大豆分離蛋白-殼聚糖復(fù)合物制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取一定質(zhì)量的不同超聲處理大豆分離蛋白樣品溶于去離子水中，使蛋白質(zhì)量濃度為20 mg/mL，準(zhǔn)確稱(chēng)取一定質(zhì)量的殼聚糖樣品溶于100 mol/L的乙酸緩沖液中(pH 值3.0)，在室溫下攪拌3 h 后放入冰箱中水化靜置12 h，制備出殼聚糖質(zhì)量濃度為10 mg/mL的儲(chǔ)液。將蛋白與殼聚糖按照質(zhì)量比1∶10在pH值2.0～5.0進(jìn)行復(fù)合，確定可溶性復(fù)合物最佳的復(fù)合條件為pH值3.0，在復(fù)合物中添加 0.02%的疊氮化鈉防止微生物生長(zhǎng)。

1.3.5復(fù)合物粒徑分布測(cè)定

利用Mastersizer 2000型激光粒度儀研究復(fù)合物粒徑分布。將待測(cè)樣品用去離子水配置相同濃度溶液進(jìn)行稀釋?zhuān)苊舛嘀毓馍⑸洌總€(gè)樣品重復(fù)測(cè)量3次。

1.3.6復(fù)合物ζ-電位測(cè)定

利用ZetaPALS-Zeta型電位儀測(cè)定復(fù)合物樣品的ζ-電位，復(fù)合物膠體溶液中帶電粒子的雙電層產(chǎn)生的電勢(shì)即為ζ-電位，可以反映復(fù)合物膠體粒子分散溶液的穩(wěn)定性。將待測(cè)復(fù)合物樣品用0.01 mol/L pH值7.0的磷酸鹽緩沖液，稀釋至蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為2 mg/mL，測(cè)定溫度25℃，平衡時(shí)間1 min，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)量3次。

1.3.7復(fù)合物濁度測(cè)定

濁度分析參考MARTINI等[27]方法，通過(guò)將待測(cè)樣品倒入石英比色皿中并利用分光光度計(jì)在600 nm處對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定，濁度測(cè)定時(shí)所有樣品的蛋白質(zhì)量濃度為5 mg/mL，在25℃下測(cè)量，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，取平均值。

1.3.8復(fù)合物溶液紫外光譜分析

試驗(yàn)參照牛付閣[28]的方法，將不同超聲處理大豆分離蛋白-殼聚糖復(fù)合物分別溶于0.01 mol/L pH值7.0 磷酸鹽緩沖液使蛋白質(zhì)量濃度為1 mg/mL，用紫外光譜進(jìn)行分析，波長(zhǎng)范圍在220～400 nm之間，分辨率為0.5 nm，掃描速率為50 nm/min。利用緩沖溶液作為空白，用二階導(dǎo)數(shù)紫外光譜(dA2/dλ2)由紫外掃描儀經(jīng)Origin 8.5軟件微分化獲得。

1.3.9復(fù)合物溶液熒光光譜分析

不同超聲處理大豆分離蛋白-殼聚糖復(fù)合物溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.03%)樣品適度稀釋后含蛋白質(zhì)量濃度為0.15 mg/mL。參照BONOMI等[29]方法采用F-4500型熒光光譜儀進(jìn)行內(nèi)源熒光測(cè)定，試驗(yàn)在280 nm下激發(fā)，掃描范圍為300～450 nm，掃描速度為12 000 nm/min，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬均為5 nm，掃描電壓為450 mV。試驗(yàn)值為3次掃描的平均值。

1.3.10數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)軟件對(duì)數(shù)值進(jìn)行差異顯著性分析(P≤0.01 表示極顯著，P≤0.05 表示顯著，P>0.05 表示不顯著)。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，采用Origin 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1復(fù)合物和大豆分離蛋白在SDS-PAGE電泳圖譜的亞基變化

經(jīng)不同功率超聲處理的大豆分離蛋白-殼聚糖復(fù)合物和不同功率超聲處理的大豆分離蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜如圖1所示。其中泳道M為標(biāo)準(zhǔn)分子量；泳道1為未經(jīng)處理的大豆分離蛋白-殼聚糖復(fù)合物；泳道2、3、4、5、6分別為200、300、400、500、600 W處理的大豆分離蛋白-殼聚糖復(fù)合物；泳道7為未經(jīng)處理的大豆分離蛋白；泳道8、9、10、11、12分別為200、300、400、500、600 W處理的大豆分離蛋白；從圖中可以看出，經(jīng)超聲處理的大豆分離蛋白SDS-PAGE電泳圖譜基本相似，都清晰地顯示出大豆分離蛋白各亞基的條帶分別為大豆蛋白7S 和11S酸性亞基與堿性亞基[30]。經(jīng)超聲處理的大豆分離蛋白分子量相比于未處理的蛋白，在高于66.4 kDa的條帶都有所變淺，說(shuō)明超聲處理對(duì)大豆分離蛋白的亞基組成有所影響，大豆7S球蛋白α、α′亞基發(fā)生改變，但對(duì)β亞基影響較小。而未經(jīng)超聲處理的大豆分離蛋白相對(duì)分子質(zhì)量分布較廣，蛋白質(zhì)亞基組分較多。朱建華等[31]研究中也有類(lèi)似的結(jié)論，指出低頻率超聲場(chǎng)作用主要影響大豆蛋白的7S組分，不同超聲處理功率在相同時(shí)間內(nèi)對(duì)蛋白亞基組分部分有所影響，但變化并不顯著。通過(guò)復(fù)合物的電泳可知，在β亞基及β亞基條帶以上，譜帶的顏色明顯加深，證明蛋白亞基分子量有所增加，說(shuō)明超聲處理促進(jìn)了大豆蛋白7S亞基與殼聚糖相互作用。

圖1 不同超聲處理?xiàng)l件下大豆分離蛋白SDS-PAGE圖譜Fig.1 SDS-PAGE analysis of untreated and ultrasonication-treated soybean isolate protein

2.2 復(fù)合物粒徑分布

粒徑分布是表征溶液理化特性和功能特性的重要參數(shù)之一。圖2顯示不同超聲功率處理對(duì)復(fù)合物粒徑大小的影響。由圖可知未經(jīng)超聲處理的蛋白與殼聚糖復(fù)合物體積平均粒徑D[4,3]為135.68 μm，且主要分布在100 μm以上。經(jīng)600 W超聲處理后的蛋白與殼聚糖復(fù)合物粒徑與未經(jīng)超聲處理的復(fù)合粒徑分布相似，可能長(zhǎng)時(shí)間的高功率處理使蛋白發(fā)生重聚集現(xiàn)象，復(fù)合物的粒徑有所增大，這與KENTISH等[32]研究結(jié)果相一致。隨著超聲功率的降低，在低于400 W時(shí)平均粒徑較低，復(fù)合物體系中粒徑分布較窄，平均粒徑D[4,3]在50 μm左右，說(shuō)明此時(shí)復(fù)合物溶液較為穩(wěn)定。隨著超聲功率的增加，超過(guò)500 W后，復(fù)合物的粒徑增大，分布范圍較寬。超聲處理會(huì)影響蛋白不同基團(tuán)的暴露和蛋白的聚集[33]，進(jìn)而影響蛋白與殼聚糖的相互作用。這說(shuō)明相對(duì)低功率時(shí)復(fù)合物形成得較為穩(wěn)定，粒徑較小，當(dāng)超聲功率增大時(shí)復(fù)合物形成之后就會(huì)進(jìn)一步聚集和重排，導(dǎo)致出現(xiàn)不同粒徑的復(fù)合物。較高的超聲功率可以促使蛋白聚集體形成，掩蓋了蛋白表面活性基團(tuán)[34]，可能會(huì)促進(jìn)蛋白首先通過(guò)共價(jià)鍵和非共價(jià)鍵的相互作用重新聚集成更大的不溶性蛋白聚集體，影響了大豆分離蛋白質(zhì)與殼聚糖之間的相互作用，造成復(fù)合物粒徑上的差別。

圖2 不同超聲處理?xiàng)l件下大豆分離蛋白-殼聚糖復(fù)合物粒度分布Fig.2 Particle size distribution of untreated and ultrasonication-treated soybean isolate protein-chitosan complex

2.3 復(fù)合物ζ-電位變化

復(fù)合物溶液體系的穩(wěn)定性可以通過(guò)ζ-電位即復(fù)合物表面電荷的多少進(jìn)行判斷。復(fù)合物表面所帶的電荷數(shù)越多，其分散粒子之間的排斥力越大，體系呈現(xiàn)得越穩(wěn)定。大豆分離蛋白-殼聚糖復(fù)合物的形成是通過(guò)大豆分離蛋白帶負(fù)電荷的羧基基團(tuán)與殼聚糖帶正點(diǎn)的氨基基團(tuán)相互作用結(jié)合成穩(wěn)定的復(fù)合物。通過(guò)考察體系的ζ-電位可以分析蛋白質(zhì)和多糖復(fù)合的靜電斥力。不同超聲功率處理的大豆分離蛋白-殼聚糖復(fù)合物溶液電位變化如圖3所示，在pH 值7.0的緩沖溶液中不同超聲處理的大豆分離蛋白-殼聚糖復(fù)合物ζ-電位從14.16 mV變化到16.13 mV，結(jié)果表明隨著超聲功率的增加電位先升高后降低，經(jīng)超聲處理的大豆分離蛋白與殼聚糖復(fù)合物電位在400 W時(shí)為16.13 mV，表面電荷密度最大，說(shuō)明在此超聲功率處理下，復(fù)合物顆粒間的靜電斥力較大。由于復(fù)合物主要通過(guò)靜電相互作用形成，其復(fù)合物的特性取決于復(fù)合分子的構(gòu)型、分子量、電荷密度和復(fù)合比，而蛋白結(jié)合多糖的數(shù)量是由鏈長(zhǎng)、分子柔韌性、相互作用力、多糖及蛋白的尺寸等條件決定[35]。試驗(yàn)中隨著超聲功率的進(jìn)一步增加，復(fù)合物的電位下降，而且在粒徑的分布上也有所不同。說(shuō)明超聲處理影響了復(fù)合物的表面電荷，可能是由于適當(dāng)?shù)某曁幚韽?qiáng)度會(huì)改變大豆蛋白空間結(jié)構(gòu)，使復(fù)合物結(jié)合得更加緊密，形成較高的電荷密度，促進(jìn)靜電作用。而表面電荷的不同可能是超聲處理使蛋白分子的部分展開(kāi)，柔性的增加會(huì)促進(jìn)與殼聚糖更強(qiáng)的結(jié)合，進(jìn)而影響復(fù)合物的電荷分布[36]。

圖3 不同超聲處理?xiàng)l件下大豆分離蛋白-殼聚糖復(fù)合物電位變化Fig.3 Change of ζ-potential of untreated and ultrasonication-treated soybean isolate protein-chitosan complex

2.4 復(fù)合物溶液的濁度變化

圖4 不同超聲處理?xiàng)l件下大豆分離蛋白-殼聚糖復(fù)合物的濁度變化Fig.4 Change of turbidity of untreated and ultrasonication-treated soybean isolate protein-chitosan complex

復(fù)合物濁度的變化可以反映溶液狀態(tài)下的分散度，為了確定不同超聲功率處理對(duì)大豆分離蛋白與殼聚糖復(fù)合物形成的影響，反映復(fù)合物凝聚狀態(tài)的分散度，以復(fù)合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%時(shí)的濁度變化進(jìn)行研究。由圖4可知，未經(jīng)處理的大豆分離蛋白濁度較高是由于此時(shí)蛋白與殼聚糖相互作用較為微弱，產(chǎn)生了蛋白的自聚集現(xiàn)象，沒(méi)有形成穩(wěn)定的復(fù)合物。隨著超聲功率的增加，復(fù)合物的濁度先降低后升高，超聲功率從200 W增大到400 W時(shí)，最大濁度從0.34降到0.29。然而，繼續(xù)增加超聲功率，復(fù)合物的濁度有所增加，這進(jìn)一步證明了復(fù)合物的聚集、溶解的形成與超聲強(qiáng)度具有一定相關(guān)性。WEINBRECK等[36]也證明了蛋白質(zhì)和多糖復(fù)合凝聚物是由于靜電相互作用形成的，蛋白質(zhì)和多糖的聚集對(duì)復(fù)合凝聚物的形成及濁度產(chǎn)生影響。超聲處理會(huì)使蛋白的顆粒減小，復(fù)合殼聚糖就會(huì)使溶液的漫散射程度降低，濁度減小，另外超聲處理后會(huì)使蛋白的疏水基團(tuán)暴露，影響蛋白質(zhì)表面電荷和氫鍵的作用，也會(huì)影響復(fù)合物的形成和穩(wěn)定[37]，進(jìn)而影響復(fù)合物溶液的濁度變化。

2.5 復(fù)合物溶液的紫外-可見(jiàn)吸收光譜

大豆分離蛋白-殼聚糖復(fù)合溶液中由于大豆分離蛋白側(cè)鏈含有不同的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基，會(huì)產(chǎn)生不同的紫外吸收峰，分析氨基酸殘基的相對(duì)移動(dòng)可以反映出蛋白質(zhì)三級(jí)構(gòu)象的變化。為探討不同超聲功率處理的大豆分離蛋白-殼聚糖復(fù)合物相互作用，通過(guò)對(duì)紫外光譜進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)光譜分析可以獲得更多關(guān)于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的信息[38]。吸收光譜的波長(zhǎng)范圍選擇在260～340 nm之間，不同超聲功率處理的大豆分離蛋白-殼聚糖復(fù)合物溶液紫外吸收光譜和紫外二階導(dǎo)數(shù)光譜分別如圖5a、5b所示。隨著超聲功率的增加，紫外吸收光譜最大吸收峰發(fā)生了輕微的紅移，說(shuō)明蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生了變化。超聲處理使蛋白的芳雜環(huán)疏水基團(tuán)暴露，使得吸光度增強(qiáng)。由二階導(dǎo)數(shù)光譜可以更加清晰地看出復(fù)合物在260～300 nm范圍內(nèi)有2個(gè)波峰(275 nm和295 nm)和2個(gè)波谷(265 nm和282 nm)。275 nm 處的吸收峰歸屬于色氨酸和酪氨酸殘基的貢獻(xiàn)，而295 nm處的波峰則由酪氨酸殘基單獨(dú)貢獻(xiàn)[39-40]。通過(guò)波峰波谷的變化可以說(shuō)明蛋白質(zhì)中氨基酸殘基所處的環(huán)境不同，超過(guò)400 W的大豆分離蛋白-殼聚糖復(fù)合物溶液在275 nm和295 nm 下的吸收峰發(fā)生了紅移，說(shuō)明氨基酸殘基向更加疏水的環(huán)境中遷移，導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變。同時(shí)，在未處理的大豆分離蛋白質(zhì)-殼聚糖復(fù)合溶液和200 W處理的大豆分離蛋白質(zhì)-殼聚糖復(fù)合的二階導(dǎo)數(shù)光譜沒(méi)有發(fā)生明顯的變化。通過(guò)計(jì)算波峰與波谷距離的比值來(lái)判斷酪氨酸的變化[41]。如圖5b所示，400 W以上超聲處理的復(fù)合物相對(duì)于低功率處理的大豆分離蛋白殼聚糖復(fù)合物混合體系波峰與波谷距離的比值相對(duì)較大。這一現(xiàn)象說(shuō)明蛋白質(zhì)的三級(jí)構(gòu)象改變，這可能是由于蛋白質(zhì)和多糖的相互作用影響了蛋白質(zhì)分子的微環(huán)境，使更多的酪氨酸殘基從疏水環(huán)境中暴露于更加親水的環(huán)境中，進(jìn)而導(dǎo)致不同超聲處理大豆分離蛋白-殼聚糖復(fù)合物結(jié)構(gòu)的不同。

圖5 不同超聲處理?xiàng)l件下大豆分離蛋白-殼聚糖復(fù)合物溶液的紫外吸收光譜和二階導(dǎo)數(shù)光譜Fig.5 Zero-order and second-derivative UV spectra of untreated and ultrasonication-treated soybean isolate protein-chitosan complex

2.6 復(fù)合物相互作用的熒光光譜

內(nèi)源性熒光對(duì)蛋白質(zhì)的色氨酸殘基所處微環(huán)境變化和蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)變化具有較高的靈敏度，因此常作為檢測(cè)蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)變化的手段[42]。不同超聲功率處理大豆分離蛋白-殼聚糖復(fù)合物的熒光光譜如圖6所示，超聲處理和殼聚糖的加入都會(huì)影響大豆分離蛋白與殼聚糖之間的相互作用，可以誘導(dǎo)擾動(dòng)或改變色氨酸的熒光參數(shù)，如熒光強(qiáng)度、量子產(chǎn)率或壽命等。因此，分析復(fù)合物的熒光光譜可以解析復(fù)合物之間相互作用關(guān)系。本試驗(yàn)采用280 nm作為復(fù)合物的激發(fā)波長(zhǎng)，結(jié)果表明復(fù)合物溶液體系的熒光強(qiáng)度隨著超聲的處理有規(guī)律地降低，最大吸收峰的熒光強(qiáng)度也發(fā)生了輕微的藍(lán)移。超聲處理和殼聚糖的加入使大豆蛋白的構(gòu)象發(fā)生了改變，是由于色氨酸殘基移向更加疏水的環(huán)境中。這一結(jié)果與紫外二階導(dǎo)數(shù)光譜所得到的信息是一致的。在超聲功率小于500 W的條件下，超聲使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)打開(kāi)、氨基酸暴露，使蛋白質(zhì)表面電荷與其殼聚糖之間相互作用增強(qiáng)，當(dāng)超聲功率600 W時(shí)，可能是蛋白質(zhì)發(fā)生了自聚集與殼聚糖相互作用后使發(fā)色基團(tuán)被包裹在其他大分子側(cè)鏈內(nèi)，使熒光強(qiáng)度增加。另外，由于大豆蛋白與殼聚糖通過(guò)靜電相互作用形成復(fù)合物，大分子之間的相互排斥作用力擾亂了蛋白質(zhì)分子中氨基酸的微環(huán)境[43]。一些色氨酸殘基由于蛋白質(zhì)三級(jí)構(gòu)象的改變移向更加疏水的環(huán)境中，影響了熒光強(qiáng)度。

圖6 不同超聲處理?xiàng)l件下大豆分離蛋白-殼聚糖復(fù)合物溶液的熒光光譜Fig.6 Intrinsic fluorescence spectroscopy of untreated and ultrasonication-treated soybean isolate protein-chitosan complex

3 結(jié)論

(1)利用不同超聲功率處理的大豆分離蛋白與殼聚糖形成復(fù)合物，并研究不同復(fù)合物表面電荷、粒徑大小和濁度等特性，發(fā)現(xiàn)相同處理時(shí)間下相對(duì)低功率400 W時(shí)形成的復(fù)合物粒徑較小、表面電荷密度最大、濁度較低。由于大豆分離蛋白與殼聚糖之間主要通過(guò)靜電相互作用結(jié)合，超聲處理使蛋白的疏水基團(tuán)暴露，影響了蛋白質(zhì)表面電荷，進(jìn)而影響復(fù)合物的形成和穩(wěn)定。

(2)不同超聲功率處理的大豆分離蛋白與殼聚糖形成復(fù)合物的穩(wěn)定性取決于超聲處理大豆分離蛋白的強(qiáng)度，適當(dāng)?shù)某曁幚頃?huì)使蛋白分子結(jié)構(gòu)部分展開(kāi)，柔性增加會(huì)促進(jìn)與殼聚糖更強(qiáng)的結(jié)合，提高復(fù)合物的穩(wěn)定性。當(dāng)超聲功率超過(guò)500 W時(shí)，較高的超聲功率可以促使蛋白聚集體形成，掩蓋了蛋白表面活性基團(tuán)，影響了大豆分離蛋白質(zhì)與殼聚糖之間的相互作用。

(3)通過(guò)紫外-可見(jiàn)吸收光譜法和熒光光譜法分析了大豆分離蛋白-殼聚糖復(fù)合物的結(jié)構(gòu)性質(zhì)的不同，超聲使存在復(fù)合物中的蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)和氨基酸微環(huán)境發(fā)生變化，從而影響復(fù)合物溶液的相關(guān)性質(zhì)，結(jié)果說(shuō)明不同超聲處理影響了大豆分離蛋白-殼聚糖復(fù)合物的分子結(jié)構(gòu)和相互作用。

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StructuralPropertiesofSoybeanProteinIsolate-ChitosanComplexTreatedbyUltrasonic

DING Jian QI Baokun JIANG Nan SUI Xiaonan WANG Zhongjiang LI Yang

(CollegeofFoodScience,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin150030,China)

The objective was to evaluate the interaction between ultrasonic treatment soybean protein isolate and chitosan, and the structural properties of the complexes. The interaction was studied by UV-Vis absorption and fluorescence spectroscopy. The relationships between structure changes and functional properties of soybean protein-chitosan complexes through SDS-PAGE, dynamic light scattering particle size analysis, surface charge and turbidity measurement were investigated. The results showed that with the increase of ultrasonic power, the maximum absorption peak of UV-Vis absorption spectrum was gradually increased and occurred red-shifted; the fluorescence intensity was firstly decreased and then increased. The intensity of the endogenous fluorescence was the highest at 600 W. Ultrasonic treatment affected soybean protein isolate subunit composition and mainly promoted the interaction between 7S subunits and chitosan. The particle size of the complex was firstly decreased and then increased. The charge potential of the complexes was larger under 300～500 W than those under others. The turbidity was also decreased, which was beneficial to homogeneous distribution and stability of the solution. The results showed that the formation of the complex was relatively stable at low power, but the interaction between soy protein isolate and chitosan was affected by the insoluble aggregation and rearrangement of the protein after high power ultrasonic treatment. The interaction of different complexes affected the microenvironment of amino acid residues, the tertiary structure and molecular flexibility of soybean protein isolate, and then impacted the structure and functional properties of the complexes.

soybean protein isolate; chitosan; complex; interaction; ultrasonic treatment

TS214.2

A

1000-1298(2017)09-0352-07

10.6041/j.issn.1000-1298.2017.09.045

2017-02-20

2017-03-13

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31571876)和國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2016YFD0400700、2016YFD0400402)

丁儉(1989—)，男，博士生，主要從事糧食、油脂及植物蛋白工程研究，E-mail： 18845619206@163.com

李楊(1981—)，男，副教授，博士，主要從事糧食、油脂及植物蛋白工程研究，E-mail： liyanghuangyu@163.com