痛瀉要方對肝郁脾虛型潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織中g(shù)p130、SOCS3表達(dá)的影響

楊意，朱向東，翟艷會，李婷

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，蘭州730000)

痛瀉要方對肝郁脾虛型潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織中g(shù)p130、SOCS3表達(dá)的影響

楊意，朱向東，翟艷會，李婷

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，蘭州730000)

目的觀察痛瀉要方對肝郁脾虛型潰瘍性結(jié)腸炎(UC)模型大鼠結(jié)腸組織中糖蛋白130(gp130)、細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)抑制蛋白3(SOCS3)基因和蛋白表達(dá)的影響。方法將60只大鼠隨機(jī)分為A、B、C、D組各15只，B、C、D組均采用三硝基苯磺酸/乙醇溶液+束縛應(yīng)激、飲食失節(jié)法行肝郁脾虛型UC造模，A組采用同樣方法用等量的生理鹽水灌腸。C、D組分別予以痛瀉要方 (生藥5.5 g/kg)、美沙拉秦(0.5 g/kg)灌胃10 mL/kg，A、B組灌服等體積生理鹽水。各組造模成功后第1天開始灌胃，1次/d，連續(xù)21 d。取出距肛門以上7～8 cm處結(jié)腸段，肉眼行結(jié)腸黏膜損傷評分，分別采用Real-time熒光定量PCR法及免疫組化、免疫印跡法檢測結(jié)腸組織中的gp130、SOCS3基因和蛋白。結(jié)果B組結(jié)腸黏膜損傷評分為(2.67±0.62) 分，高于A組的(0.6±0.63)分(P<0.01)；C、D組分別為(1.73±0.70)、(1.27±0.46)分，均高于B組(P均<0.01)；C、D組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。B組較A組結(jié)腸組織中g(shù)p130基因和蛋白表達(dá)升高、SOCS3基因和蛋白表達(dá)降低(P均<0.05)，C、D組較B組結(jié)腸組織中g(shù)p130基因和蛋白表達(dá)降低、SOCS3基因和蛋白表達(dá)升高(P均<0.05)，C、D組結(jié)腸組織gp130、SOCS3基因和蛋白比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論痛瀉要方可下調(diào)gp130表達(dá)、上調(diào)SOCS3表達(dá)，從而有效降低肝郁脾虛型UC大鼠結(jié)腸黏膜損傷程度。

潰瘍性結(jié)腸炎；痛瀉要方；美沙拉秦；糖蛋白130；細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)抑制蛋白3；大鼠

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級Wistar大鼠60只，體質(zhì)量(180±10)g，雌雄各半，由甘肅中醫(yī)學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 三硝基苯磺酸(TNBS，Sigma公司)；美沙拉秦緩釋顆粒劑(5-ASA，愛的發(fā)制藥公司)。痛瀉要方(惠仁堂大藥房，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥劑科鑒定為真品)。TRIzol試劑(美國 Invitrogen 公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒、擴(kuò)增試劑盒(Promega 公司)。濃縮型DAB底物液、DAB溶液、兔SP試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；SDS-PAGE凝膠試劑盒(Solarbio公司)；gp130一抗、SOCS3一抗(Abcam公司)。

1.1.3 儀器與設(shè)備 Biorad iMark酶標(biāo)儀、CFX96 Real-time熒光定量PCR儀(BIO-RAD公司)；通用臺式高速離心機(jī)(Sigma3-16PK型)；立式超低溫冰箱(海爾DM-86L626型)；凝膠成像儀、電泳儀(BIO-RAD公司)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動物分組與造模 將60只大鼠隨機(jī)分為A、B、C、D組各15只，B、C、D組均采用TNBS/乙醇溶液+束縛應(yīng)激、飲食失節(jié)法行肝郁脾虛型UC造模[3]。具體方法：每日不定時(shí)限制其自由活動，每次限制時(shí)間約為6 h；隔日給予飼料，模擬饑飽失常。束縛1周后，所有動物禁食(不禁水)24 h；腹腔注射10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉后，一次性將TNBS/乙醇溶液(100 mg/kg TNBS+50 %乙醇溶液0.25 mL)灌入直腸。灌腸造模后每日仍然持續(xù)束縛大鼠四肢，隔日進(jìn)食，連續(xù)2周。A組采用同樣方法用等量的生理鹽水灌腸。

1.2.2 給藥處理與標(biāo)本獲取 C、D組分別予以痛瀉要方 (生藥5.5 g/kg，按照臨床成人用量的10倍折算)、美沙拉秦(0.5 g/kg)灌胃10 mL/kg，A、B組灌服等體積生理鹽水。各組造模成功后第1天開始灌胃，1次/d，連續(xù)21 d。取出距肛門以上7～8 cm處結(jié)腸段，沿腸系膜緣剪開腸腔，用4 ℃生理鹽水沖洗腸內(nèi)容物。取病變處結(jié)腸 5 cm，生理鹽水沖洗,觀察結(jié)腸黏膜損傷情況,置-80 ℃冰箱保存。

1.2.3 結(jié)腸黏膜損傷情況觀察 肉眼觀察大鼠結(jié)腸大體形態(tài), 結(jié)腸黏膜損傷評分標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[4]。

1.2.4 結(jié)腸黏膜組織中g(shù)p130、SOCS3基因檢測 采用Real-time熒光定量PCR法。提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。gp130上游引物5′-CCCTGAGTTTCCAGTTGTCC-3′，下游引物5′-ATGGTTTGTCTTCCACACGA-3′；SOCS3上游引物5′-TCACCCACAGCAAGTTTCC-3′，5′-TCCAGTAGAATCCGCTCTCC-3′；內(nèi)參β-actin上游 引物5′-CCTCTATGCCAACACAGTGC-3′，下游引物5′-AAGGGTGTAAAACGCAGCTC-3′。引物由上海生工生物工程公司設(shè)計(jì)提供。反應(yīng)體系(20 μL)：Go Taq-qPCR Master Mix 10 μL、 上游引物1 μL、下游引物1 μL、cDNA 2 μL、CXR Reference Dye 0.2 μL、 Nuclease-free Water 5.8 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min； 95 ℃ 15 s，60℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)； 65 ℃退火5 s(gp130)/95 ℃退火15 s(SOCS3)。取各組Ct值，ΔCt =目的基因Ct值-β-actin Ct值，2-ΔΔCt法計(jì)算相對定量，每個(gè)樣本均重復(fù)3孔后取均值。

這是商景蘭對于自我價(jià)值的理解和思考，是女性覺醒的可貴聲音。以“才”為歸結(jié)點(diǎn)，商景蘭把現(xiàn)世幸福的失落，在“立言”以求不朽中得到了超越，從而將文學(xué)活動作為生命苦難的感性慰藉，升華到揚(yáng)名后世的理性追求。商景蘭后半生的生命探索與價(jià)值追尋，至此劃上了圓滿的句號。

1.2.5 結(jié)腸黏膜組織中g(shù)p130、SOCS3蛋白檢測 ①免疫組化法：采用經(jīng)典SABC法。主要步驟：將固定好的石蠟切片常規(guī)二甲苯脫蠟，滴加3% H2O2孵育10 min，PBS沖洗；將切片浸入0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液(pH 6.0)中煮沸，進(jìn)行抗原修復(fù)；待自然冷卻，滴加5%BSA封閉，室溫20 min。加入gp130、SOCS3一抗，每組設(shè)PBS作為陰性對照，4 ℃冰箱過夜。滴加生物素標(biāo)記二抗，在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育20 min。滴加試劑SABC，在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育20 min。DAB顯色劑染色，蘇木素輕度復(fù)染3 min；脫水、透明、干燥，中性樹膠封片。在顯微鏡下觀察結(jié)果并攝片，運(yùn)用醫(yī)學(xué)數(shù)碼圖像分析系統(tǒng)，測量每張平片gp130、SOCS3陽性細(xì)胞的平均光密度。②免疫印跡法：先提取組織蛋白，以BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度；Buffer(5×)進(jìn)行蛋白變性、電泳，轉(zhuǎn)膜。封閉后分別用GAPDH(1∶2 000，33 kD)、gp130(1∶500，103 kD)、SOCS3(1∶500，30 kD)一抗孵育16 h，加入二抗孵育2 h?；瘜W(xué)發(fā)光法顯影，分析凝膠成像圖片，以目的蛋白與GAPDH光密度比值作為目的蛋白的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組結(jié)腸大體形態(tài)及結(jié)腸黏膜損傷評分比較 A組大鼠腸道不增厚，無粘連，腸皺襞紋理清晰，腸黏膜光滑，未見明顯的充血水腫、糜爛及潰瘍；B組大鼠病變結(jié)腸明顯可見黏膜充血、水腫,有不同程度的糜爛及潰瘍形成,腸壁增厚、粘連，腸道短縮；C、D組結(jié)腸黏膜損傷情況均得到一定改善,表現(xiàn)為少量充血、水腫。B組結(jié)腸黏膜損傷評分為(2.67±0.62) 分，高于A組的(0.6±0.63)分(P<0.01)；C、D組分別為(1.73±0.70)、(1.27±0.46)分，均高于B組(P均<0.01)；C、D組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.2 各組結(jié)腸組織gp130、SOCS3基因表達(dá)比較 B組較A組結(jié)腸組織中g(shù)p130基因表達(dá)升高、SOCS3基因表達(dá)降低(P均<0.05)，C、D組較B組結(jié)腸組織中g(shù)p130基因表達(dá)降低、SOCS3基因表達(dá)升高(P均<0.05)，C、D組結(jié)腸組織gp130、SOCS3基因比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表1。

表1 各組結(jié)腸組織gp130、SOCS3基因表達(dá)比較

注：與A組比較,*P<0.05；與B組比較,#P<0.05。

2.3 各組大鼠結(jié)腸組織gp130、SOCS3蛋白表達(dá)比較 B組較A組結(jié)腸組織中g(shù)p130蛋白表達(dá)升高、SOCS3蛋白表達(dá)降低(P均<0.05)，C、D組較B組結(jié)腸組織中g(shù)p130蛋白表達(dá)降低、SOCS3蛋白表達(dá)升高(P均<0.05)，C、D組結(jié)腸組織gp130、SOCS3蛋白比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表2。

表2 各組大鼠結(jié)腸組織gp130、SOCS3蛋白表達(dá)比較

注：與A組比較,*P<0.05；與B組比較,#P<0.05。

3 討論

UC是結(jié)腸的非特異性免疫性的炎癥[5]，是以直腸和結(jié)腸淺表性炎癥為主的一種腸道慢性疾病，臨床表現(xiàn)主要有腹瀉、腹痛和黏液膿血便，有時(shí)會伴有不同程度的全身癥狀，還有可能發(fā)生癌變。本病病情纏綿容易復(fù)發(fā)，病因尚不明確，目前認(rèn)為與免疫、遺傳、感染、環(huán)境等因素有關(guān)?，F(xiàn)代西醫(yī)治療主要以氨基水楊酸類藥物(如柳氮磺吡啶)、激素類藥物、免疫抑制劑、生物制劑等為主[6]，但有不良反應(yīng)及反復(fù)發(fā)作的情況。有文獻(xiàn)認(rèn)為，UC患者對美沙拉嗪有更好的耐受性，因不良反應(yīng)導(dǎo)致停藥率低[7]。另有報(bào)道[8,9]，美沙拉嗪和傳統(tǒng)用藥柳氮磺吡啶治療UC均有明顯效果，但美沙拉嗪效果更顯著，臨床治愈率更高，具有良好的安全性和可靠性。從有效性和安全性角度考慮，美沙拉嗪是治療UC 的理想藥物。因此，本研究選用美沙拉秦作為陽性對照組。

根據(jù)UC臨床癥狀，其與中醫(yī)學(xué)中的泄瀉、大瘕泄等都有相似之處[10]，現(xiàn)代中醫(yī)臨床多歸屬于泄瀉范疇。曹燕飛等[11]將近30年有關(guān)UC證候類型及治法的文獻(xiàn)進(jìn)行查閱、整理，頻次最多的4個(gè)證型為胃腸濕熱型、脾腎陽虛型、肝郁脾虛型、脾胃虛弱型。由此可見，肝郁脾虛是UC主要的證型之一。通過前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，因UC病程長，病情纏綿難愈，使患者精神壓力不斷增大。中醫(yī)稱之肝氣郁結(jié)，肝郁脾虛，久病則出現(xiàn)精神心理癥狀。所以，采用具有疏肝健脾功效的痛瀉要方治療，能取得顯著療效。

前期有研究[12]發(fā)現(xiàn)，痛瀉要方藥效作用可能是通過提高結(jié)腸組織抗氧化能力和調(diào)節(jié)結(jié)腸組織紊亂的免疫功能以及提高結(jié)腸組織過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPAR-γ)的表達(dá)實(shí)現(xiàn)，從而調(diào)控炎癥的發(fā)展。另有研究[13]證明，痛瀉要方通過抑制細(xì)胞因子TNF-α和IL-6、提高淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率來發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫的作用治療UC，并取得了良好的效果。劉海濤等[14]認(rèn)為，痛瀉要方治療UC療效明顯，其治療作用與調(diào)節(jié)UC 大鼠炎性因子IL-6、IL-4密切相關(guān)。以上研究均從免疫紊亂的正向調(diào)控出發(fā)，但對于結(jié)腸黏膜微環(huán)境中信號通路負(fù)性調(diào)控因子的研究相對缺乏。本實(shí)驗(yàn)從蛋白和基因水平探討痛瀉要方的作用機(jī)制，為防治UC提供新思路。

IL-6是活化的T細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的淋巴因子，在炎癥部位黏膜固有層中T細(xì)胞的生存和抗凋亡中扮演重要角色。研究發(fā)現(xiàn)，IL-6可能對UC的進(jìn)程有著深遠(yuǎn)的影響，結(jié)論來自于循環(huán)中及結(jié)腸組織高濃度的IL-6與病情嚴(yán)重程度相關(guān)。

gp130為IL-6受體的兩個(gè)亞基之一，另外一個(gè)亞基是IL-6Rα 。IL-6與IL-6Rα 的結(jié)合導(dǎo)致了IL-6Rα與gp130的結(jié)合,最終六聚體由兩分子IL-6、兩分子Ll-6Rα 和兩分子gp130組成。IL-6Rα 在胞質(zhì)區(qū)的存在與否并不影響IL-6信號，即IL-6Rα 的胞質(zhì)區(qū)不參與信號傳導(dǎo)，故IL-6信號是通過gp130進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)[15]。其進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后激活JAK2/STAT3，調(diào)控STAT3下游靶基因轉(zhuǎn)錄，如細(xì)胞周期蛋白、凋亡蛋白等，而致T細(xì)胞增殖，引起炎癥反應(yīng)失控[16]。這些研究表明，由IL-6 誘導(dǎo)的gp130介導(dǎo)的反應(yīng)是獨(dú)特的，阻斷IL-6信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，可能在本實(shí)驗(yàn)中治療UC有一定作用。

細(xì)胞因子信號抑制物SOCS家族是細(xì)胞因與受體結(jié)合后通過JAK/STAT途徑激活的靶基產(chǎn)物，目前發(fā)現(xiàn)由SOCS1～SOCS7及CIS1等8種蛋白組成。SOCS3可通過抑制JAK激酶與細(xì)胞因子受體結(jié)合的活性，以及促進(jìn)蛋白酶體水解JAK、STAT蛋白等途徑，抑制JAK/STAT信號通路的活化,對JAK/STAT途徑進(jìn)行負(fù)反饋調(diào)節(jié)。研究[17]發(fā)現(xiàn)，通過上調(diào)SOCS3表達(dá)，可以抑制脂多糖誘導(dǎo)的TNF-α的產(chǎn)生，從而產(chǎn)生抗炎作用。Berlato等[18]發(fā)現(xiàn)LPS可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生SOCS3，而產(chǎn)生的SOCS3能夠抑制LPS分泌IL-6、TNF-α 等效應(yīng)分子。由此可見，SOCS3表達(dá)的增高可以抑制促炎因子的產(chǎn)生，從而減輕炎癥的損害。本研究結(jié)果與上述報(bào)道一致。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，UC大鼠結(jié)腸組織gp130基因和蛋白表達(dá)明顯升高，說明gp130與炎癥密切相關(guān)。使用美沙拉秦與痛瀉要方后顯著降低，證實(shí)了gp130表達(dá)量與炎性程度成正相關(guān)，與上述理論相符。因此，gp130參與了UC的發(fā)病，且病情越重，其表達(dá)量越高。本研究發(fā)現(xiàn)，痛瀉要方對于治療肝郁脾虛型UC大鼠有良好療效。美沙拉秦治療大鼠較模型大鼠一般狀況明顯好轉(zhuǎn),結(jié)腸組織肉眼評分顯示充血、水腫及潰瘍明顯減輕,印證痛瀉要方對UC大鼠結(jié)腸黏膜的修復(fù)作用明顯，其作用機(jī)制可能與IL-6、gp130以及SOCS3的負(fù)性調(diào)控有關(guān)。SOCS3作為炎癥信號通路抑制因子，隨著炎癥嚴(yán)重情況而適應(yīng)性增高，起到負(fù)性調(diào)控因子作用。上述結(jié)果表明，gp130、SOSCS3參與了UC的發(fā)病。痛瀉要方通過疏肝健脾的整體調(diào)節(jié)起到緩解、治療UC的效果。其機(jī)制可能是抑制了IL-6與gp130蛋白結(jié)合，使炎癥反應(yīng)程度減輕；另一方面可能參與調(diào)控IL-6水平，降低gp130基因的轉(zhuǎn)錄并提高SOCS3 基因與蛋白的表達(dá)。但是，其具體相關(guān)作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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Effects of Tongxie Yaofang on expression of gp130 and SOCS3 in rats with liver depression and spleen deficiency type ulcerative colitis

YANGYi,ZHUXiangdong,ZHAIYanhui,LITing

(GansuUniversityofChineseMedicine,Lanzhou730000,China)

ObjectiveTo observe the effects of Tongxie Yaofang (Tongxie prescription) on the expression of glycoprotein 130 (gp130) and suppressor of cytokine signaling 3 (SOCS3) gene and protein in colonic tissues of rats with liver depression and spleen deficiency type ulcerative colitis (UC).MethodsSixty rats were randomly divided into groups A, B, C, and D. Rats in the groups B, C, and D were treated with trinitrobenzene sulfonic acid/ethanol solution + restraint stress and improper diet to induce the liver depression and spleen deficiency type UC models. Rats in the group A were treated with the same method by using the same amount of normal saline enema. Rats in the groups C and D were treated with Tongxie Yaofang (crude drug 5.5 g/kg), mesalazine (0.5 g/kg) 10 mL/kg by gavage. Rats in the groups A and B were fed with the same volume of normal saline. After the success of modeling in each group, the rats were treated by gavage, once a day for 21 days. We removed the colon segment from 7 to 8 cm above the anus, and determined the colon mucosal injury score by naked eyes. Real-time fluorescent quantitative PCR, immunohistochemistry, and immunoblotting were used to detect gp130, SOCS3 gene and protein in colon tissues.ResultsThe score of colonic mucosal injury in the group B was 2.67±0.62, which was higher than that of the group A (0.6±0.63) (P<0.01); the score of colonic mucosal injury in the group C and group D was 1.73±0.70 and 1.27±0.46, which was both higher than that of the group B (P<0.01). There was no significant difference between groups C and D. Compared with group A, the expression of gp130 gene and protein in the group B was higher and the expression of SOCS3 gene and protein was lower (allP<0.05). Compared with group B, the expression of gp130 gene and protein in the groups C and D was lower and the expression of SOCS3 gene and protein was higher than that of group B (allP<0.05). There was no significant difference in gp130 and SOCS3 gene and protein between the groups C and D.ConclusionTongxie Yaofang can inhibit the expression of gp130 and up-regulate the expression of SOCS3, so as to improve the degree of colonic mucosal injury of rats with liver depression and spleen deficiency type UC.

ulcerative colitis; Tongxie Yaofang; mesalazine; glycoprotein 130; suppressor of cytokine signaling 3; rats

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.34.006

R574.62；R975

A

1002-266X(2017)34-0020-04

2016-12-03)

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81460696)。

楊意(1990-)，男，碩士研究生，主要研究方向?yàn)橹嗅t(yī)治則治法及其臨床應(yīng)用。E-mail: 844460037@qq.com

朱向東(1973-)，男，博士，教授，主要研究方向?yàn)橹嗅t(yī)治則治法及其臨床應(yīng)用。E-mail: zhuxiangdong33@163.com