兔眼藍莓組培紅色突變株CHS基因的克隆與分析

劉艷艷，朱芳明，劉小珍，張漢堯

（西南林業(yè)大學 云南省高校林木遺傳改良與繁育重點實驗室，云南 昆明 650224）

兔眼藍莓組培紅色突變株CHS基因的克隆與分析

劉艷艷，朱芳明，劉小珍，張漢堯

（西南林業(yè)大學 云南省高校林木遺傳改良與繁育重點實驗室，云南 昆明 650224）

藍莓Vaccinium spp.果實含有豐富的花青素，但目前對藍莓花青素合成相關基因的研究還較少。為分析藍莓花青素合成相關基因，也為今后高花青素含量品種的育種工作提供一定的生物信息學基礎，以紅色突變兔眼藍莓Vaccinium ashei為試驗材料，采用同源克隆方法，克隆到查爾酮合成酶基因（CHS）的cDNA全長。生物信息學分析表明：該基因cDNA全長1 398 bp，有1個1 170 bp的完整開放閱讀框（ORF），編碼389個氨基酸。與杜鵑Rhododendron simsii，山茶Camellia japonica，紅花油茶Camellia chekiangoleosa，中華獼猴桃Actinidia chinensis，高叢藍莓Vaccinium corymbosum，蘋果Malus domestica的CHS基因同源性分別為90%，83%，83%，83%，83%與82%。兔眼藍莓CHS基因編碼的蛋白不存在信號肽，無跨膜結構域，定位于細胞質中，肽鏈表現為疏水性，α-螺旋和隨機卷曲是其蛋白質二級結構中量最大的結構元件，β-轉角和β-折疊散布于整個蛋白質中，對編碼的蛋白的結構域預測顯示該蛋白含有類似查爾酮合成酶超家族（CHS-like超家族）結構域。由此推測：兔眼藍莓CHS基因是高度保守的，表達的蛋白為疏水性蛋白，是一種結構和性質都相對穩(wěn)定的蛋白。圖4表1參20

生物信息學；兔眼藍莓；組織培養(yǎng)；CHS；花青素

Abstract:Blueberries （Vaccinium spp.） have attracted much attention because of their abundant anthocyanins;however,there have been few studies on the genes related to anthocyanin biosynthesis in blueberries.To analyze related genes of anthocyanin biosynthesis in blueberries and also to provide some bioinformatics basis for breeding of plants with a high anthocyanin content,a red mutant Vaccinium ashei was selected as the experimental material,and the full-length cDNA of chalcone synthase gene （CHS） was cloned by the homologous cloning method.The bioinformatics analysis showed that the full-length cDNA was 1 398 bp and had an openreading frame （ORF）which was 1 170 bp encoding 389 amino acids.The homology on the nucleotide level of the CHS gene with the CHS genes of several species were 90%for Rhododendron simsii;83%for Camellia japonica,Camellia chekiangoleosa,Actinidia chinensis,and Vaccinium corymbosum;and 82%for Malus domestica.The CHS protein of Vaccinium ashei had no signal peptide and no transmembrane domain.It was located in the cytoplasm,the peptide chain was hydrophobic,the α-helix and random coil were the largest constructional elements in the protein secondary structure,and β-turns and β-sheets were interspersed throughout the protein.The domain prediction of the encoded protein showed that the protein contained the chalcone syn-thase superfamily （CHS-like superfamily） domain.Thus inferred that the CHS gene of rabbit-eye blueberry was highly conserved,the expressed protein was hydrophobic,and it was a kind of protein with a relatively stable structure and properties. ［Ch,4 fig.1 tab.20 ref.］

Key words:bioinformatics;Vaccinium ashei;tissue culture;CHS;anthocyanin

花青素具有極強的抗氧化活性，是近年來研究較多的抗氧化劑；查爾酮合成酶（chalcone synthase，CHS）是花青素生物合成途徑上的第1個關鍵酶，催化1分子的香豆酰 CoA與 3分子的丙二酰 CoA反應，生成4-羥基查爾酮。自1983年KREUZALER等［1］利用差異篩選和雜交篩選相結合的方法從歐芹Petroselinum hortense中獲得了第1個CHS基因后，對查爾酮合成酶及其編碼基因的研究工作就屢有報道［2－3］。研究發(fā)現，編碼查爾酮合成酶（CHS）的基因組成了一個多基因家族，從葡萄Vitis vinifera中分離到的該家族的3個成員，分別被定名為CHS1，CHS2，CHS3［4］；經氨基酸水平檢測，發(fā)現CHS3與CHS1，CHS2的同源性均為89%，CHS1與CHS2同源性為96%，說明CHS家族成員之間具有較高的同源性。進一步研究發(fā)現，CHS1，CHS2主要在白葡萄、紅葡萄的葉片及果皮的著色過程中表達，而CHS3主要在紅葡萄果皮的著色過程中表達，表明CHS3主要參與花青素的合成，而CHS1，CHS2可能還參與合成其他代謝產物［5］。柑橘屬Citrus植物中也有2個CHS的cDNA序列被克隆出［6－7］，氨基酸序列上的同源性達到了86.6%，但具體功能不盡相同，說明CHS家族成員盡管在氨基酸序列上有很高的同源性，但功能上并不是完全重疊。從目前已經克隆到的上百個CHS基因序列［8－9］來看，CHS基因在植物體內的表達具有時空特異性，主要集中于花和果皮等部位，且在特定的時期才會表達；其表達量與花和果皮的顏色直接相關［10－12］， 許多果樹如蘋果 Malus domestica［13］， 柑橘 Citrus reticulata［14－15］， 沙梨 Pyrus pyrifolia［16］， 葡萄［5］等， 在受到紫外線照射［17］、 降低溫度［18］等物理刺激后， CHS 基因的表達量增加， 引起果實顏色加深。由此可見，CHS基因在花青素生物合成途徑中扮演著十分重要的角色。藍莓Vaccinium spp.為杜鵑花科Ericaceae越桔亞科Vaccinioideae越桔屬Vaccinium植物，研究稱其漿果花青素含量在水果中最為豐富。我們擬以紅色突變兔眼藍莓Vaccinium ashei為樣品，克隆獲得查爾酮合成酶基因（CHS），對獲取的序列進行生物信息學分析，并與其他物種的相關基因進行對比，以期為今后高花青素含量品種的育種工作提供一定的生物信息學基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

試材選用經組織培養(yǎng)8周的組培苗。液氮處理后，保存于－80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

試劑盒：RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒；PCR Mix；DNA膠回收試劑盒；pLB零背景快速克隆試劑盒。上述試劑盒均購自天根生化科技有限公司。cDNA反轉錄試劑盒（SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit），購自Clontech公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 總RNA提取與檢測 用RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒提取兔眼藍莓總RNA。用核酸蛋白測定儀與瓊脂糖凝膠電泳進行RNA的定量與質量檢測，合格的RNA樣品在－70℃中保存。按照SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit說明書進行操作,以oligo（dT）寡苷酸為引物，獲得cDNA模板。以反轉錄所得的cDNA為模板進行擴增，擴增引物如下：CHS（F1）:5′-CCACAAAGGCCATAAAGGAA-3′，CHS（R1）:5′-GGAGCTTGGTGAGCTGGTAG-3′， CHS（F2）:5′-CCACAAAGGCCATAAAGGAA-3′， CHS（R2）:5′-AGGAGCTTGGTGAGCTGGTA-3′。

1.3.2 目的片段的克隆 用pLB零背景快速克隆試劑盒克隆目的片段。挑取1～3個能在含有氨芐青霉素的LB平板上生長的菌株并提取DNA；用CHS基因擴增引物進行聚合酶鏈式反應（PCR）；把產物送出測序。

1.4 數據分析

序列拼接由ContigExpress完成。依據http://www.ncbi.nlm.nih.gov/，http://www.cbs.dtu.dk/，http://www.expasy.org/等網站提供的生物信息學軟件對克隆的基因序列作在線分析。用NCBI-ORF Finder進行開放閱讀框（ORF）的查找和翻譯；基于美國生物技術信息中心（NCBI）的blast功能進行氨基酸序列同源性分析；用Clustal W作同源序列的比對，用MEGA 5.2在序列比對的基礎上構建系統(tǒng)發(fā)育樹。用ProtParamet在線工具分析基因組成及其理化性質：理化性質用Expasy，亞細胞定位用TargetP 1.1，信號肽預測用SignalP 4.1，跨膜結構域用TMHMM 2.0。分別利用SOPMA及Swiss-Mode完成蛋白二級結構和三級結構的預測。使用NCBI提供的Conserved Domain Search進行蛋白功能域的預測分析。

2 結果與分析

2.1 CHS基因序列及氨基酸序列推導

測序結束后，對序列進行拼接，得到長度為1 398 bp的CHS基因。含有1個完整的開放閱讀框，長度為1 170 bp，并基于此基因序列推導其氨基酸序列（圖1）。

圖1 兔眼藍莓CHS基因的開放閱讀框序列及推導的氨基酸序列Figure 1 ORF of CHS cDNA and its deduced amino acid sequence from Vaccinium ashei

2.2 CHS氨基酸序列相似性比較與系統(tǒng)進化樹分析

將兔眼藍莓CHS基因核酸序列及其推導的氨基酸序列在NCBI中比對，選取與其同源性較高的16個物種（表1），作進一步的進化判斷及蛋白理化性質、結構功能分析。

被比對的16個物種中，高叢藍莓、蘋果、草莓、覆盆子、歐洲花楸、甜櫻桃、中華獼猴桃、甜橙、番茄和葡萄等物種花青素集中在果實，杜鵑、紅花油茶、山茶等物種花青素集中在花瓣，白梨則發(fā)生了紅莖突變。從表1可知：就核酸序列同源性而言，與兔眼藍莓同源性最高的是杜鵑，達90%；最低的是甜橙，僅為76%；核酸序列同源性平均為82%。與其氨基酸序列同源性最高的是杜鵑，達到97%；最低的是高叢藍莓，為87%；氨基酸序列同源性平均為92%。

表1 CHS基因核酸序列及推導氨基酸序列比對Table 1 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence aligment for CHS

用Clustal W軟件對兔眼藍莓CHS基因編碼的氨基酸序列與已知的CHS基因的氨基酸序列進行比對，再用MEGA 5.2軟件采用鄰接法（Neighbor-joining method,NJ法）做出系統(tǒng)進化樹（圖2）。

圖2 兔眼藍莓CHS蛋白與其他植物CHS蛋白進化關系Figure 2 Phylogenic analysis of CHS protein in Vaccinium ashei and other plant species

系統(tǒng)樹上物種聚類成支說明之間親緣關系較近。由圖2可知：薔薇科Rosaceae植物蘋果、白梨、歐洲花楸、草莓、覆盆子和甜櫻桃聚類為1個大分支，?？芃oraceae植物啤酒花和川桑聚類為1個小分支，山茶科Theaceae植物山茶和紅花油茶聚為1個小分支，杜鵑花科植物杜鵑和兔眼藍莓聚類為1個小分支，且遺傳距離為0.009，相當接近。這與分類學上的結論是一致的。值得注意的是，高叢藍莓與兔眼藍莓在傳統(tǒng)分類學上親緣關系十分接近，是藍莓下的2個栽培變種，但在系統(tǒng)樹上卻分別聚類在2個不同的大分支上。另一方面，甜橙是蕓香科Rutaceae植物，番茄是茄科Solanaceae植物，但在系統(tǒng)樹上，它們卻聚類為1個小支。

2.3 查爾酮合成酶（CHS）的生物信息學分析

2.3.1 查爾酮合成酶（CHS）化學性質分析 Expasy在線軟件對所得的查爾酮合成酶基因所編碼蛋白質的理化性質分析結果表明：兔眼藍莓中CHS基因預測編碼氨基酸為389個，相對分子量42 555.2，等電點5.98，不穩(wěn)定指數為36.42，是相對穩(wěn)定的蛋白。

2.3.2 查爾酮合成酶（CHS）信號肽分析 通過SignalP 4.1 Server對兔眼藍莓CHS基因所編碼蛋白質的信號肽進行預測，比對結果表明：查爾酮合成酶基因所編碼蛋白質不具有分泌功能。

2.3.3 查爾酮合成酶（CHS）跨膜結構分析 用TMHMM Server v.2.0對獲得序列的CHS蛋白跨膜結構進行分析。結果表明：兔眼藍莓CHS蛋白整條肽鏈都位于細胞膜外，說明其基因編碼的多肽不存在跨膜結構；結合信號肽預測結果，可以推斷兔眼藍莓CHS蛋白在細胞質基質中合成后，直接作用于細胞質基質中的特定區(qū)域，行使其催化功能。對其他植物的跨膜結構分析也得到了一致的結果，CHS基因在大部分植物體內均不包含跨膜結構。

2.3.4 查爾酮合成酶（CHS）親疏水性分析 ProtScale預測的兔眼藍莓CHS基因所編碼蛋白質的親疏水性，結果如圖3所示。兔眼藍莓CHS蛋白多肽鏈第51位具有最低分值－2.478，說明親水性最強；第342位具有最高分值2.422，說明疏水性最強。疏水性氨基酸均勻分布于整條肽鏈中，使整體表現為疏水性，但沒有明顯的疏水區(qū)域。ProtParam分析可知：兔眼藍莓CHS蛋白的脂溶指數（Aliphatic Index）為91.49，總平均親水性（GRAVY）為－0.071，預示其是一個脂溶性蛋白。與其他植物CHS蛋白的親疏水性預測結果一致。

圖3 兔眼藍莓CHS蛋白親水性/疏水性預測Figure 3 Prediction of hydrophobicity/hydrophilicity for CHS in Vaccinium ashei

2.3.5 查爾酮合成酶（CHS）亞細胞定位 用TargetP 1.1對CHS蛋白進行的亞細胞定位結果顯示：兔眼藍莓CHS蛋白的葉綠體轉運肽cTP，線粒體靶向肽mTP和分泌通路信號肽SP的數值都相當低（分別為0.029，0.235，0.069；閾值為0.000），可以認為兔眼藍莓CHS蛋白并沒有存在于葉綠體、線粒體中；而分泌通路信號肽數值跟信號肽預測一致，說明CHS蛋白并不是分泌蛋白。綜合跨膜結構的預測結果，我們推測CHS蛋白應該位于細胞質基質中，在核糖體合成蛋白后，就在細胞質基質中發(fā)揮作用，參與催化對香豆酰輔酶A和丙二酰輔酶A合成查爾酮。對其他物種CHS蛋白的亞細胞定位也獲得了類似的結果，不同物種中，CHS蛋白均位于細胞質基質中。

2.3.6 查爾酮合成酶（CHS）蛋白結構功能域分析 使用NCBI提供的Conserved Domain Search service（CD-Search）對兔眼藍莓CHS蛋白功能域進行預測（圖4）。結果顯示：兔眼藍莓CHS蛋白屬于CHS超家族，含有CHS超家族的結構域，即Pro16-Leu384，是一種植物特異的Ⅲ型聚酮合成酶（polyketide syn-thase，PKS）。此外，該蛋白還含有植物特異聚酮化合物合成酶（KAS-Ⅲ）功能域［8］和柚配基查爾酮合成酶（BcsA）功能域，后者參與類黃酮合成等代謝過程。

圖4 兔眼藍莓CHS蛋白保守功能域的預測Figure 4 Prediction of conserved domain in CHS protein of Vaccinium ashei

2.3.7 查爾酮合成酶（CHS）蛋白二級結構 用SOPMA對CHS蛋白二級結構進行預測，發(fā)現兔眼藍莓CHS蛋白二級結構中α-螺旋的比例為40.87%，β-折疊為18.25%，β-轉角11.83%，隨機卷曲29.05%；α-螺旋和隨機卷曲是兔眼藍莓CHS蛋白二級結構的主要結構原件，β-折疊和β-轉角雖然占得比例小，但它們均勻分布在整個氨基酸序列上；α-螺旋為右手螺旋，沒有3.010，2.270，4.416等左手螺旋結構，是較穩(wěn)定的結構。這樣的二級結構組成反映了兔眼藍莓CHS蛋白是一種結構相對穩(wěn)定的功能蛋白。

3 結論與討論

查爾酮合成酶（CHS）廣泛存在于各種植物中，它是花色素苷生物合成途徑中的第一個關鍵酶，在植物的花色素苷積累、細胞發(fā)育與分化、抗脅迫以及外源基因的表達等過程中都起著重要作用［19］。本研究采用同源克隆的方法，獲得了兔眼藍莓紅色突變株的CHS基因。該基因全長為1 398 bp，包含1個長為1 170 bp的開放閱讀框，編碼389個氨基酸。序列比對分析顯示，該基因與杜鵑、山茶、紅花油茶等的CHS基因在核苷酸水平及氨基酸水平上有較高的同源性。生物信息學分析結果顯示，兔眼藍莓紅色突變株CHS基因編碼的蛋白質序列中沒有信號肽，沒有跨膜結構，側面說明該基因編碼的蛋白質沒有參與跨膜轉運。KATIYAR等［20］對擬南芥根組織中CHS酶和CHI酶的研究發(fā)現，此兩者共定位于內質網和液泡膜上；本研究對CHS蛋白亞細胞定位的預測結果卻表明，兔眼藍莓紅色突變株中CHS蛋白定位于細胞質，但尚有待試驗的進一步確認。

FERRER等［9］和JEZ等［8］采用三維結構及定點突變分析研究查爾酮合成酶的空間結構，提出查爾酮合成酶催化中心由4個高度保守的殘基（Cys164，His303，Asn336，Phe215）組成，是查爾酮合成酶的作用中心。生物信息學分析軟件對兔眼藍莓紅色突變株CHS蛋白的功能域搜尋發(fā)現其含有CHS-like域，其CHS蛋白序列的第164位是半胱氨酸（Cys,C），215位是苯丙氨酸（Phe,F），303位是組氨酸（His,H），336位是天冬酰胺（Asn,N），與先前研究結果類似，這也說明CHS基因在高等植物中是高度保守的；兔眼藍莓紅色突變株CHS蛋白中的CHS-like域，也有可能是CHS酶的作用中心。

本研究獲得的CHS基因及相關的生物學信息為今后的轉基因及相關利用奠定了一定的基礎。

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Cloning and analysis of the CHS gene from a tissue culture of a red mutant strain in Vaccinium ashei

LIU Yanyan,ZHU Fangming,LIU Xiaozhen,ZHANG Hanyao
（Key Laboratory for Forest Genetic and Tree Improvement&Propagation in Universities of Yunnan Province,Southwest Forestry University,Kunming 650224,Yunnan,China）

S663；Q291

A

2095-0756（2017）05-0864-07

2016-10-31；

2016-12-08

云南省林學一流學科建設資助項目（51600625）；云南省高校林木遺傳改良與繁育重點實驗室開放基金資助項目（31360404）

劉艷艷，從事林木生物技術研究。E-mail：1255318156@qq.com。通信作者：張漢堯，教授，博士，博士生導師，從事植物和微生物分子遺傳學研究。E-mail：hanyaoz@163.com