幾種豬藍(lán)耳病檢測(cè)診斷方法比較分析

金福源 朱國(guó)良 （江蘇省蘇州市吳江區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所盛澤分所 215200）

夏曉潮 （廣東省茂名市林業(yè)有害生物防治檢疫管理辦公室 525000）

姚小兵 陳永中 李明觀 徐國(guó)東 （江蘇省蘇州市吳江區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所黎里分所 215200）

幾種豬藍(lán)耳病檢測(cè)診斷方法比較分析

金福源 朱國(guó)良 （江蘇省蘇州市吳江區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所盛澤分所 215200）

夏曉潮 （廣東省茂名市林業(yè)有害生物防治檢疫管理辦公室 525000）

姚小兵 陳永中 李明觀 徐國(guó)東 （江蘇省蘇州市吳江區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所黎里分所 215200）

豬繁殖與呼吸綜合征俗稱藍(lán)耳病，主要引起豬的繁殖障礙以及各種呼吸系統(tǒng)癥狀，臨床上給養(yǎng)殖戶造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，為了更好的控制豬藍(lán)耳病的流行，本文從其診斷檢測(cè)方法入手，分析了目前檢測(cè)該病主要方法的優(yōu)劣勢(shì)以及存在的問(wèn)題，并對(duì)這些方法的使用條件進(jìn)行說(shuō)明，為診斷與控制該病的發(fā)生提供依據(jù)。

藍(lán)耳??；檢測(cè)；診斷方法；分析

豬藍(lán)耳病是近幾年比較流行的病毒性傳染病，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大損失，如果能盡早發(fā)現(xiàn)本病，將大大提高豬群成活率，減少損失。這就要求提高診斷水平，但本病診斷方法中很多受檢測(cè)設(shè)備、人員操作和環(huán)境條件的影響，不能很好的應(yīng)用于臨床實(shí)踐。為了提高對(duì)本病檢測(cè)技術(shù)的認(rèn)識(shí)，本文針對(duì)當(dāng)下主要豬藍(lán)耳病病原檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行分析，以便能更好的服務(wù)于實(shí)際生產(chǎn)。

1 豬藍(lán)耳病簡(jiǎn)介

豬藍(lán)耳病又叫豬繁殖與呼吸綜合征，是一種能夠引起豬生殖系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)出現(xiàn)機(jī)能障礙的病毒性傳染病，首次病例于1987年被發(fā)現(xiàn)于美國(guó)，近幾年來(lái)由于病毒的不斷變異，對(duì)控制和撲滅本病提出更嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。母豬發(fā)病后主要表現(xiàn)流產(chǎn)、死胎以及木乃伊胎等嚴(yán)重的繁殖障礙，斷奶仔豬普遍發(fā)生肺炎、生長(zhǎng)遲緩等。我國(guó)已將其列為二類傳染病，本病傳播迅速，不僅可以通過(guò)呼吸道感染，也可以垂直傳播。雖然根據(jù)發(fā)病癥狀和剖檢特征可初步作出診斷，但確診仍需做實(shí)驗(yàn)室檢查。

2 本病的診斷技術(shù)

2.1 臨床診斷

本病因感染程度和病程不同，感染豬的表現(xiàn)差異性很大，根據(jù)患豬臨床表現(xiàn)和病理變化可作出臨床初步診斷。繁殖母豬感染后表現(xiàn)精神沉郁、厭食、發(fā)熱，妊娠后期發(fā)生流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎以及弱仔，患豬耳背面、邊緣以及尾部皮膚發(fā)紫，皮下出現(xiàn)一過(guò)性血斑。組織病理檢查可見有間質(zhì)性肺炎特征，另外對(duì)于臨床癥狀不明顯，缺少臨床癥狀的豬群，可參照荷蘭制訂的3項(xiàng)診斷指標(biāo)，即死產(chǎn)至少20%以上，流產(chǎn)母豬至少為80%以上，斷乳仔豬的死亡率至少為26%以上；符合其中的兩項(xiàng)指標(biāo)或兩項(xiàng)以上指標(biāo)，即可做出初步診斷。

2.2 實(shí)驗(yàn)室診斷

2.2.1 病毒分離與鑒定

病毒分離鑒定主要將感染豬的肺、死胎的腸、腹水、血清、母豬血液、鼻試子和糞便等發(fā)病部位進(jìn)行病毒分離。將病料過(guò)濾處理后接種至豬肺泡巨噬細(xì)胞培養(yǎng)，并進(jìn)行中和試驗(yàn)鑒定病毒。傳統(tǒng)中和試驗(yàn)比較簡(jiǎn)單，但特異性和敏感性低，操作時(shí)間較長(zhǎng) (1周左右），不能檢出早期感染的抗體，有學(xué)者曾對(duì)此方法進(jìn)行改進(jìn)，即在血清和病毒的混合液中加入補(bǔ)體，最早可在接種后8d檢測(cè)出抗體，提高了此方法的敏感性。病毒中和試驗(yàn)需要培養(yǎng)單層細(xì)胞或者飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，比較麻煩，較少應(yīng)用于臨床診斷。

2.2.2 血清學(xué)診斷方法

血清學(xué)檢查方法是近些年應(yīng)用比較多的診斷方法，尤其是藍(lán)耳病的亞臨床型和慢性型的出現(xiàn)后，本方法顯得更為重要，目前比較常用的主要有以下幾種。

(1）免疫過(guò)氧化物酶單層試驗(yàn) (IPMA）

IPMA法是最早報(bào)道用于檢測(cè)本病抗體的方法，由荷蘭中央獸醫(yī)研究所于1991年建立，是目前歐盟最常用的藍(lán)耳病診斷方法。為了調(diào)查藍(lán)耳病的流行情況，針對(duì)吳江地區(qū)的3個(gè)規(guī)模化豬場(chǎng)的105份血清進(jìn)行IPMA法檢測(cè)，結(jié)果如表1所示。

表1 IPMA檢測(cè)豬藍(lán)耳病血清抗體陽(yáng)性率統(tǒng)計(jì)

從表1中可以看出，本病歐洲型抗體陽(yáng)性檢出率為11.43%(12/105），美洲型的抗體陽(yáng)性檢測(cè)率為47.62%(50/105），說(shuō)明IPMA法具有很好敏感性和特異性，但歐洲性的檢出率低于美洲型檢出率，可能是由于在病毒增殖過(guò)程中，CPE(觀察致細(xì)胞癌變作用）時(shí)間較長(zhǎng)不易脫落，造成假陰性結(jié)果。該方法能在豬感染后6d～12個(gè)月的血清中檢測(cè)到抗體，其缺點(diǎn)是試驗(yàn)結(jié)果主要靠主觀判斷，不能自動(dòng)顯示，且操作步驟復(fù)雜，費(fèi)用高，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)假陰性，因而不適用于大規(guī)模檢測(cè)，在我國(guó)尚未廣泛使用。

(2）間接免疫熒光試驗(yàn) (IFA）

間接免疫熒光試驗(yàn) (IFA）首先在美國(guó)應(yīng)用于藍(lán)耳病的診斷，與IPMA法相當(dāng)，可在感染后2～3周檢測(cè)出抗體，已經(jīng)成為歐美各國(guó)官方認(rèn)可的權(quán)威檢測(cè)方法。本試驗(yàn)以美洲株為抗原，采用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板為載體，建立了間接免疫熒光抗體試驗(yàn) (IFA）法用于檢測(cè)本病在豬群中的抗體水平。共采取168份血清，同時(shí)結(jié)合ELISA方法進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果如表2所示。

表2 IFA法與ELISA法血清抗體檢測(cè)結(jié)果的比較

與ELISA法相比，168份血清中，IFA檢測(cè)的陽(yáng)性率為41.67%(70/168），ELISA法的檢出率為 42.86%(72/168），兩者的符合率為91.67%((64+90）/168）。試驗(yàn)證明，IFA具有良好的特異性和敏感性。但I(xiàn)FA法操作需要專業(yè)技術(shù)人員，且診斷結(jié)果滯后，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不能滿足疫病快速診斷的需求。

(3） ELISA法

表3 不同方法對(duì)豬藍(lán)耳病免疫抗體檢陽(yáng)性檢出率 （陽(yáng)性數(shù)/檢出數(shù)）

表4 本病熒光定量RT-PCR檢測(cè)檢測(cè)同一頭豬不同組織的結(jié)果統(tǒng)計(jì)

酶鏈免疫吸附試驗(yàn) (ELISA）主要用于檢測(cè)豬藍(lán)耳病病毒抗體，可測(cè)定出感染2周的病毒抗體。目前市場(chǎng)上已售有各種類型的ELISA試劑盒。本研究從規(guī)?；i場(chǎng)共采集血清樣品50份，分別用ELISA、IPMA、VN和IFA4種方法檢測(cè)本病抗體，進(jìn)行對(duì)比。檢測(cè)結(jié)果如表3所示。檢測(cè)結(jié)果顯示，通過(guò)ELISA法，在首免后第7天即可檢測(cè)出部分陽(yáng)性抗體，而其他3種方法則是在第10天以后才檢測(cè)出陽(yáng)性抗體，病毒中和試驗(yàn) (VN）敏感性相對(duì)其他3種方法較低，陽(yáng)性檢測(cè)率僅為38%，且費(fèi)時(shí)費(fèi)力。通過(guò)本次試驗(yàn)，4種方法中，ELISA方法具有敏感性、特異性高，抗原用量少，不需要特殊儀器，快速、經(jīng)濟(jì)，結(jié)果便于長(zhǎng)期保存等優(yōu)點(diǎn)，適于短期內(nèi)大批量血清樣品的檢測(cè)，更適合大面積推廣，已有很多國(guó)家將本方法列為常規(guī)檢測(cè)方法。

2.2.3 分子生物學(xué)診斷方法

分子生物學(xué)診斷方法主要為PCR反應(yīng)，目前已被廣泛應(yīng)用于藍(lán)耳病臨床樣品的檢測(cè)。主要PCR檢測(cè)方法有：RTPCR、實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR和TaqMan熒光定量RT-PCR等。根據(jù)PCR原理，參考基因庫(kù)中的豬藍(lán)耳病病毒的Nsp2基因保守區(qū)設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，擴(kuò)增目的片段為690bp，建立了一種通用RT-PCR方法，應(yīng)用此方法對(duì)2011～2013年搜集的125份樣品進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)結(jié)合ELISA法進(jìn)行比較，結(jié)果表明，RT-PCR法檢出率為44.9%，ELISA法檢出率為42.54%，兩者的符合率達(dá)94.66%。此結(jié)果表明，該方法具有特異、敏感、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，可以應(yīng)用于臨床發(fā)病檢測(cè)以及流行病學(xué)檢測(cè)。

在普通RT-PCR方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，建立熒光定量RT-PCR，通過(guò)此方法檢測(cè)發(fā)病豬場(chǎng)的5頭病死豬的不同組織臟器，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，如表4所示，同一頭豬的不同組織臟器的含毒量不同，各個(gè)組織含毒量由高到低大致為肺、淋巴結(jié)和肝，脾和腎，肌肉。肌肉檢測(cè)量雖高，但其中兩份樣本卻未檢出，原因可能在于有些病料中含毒量很低。上述結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明，熒光定量RT-PCR敏感性高于其他方法，能夠檢測(cè)到豬其他組織中的微量本病的RNA病毒，這對(duì)于豬肉的食品安全監(jiān)管具有重要意義。

除了靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)病料組織多樣化等優(yōu)點(diǎn)之外，與血清學(xué)診斷方法相比，PCR法還能夠區(qū)分高致病性藍(lán)耳病病毒與未發(fā)生變異的傳統(tǒng)藍(lán)耳病毒株以及野毒株，為凈化本病提供可參考的依據(jù)。

3 小結(jié)與討論

豬藍(lán)耳病是一個(gè)全球性問(wèn)題，對(duì)世界養(yǎng)豬業(yè)造成重要影響，選擇合適的診斷技術(shù)至關(guān)重要。豬群中暴發(fā)本病時(shí)，我們所面臨的問(wèn)題就是準(zhǔn)確而又快速的給出診斷，根據(jù)診斷結(jié)果做出相應(yīng)防治措施。具體到藍(lán)耳病而言，現(xiàn)有的多種豬藍(lán)耳病的診斷方法，有的方法靈敏度低、有的方法檢測(cè)時(shí)間久，有的方法成本高，有的方法需要特殊的實(shí)驗(yàn)環(huán)境或者昂貴的實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備，有的方法需要專業(yè)技術(shù)人員，各有優(yōu)劣勢(shì)。對(duì)于我們廣大養(yǎng)殖戶和獸醫(yī)工作者來(lái)講，應(yīng)根據(jù)自己實(shí)際情況，考慮不同方法所適用的情形，選擇適合自己的診斷方法來(lái)判定本場(chǎng)的藍(lán)耳病感染程度，將經(jīng)濟(jì)損失降低到最低。