酶聯(lián)免疫法檢測(cè)小兒乙肝PreS1抗原及抗體在乙肝診斷中的應(yīng)用價(jià)值

唐蓮 唐艷 朱詠貴 張慧

論 著

酶聯(lián)免疫法檢測(cè)小兒乙肝PreS1抗原及抗體在乙肝診斷中的應(yīng)用價(jià)值

唐蓮 唐艷 朱詠貴 張慧

目的探討酶聯(lián)免疫法檢測(cè)小兒乙肝病毒前S1蛋白（PreS1）抗原及抗體在小兒乙肝診斷中的應(yīng)用價(jià)值。方法在2014年至2016年在本院接受診斷和治療的乙肝患兒中，選擇200例資料完整且接受兩對(duì)半檢查和酶聯(lián)免疫法檢測(cè)血清PreS1抗原及抗體的患兒作為研究對(duì)象，計(jì)算不同兩對(duì)半檢測(cè)結(jié)果患兒PreS1抗原及抗體陽(yáng)性率，分析PreS1抗原陽(yáng)性與HBV-M的Spearman相關(guān)性。結(jié)果200例乙肝患者入選。18例乙肝大三陽(yáng)患兒的PreS1抗原陽(yáng)性及抗體陽(yáng)性的檢出率較高，均為83.33%。25例PreS1抗原陽(yáng)性組患兒與175例抗原陰性組患兒HBsAg、HBeAg和HBcAb數(shù)據(jù)對(duì)比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明PreS1抗原陽(yáng)性與HBsAg、HBeAg和HBcAb具有正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)數(shù)值分別為0.620、0.550、0.720，P值分別為0.021、0.009、0.020。結(jié)論乙肝PreS1抗原及抗體陽(yáng)性檢測(cè)準(zhǔn)確率相對(duì)較高，可以作為乙肝診斷的補(bǔ)充檢驗(yàn)，為患兒的臨床診斷和治療提供依據(jù)。

酶聯(lián)免疫法； 乙肝PreS1； 抗原； 抗體； 診斷

乙型肝炎（乙肝）是臨床中常見的傳染性疾病，在現(xiàn)階段的臨床診斷中，兩對(duì)半檢測(cè)是主要的診斷手段，但是該檢測(cè)方式對(duì)臨床診斷具有一定的局限性，需要通過(guò)輔助診斷方式來(lái)提升診斷效果。而DNA檢測(cè)屬于有效的輔助診斷方式，然而乙肝病毒感染時(shí)，容易出現(xiàn)基因突變，造成檢測(cè)假陽(yáng)性［1］。姜孝新等［2］在臨床研究中發(fā)現(xiàn)，乙肝病毒前S1蛋白（PreS1）抗體和抗原可以輔助檢測(cè)乙肝，將其應(yīng)用于患者的臨床檢測(cè)，可以提升檢測(cè)的準(zhǔn)確性和可靠性。王躍軍等［3］研究了乙肝病毒PreS1抗原及核心抗體IgM在臨床診斷中的價(jià)值，發(fā)現(xiàn)IgM可以為乙肝患者的診斷提供依據(jù)。PreS1抗體和抗原檢測(cè)方式可以輔助診斷疾病，但其臨床研究相對(duì)較少。因此，本研究的目的在于探討酶聯(lián)免疫法檢測(cè)小兒乙肝PreS1抗原及抗體在乙肝診斷中的應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 病例選擇 從2014年至2016年在本院接受診斷和治療的乙肝患兒中，選擇200例資料完整且接受兩對(duì)半檢查和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)血清檢查的患兒作為研究對(duì)象。

1.1.1 納入標(biāo)準(zhǔn) ① 患兒均行酶聯(lián)免疫法進(jìn)行診斷；② 患兒均行兩對(duì)半診斷；③ 患兒家屬同意本次研究且簽署知情同意書。

1.1.2 排除標(biāo)準(zhǔn) ① 伴有其他肝臟疾??； ② 患有肝臟其他器質(zhì)性疾病。

1.1.3 患者資料 200例患兒中男性112例，女性88例；患者年齡2～12歲，平均年齡（6.2±2.1）歲。其中，18例患兒屬于HBsAg+、HBeAg+、HBcAb+（大三陽(yáng)）；48例患兒屬于HBsAg+、HBeAb+、HBcAb+（小三陽(yáng)）；30例患兒屬于HBsAg+（單純表面抗原陽(yáng)性）；44例患兒屬于HBeAb+（單純表面抗體陽(yáng)性）；28例患兒屬于HBsAg+、HBeAb+（表面抗原及核心抗體陽(yáng)性）；22例患兒屬于HBsAg+、HBcAb+（表面抗體及核心抗體陽(yáng)性）；10例患兒屬于HBcAb+（核心抗體陽(yáng)性）。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器的選擇 實(shí)驗(yàn)儀器選擇酶標(biāo)儀（瑞士Tecan Sunrise公司生產(chǎn)）；洗板機(jī)（深圳匯松科技公司生產(chǎn)，型號(hào)PW-960）。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑的選擇 PreS1抗原和抗體檢測(cè)試劑盒（上海阿爾法生物技術(shù)公司生產(chǎn)）；乙肝兩對(duì)半檢測(cè)試劑盒（英科新創(chuàng)廈門科技公司生產(chǎn)）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法［4］嚴(yán)格按照試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行操作，稀釋洗滌液備用。在測(cè)試微孔板設(shè)計(jì)空白、陽(yáng)性和陰性對(duì)照組，一孔、二孔和三孔分別作為空白對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，滴入HBsAg酶合物，空白對(duì)照不滴加，充分搖勻后，將樣本置于板貼，置于保溫箱半小時(shí)，溫度設(shè)置為37 ℃，取下板貼，行洗板處理，運(yùn)用洗滌液洗滌6次后拍干，加入底物液體，同時(shí)加入1滴顯色劑，置于37 ℃中保溫10 min，最后加入終止液，運(yùn)用酶標(biāo)儀測(cè)定結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料用例（%）表示，同時(shí)采用Spearman進(jìn)行相關(guān)性分析，P＜0.05表示數(shù)據(jù)對(duì)比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患兒PreS1抗原以及抗體陽(yáng)性情況分析 在本次研究中，發(fā)現(xiàn)乙肝大三陽(yáng)患者的PreS1抗原陽(yáng)性及抗體陽(yáng)性的檢出率較高，達(dá)到80%以上。結(jié)果見表1。

2.2 患兒PreS1抗原陽(yáng)性、陰性與乙肝病毒標(biāo)志物的Spearman相關(guān)性分析 在本次研究中，PreS1抗原陽(yáng)性組患兒與抗原陰性組患兒HBsAg、HBeAg、HBcAb數(shù)據(jù)對(duì)比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明PreS1抗原與HBsAg、HBeAg和HBcAb具有正相關(guān)關(guān)系。見表2。

表1 200例乙肝患兒兩對(duì)半檢測(cè)及PreS1抗原抗體陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果表

表2 200例乙肝患兒PreS1抗原陽(yáng)性、陰性與HBV-M的Spearman相關(guān)性分析表

3 討論

乙肝是指感染了乙型肝炎病毒（HBV）并導(dǎo)致肝臟炎癥，人體感染后可以有不同的臨床感染狀態(tài)，如乏力、惡心和腹脹等，輕度的壓痛感，病情嚴(yán)重者甚至?xí)斐筛喂δ墚惓＃?］。在對(duì)患者的臨床診斷中，兩對(duì)半是患者的血清標(biāo)志物，包括表面抗原、表面抗體、核心抗體、e抗原以及e抗體。通過(guò)兩對(duì)半檢測(cè)，可以基本了解乙肝患者的病情，但是在檢測(cè)過(guò)程中，由于患者體質(zhì)以及基因突變等因素，導(dǎo)致僅有兩對(duì)半檢測(cè)仍無(wú)法了解部分患者的詳細(xì)病情，因而需要采用科學(xué)的方式來(lái)進(jìn)行輔助診斷［6］。

酶聯(lián)免疫法主要是通過(guò)抗體與酶的結(jié)合，通過(guò)顯色劑來(lái)進(jìn)行檢測(cè)，其可以保證免疫活性，同時(shí)保留酶的活性。在測(cè)定時(shí)，把受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺來(lái)進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化頻率很高，故可極大地放大反應(yīng)效果，從而使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。在乙肝患者的診斷中，通過(guò)酶聯(lián)免疫法，可以較為準(zhǔn)確地輔助患者的HBV診斷，為患者的臨床治療提供依據(jù)。

在本次研究中發(fā)現(xiàn)，乙肝大三陽(yáng)患者的PreS1抗原陽(yáng)性及抗體陽(yáng)性的檢出率較高，達(dá)到80%以上。說(shuō)明在對(duì)乙肝患者的臨床診斷中，采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)患者的PreS1抗原以及抗體，具有較高的準(zhǔn)確率，這主要是由于在對(duì)患兒的診斷中，傳統(tǒng)的兩對(duì)半檢測(cè)方式雖然可以基本了解患兒的乙肝病情，但是對(duì)于部分患兒而言，由于體質(zhì)和免疫狀態(tài)的差異，導(dǎo)致難以確定其具體的病情。而采用PreS1抗原以及抗體的檢測(cè)方式，可以相對(duì)更準(zhǔn)確地確定乙肝感染狀態(tài)，這是由于HBV顆粒包含Dane、球形和棒狀顆粒，并且DNA以及DNA多聚酶存在于Dane顆粒表面，在酶聯(lián)免疫法的應(yīng)用中，通過(guò)載體酶與反應(yīng)底物的化學(xué)反應(yīng)，會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的有色產(chǎn)物，而在反應(yīng)中，大三陽(yáng)患兒的HBsAg+、HBeAg+、HBcAb+均容易發(fā)生反應(yīng)，因而在檢測(cè)過(guò)程中，檢出率最高，達(dá)到83.33%。在對(duì)乙肝患者的臨床診斷研究中，Joo等［7］采用兩對(duì)半的方式對(duì)患者進(jìn)行檢查，通過(guò)檢查發(fā)現(xiàn)，該檢測(cè)方式的準(zhǔn)確率達(dá)到75%以上，但是對(duì)于部分患者而言，依然無(wú)法滿足患者的診斷需求，因而需要結(jié)合其他檢測(cè)手段來(lái)輔助進(jìn)行確診，以便為患者的臨床治療提供充分依據(jù)。靳四海［8］在對(duì)酶聯(lián)免疫法的研究中，認(rèn)為其對(duì)于乙肝大三陽(yáng)患者具有較高的診斷價(jià)值，這主要是由于在對(duì)患者的診斷過(guò)程中，大三陽(yáng)患者體內(nèi)的抗原反應(yīng)相對(duì)較為靈敏，會(huì)較為準(zhǔn)確地反映患者體內(nèi)的HBV情況，從而可以輔助確定患者的病情，對(duì)于乙肝的具體診斷具有較為重要的臨床意義。劉蘭鳳等［9］在臨床研究中，對(duì)酶聯(lián)免疫法的臨床優(yōu)勢(shì)以及缺點(diǎn)進(jìn)行分析，他認(rèn)為該檢測(cè)方式具有較高的靈敏度，可以確定患者的病情，但是在檢測(cè)的過(guò)程中，該檢測(cè)方式同樣會(huì)出現(xiàn)診斷誤差，在與兩對(duì)半檢測(cè)出現(xiàn)差異時(shí)，需要對(duì)患者進(jìn)行重新診斷，反而會(huì)浪費(fèi)診斷時(shí)間，因此，在診斷的過(guò)程中，需要根據(jù)患者的實(shí)際情況合理選擇。

在本次研究中，PreS1抗原陽(yáng)性組與陰性組患兒HBsAg、HBeAg和HBcAb數(shù)據(jù)對(duì)比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明與HBsAg、HBeAg和HBcAb具有正相關(guān)關(guān)系。因而在對(duì)患兒的臨床診斷中，可以通過(guò)PreS1檢測(cè)的方式來(lái)輔助診斷，以此來(lái)提升診斷的準(zhǔn)確率，并且降低疾病的傳染。這主要是由于在對(duì)患兒的診斷過(guò)程中，PreS1抗體是HBV清除的重要指標(biāo)，HBsAg、HBeAg和HBcAb更加容易發(fā)生反應(yīng)，改變抗原的性質(zhì)，因而與PreS1抗原陽(yáng)性呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)關(guān)系。而HBsAb與HBeAb在反應(yīng)過(guò)程中，雖然發(fā)生變化，但是對(duì)于陽(yáng)性的變化并無(wú)明顯的影響，因而不存在相關(guān)性。在對(duì)患兒的診斷中，如果患兒HBV出現(xiàn)基因突變，加重疾病，出現(xiàn)重癥肝炎，并且預(yù)后效果較差，因而更需要注意隔離和積極治療。在對(duì)乙肝患者的臨床診斷研究中，Dahl等［10］認(rèn)為PreS1抗原以及抗體和患者HBsAg具有正相關(guān)關(guān)系，其主要是由于患者體內(nèi)的病毒基因容易出現(xiàn)突變或者復(fù)制率變化，而PreS1抗原是患者HBV活躍的重要指標(biāo)，因而通過(guò)該檢測(cè)方式，可以較好地確定患者的感染狀態(tài)。石梁［11］在研究中，分析酶聯(lián)免疫法以及乙肝兩對(duì)半檢測(cè)方式的差異，發(fā)現(xiàn)酶聯(lián)免疫法檢測(cè)方式中，體內(nèi)PreS1抗原以及抗體和患者體內(nèi)的HBeAg和HBcAb變化具有明顯的正相關(guān)，可以較為靈敏地反映患者的HBV變化情況，對(duì)于患者的輔助診斷具有較高的借鑒意義。本次研究與諸多研究結(jié)果相符。

總之，PreS1抗原及抗體的檢測(cè)準(zhǔn)確率相對(duì)較高，可以作為乙肝診斷的補(bǔ)充檢驗(yàn)，為患兒的臨床診斷和治療提供依據(jù)。然而在本次研究中，由于樣本量相對(duì)較少，同時(shí)研究中可能存在一定的檢驗(yàn)誤差，且患兒的體質(zhì)存在差異，因而導(dǎo)致本次研究結(jié)果可能存在一定的誤差，但是總體而言，其仍然對(duì)于患兒的臨床診斷具有一定的借鑒意義。

1 康華，田亞瓊，張磊，等.乙肝相關(guān)肝細(xì)胞肝癌血清蛋白標(biāo)志物的篩選［J］.實(shí)用檢驗(yàn)醫(yī)師雜志，2015，7（2）：79-85.

2 姜孝新，蔣艷，李艷雯，等. MICA基因第5外顯子與乙肝后肝硬變的相關(guān)性研究［J］.實(shí)用檢驗(yàn)醫(yī)師雜志，2013，5（2）：76-78，108.

3 王躍軍，常亞麗，柴玉香，等.乙肝病毒前S1抗原及核心抗體IgM在臨床診斷中的價(jià)值［J］.西南國(guó)防醫(yī)藥，2013，23（9）：939-941.

4 黃麗慶，黃啟強(qiáng)，楊珊玉.乙肝病毒前S1抗原與傳統(tǒng)二對(duì)半聯(lián)合檢測(cè)的應(yīng)用價(jià)值探討［J］.現(xiàn)代診斷與治療，2013，（13）：2909-2910.

5 邱芳，吳澤良.放射免疫法和酶聯(lián)免疫法檢測(cè)人血漿乙肝表面抗體效價(jià)比較［J］.江西醫(yī)藥，2012，47（2）：178-179.

6 馬連學(xué)，李艷菊，魏巍.化學(xué)發(fā)光微粒免疫法和酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)乙肝表面抗原的結(jié)果對(duì)比分析［J］.中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥，2014，6（9）：89-90.

7 Joo DJ，Jung I，Kim MS，et al. Comparison of the affinity columnmediated immunoassay and microparticle enzyme immunoassay methods as a tacrolimus concentration assay in the early period after liver transplantation［J］. Transplant Proc， 2010，42（10）：4137-4140.

8 靳四海.酶聯(lián)免疫法檢測(cè)乙肝患者的血清標(biāo)志物的臨床價(jià)值分析［J］.中國(guó)處方藥，2015，13（5）：115.

9 劉蘭鳳，杜麗新.淺談?dòng)妹嘎?lián)免疫法與膠體金法檢測(cè)乙肝表面抗原的優(yōu)缺點(diǎn)［J］.當(dāng)代醫(yī)藥論叢，2015，13（11）：46-47.

10 Dahl JH，van Breemen RB. Rapid quantitative analysis of 8-isoprostaglandin-F(2alpha) using liquid chromatography-tandem mass spectrometry and comparison with an enzyme immunoassay method［J］. Anal Biochem， 2010，404（2）：211-216.

11 石梁.酶聯(lián)免疫法和膠體金快速檢測(cè)板檢測(cè)乙肝兩對(duì)半的比較分析［J］.臨床醫(yī)藥文獻(xiàn)電子雜志，2015，2（28）：5919-5920.

Clinical value of enzyme-linked immunosorbent assay in detecting hepatitis B PreS1 antigen and antibody in children

Tang Lian, Tang Yan, Zhu Yonggui, Zhang Hui. Liver Center, Hunan Children's Hospital, Changsha 410007,Hunan, China (Tang L, Zhu YG, Zhang H);
Department of Laboratory, Hunan Shaoyang Central Hospital, Shaoyang 422000, Hunan, China (Tang Y)

ObjectiveTo investigate the value of enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) in detecting hepatitis B PreS1 antigen and antibody in children.MethodsFrom 2014 to 2016 in our hospital 200 cases of children with incomplete information and accept the two semi inspection and enzyme-linked immunosorbent assay of serum examination for diagnosis and treatment of hepatitis B were selected as the research object. Positive rates of PreS1 antigen and antibody, and Spearman correlation between PreS1 antigen positive and HBV-M were calculated.ResultsTwo hundred cases of hepatitis B patients were enrolled. Eighteen patients with HBeAg positive PreS1 antigen and antibody positive detection rate was higher, more than 83.33% cases. Twenty-five PreS1 antigen positive group and 175 cases of children with HBsAg antigen were negative group, the difference was statistically significant in HBeAg and HBcAb data contrast, the PreS1 antigen positive and HBsAg, HBeAg and HBcAb had positive correlation, with correlation values were 0.620, 0.550, 0.720 and P = 0.021, 0.009,0.020.ConclusionThe detection accuracy of hepatitis B PreS1 antigen and antibody is relatively high, which can be used as a supplementary test for hepatitis B diagnosis, and provide the basis for clinical diagnosis and treatment of children.

Enzyme-linked immunosorbent assay; Hepatitis B PreS1; Antigen; Antibody; Diagnosis

2017-06-17）

（本文編輯：楊程伍 李銀平）

410007 湖南長(zhǎng)沙，湖南省兒童醫(yī)院肝病中心（唐蓮、朱詠貴、張慧）；

422000 湖南邵陽(yáng)，湖南省邵陽(yáng)市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科（唐艷）

唐蓮，Email：thinkapr@163.com

10.3969/j.issn.1674-7151.2017.03.006

Corresponding author: Tang Lian, Email: thinkapr@163.com