SLC11A1基因多態(tài)性與寧夏南部人群肺結(jié)核易感性研究

朱圭娜 侯懷哲 尹媛婕 陳丹丹 Ellis K. Magda 關(guān)光玉 楊書鯤 楊延輝 Donald P. McManus 景永峰 王平 楊玉榮

·論著·

SLC11A1基因多態(tài)性與寧夏南部人群肺結(jié)核易感性研究

朱圭娜 侯懷哲 尹媛婕 陳丹丹 Ellis K. Magda 關(guān)光玉 楊書鯤 楊延輝 Donald P. McManus 景永峰 王平 楊玉榮

目的探索SLC11A1基因rs17235409、rs17235416、rs3731865等位點(diǎn)多態(tài)性與中國(guó)寧夏回族自治區(qū)南部人群肺結(jié)核易感性的關(guān)系。方法于2010年7—11月選取寧夏回族自治區(qū)南部的西吉、海原、涇原、彭陽(yáng)、原州、同心、中衛(wèi)、隆德等8個(gè)地區(qū)，并在該地區(qū)居住10年以上，且經(jīng)當(dāng)?shù)丶膊☆A(yù)防控制中心確診為活動(dòng)性肺結(jié)核的患者作為觀察組，共965例。同期選取上述地區(qū)的健康人群作為對(duì)照組，共897名。收集研究對(duì)象基本信息，采集研究對(duì)象外周靜脈血5 ml，應(yīng)用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，-80 ℃保存，用于提取基因組DNA。利用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)的方法對(duì)SLC11A1基因rs17235409、rs17235416、rs3731865位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，分析3個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)與結(jié)核易感性的關(guān)系。結(jié)果rs17235409位點(diǎn)AA、AG、GG基因型在觀察組和對(duì)照組中分布頻率分別為1.4%(13/950)、23.5%(223/950)、75.1%(714/950)和2.7%(23/842)、25.1%(211/842)、72.2%(608/842)，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.12，P=0.077)；rs17235416位點(diǎn)TGTG(-)/(-)、TGTG(+)/(-)、TGTG(+)/(+)基因型在觀察組和對(duì)照組中的分布頻率分別為1.8%(17/939)、22.7%(213/939)、75.5%(709/939)和3.4%(28/824)、23.8%(196/824)、72.8%(600/824)，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.99，P=0.082)；rs3731865位點(diǎn)CC、GC、GG基因型在觀察組和對(duì)照組中分布頻率分別為2.3%(22/951)、26.1%(248/951)、71.6%(681/951)和2.4%(20/843)、24.9%(210/843)、72.7%(613/843)，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.32，P=0.852)。在隱性模型中，rs17235409位點(diǎn)AA、AG+GG基因型在觀察組和對(duì)照組中分布頻率分別為1.4%(13/950)、98.6%(937/950)和2.7%(23/842)、97.3%(819/842)，兩組分布頻率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.21，P=0.040)；但多因素logistic回歸分析結(jié)果與單因素結(jié)果不一致，說明條件因素包括性別、年齡、民族等不同對(duì)結(jié)果有一定影響，所以不能說明rs17235409位點(diǎn)與肺結(jié)核發(fā)病相關(guān)(OR=0.51，95%CI=0.25～1.03，P=0.060)。rs17235416位點(diǎn)TGTG(-)/(-)、TGTG(+)/(-)+TGTG(+)/(+)基因型在觀察組和對(duì)照組中分布頻率分別為1.8%(17/939)、98.2%(922/939)和3.4%(28/824)、96.6%(796/824)，兩組分布頻率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.45，P=0.038，OR=0.52、1.91，95%CI=0.23～0.97、1.04～3.51)；經(jīng)多因素logistic回歸分析，排除性別、年齡和民族等條件因素對(duì)結(jié)果的影響，多因素結(jié)果與單因素結(jié)果相似，發(fā)現(xiàn)條件因素對(duì)結(jié)果無影響，結(jié)果仍有意義，說明攜帶rs17235416位點(diǎn)TGTG(+)/(-)和(或)TGTG(+)/(+)基因型的個(gè)體較攜帶TGTG(-)/(-)基因型的個(gè)體患肺結(jié)核的風(fēng)險(xiǎn)增加(OR=0.54，95%CI：0.29～1.00，P=0.049)。結(jié)論SLC11A1基因rs17235409和rs3731865位點(diǎn)多態(tài)性與寧夏南部地區(qū)人群肺結(jié)核易感性不相關(guān)。而rs17235416位點(diǎn)在隱性模型中，即攜帶TGTG(+)/(-)與 TGTG(+)/(+)基因型的個(gè)體發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增高。

結(jié)核,肺； 多態(tài)性，單核苷酸； 疾病易感性； 病例對(duì)照研究

結(jié)核病的主要免疫保護(hù)機(jī)制是細(xì)胞免疫，而巨噬細(xì)胞是結(jié)核分枝桿菌在機(jī)體內(nèi)的主要宿主細(xì)胞，也是殺滅人體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的主要效應(yīng)細(xì)胞[1-2]。所以，巨噬細(xì)胞在結(jié)核病免疫保護(hù)中的作用不容忽視。本研究主要選擇與巨噬細(xì)胞功能相關(guān)的溶質(zhì)性載體蛋白家族成員1(solute carrier family 11 member 1 protein，SLC11A1)基因進(jìn)行研究。SLC11A1，又名natural resistance associated macrophage protein 1，NRAMP1，其基因已被定位于人染色體2q35，長(zhǎng)達(dá)12 000 bp，含15個(gè)外顯子，編碼的是相對(duì)分子質(zhì)量約為60 000，包含550個(gè)氨基酸的疏水蛋白。它包括10～12個(gè)跨膜區(qū)(TM)，1～2個(gè)糖基化的胞質(zhì)外環(huán)狀結(jié)構(gòu)和1個(gè)胞質(zhì)內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白特征結(jié)構(gòu)域[3-4]。目前發(fā)現(xiàn)SLC11A1蛋白主要分布在巨噬細(xì)胞吞噬溶酶體膜上，它位于靜息巨噬細(xì)胞晚期胞腔內(nèi)，可能調(diào)節(jié)吞噬體內(nèi)錳、鐵等金屬二價(jià)離子的轉(zhuǎn)運(yùn)，是一種調(diào)節(jié)蛋白[5-6]。其作用是可以泵出吞噬體內(nèi)的二價(jià)陽(yáng)離子，造成吞噬體內(nèi)細(xì)菌或細(xì)胞Fe2+和 Mn2+攝取難度，從而細(xì)菌被消化殺滅[7-8]。但SLC11A1基因一旦變異使這一功能減弱或喪失，則難以控制胞內(nèi)菌的復(fù)制從而可能影響巨噬細(xì)胞對(duì)細(xì)菌的消滅功能。研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞的這一功能與多種感染性疾病(如結(jié)核病、麻風(fēng)病及流行性腦脊髓膜炎)以及自身免疫性疾病(如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)病及克隆恩病)的易感性相關(guān)。

許多研究者推測(cè)SLC11A1基因的D543N(rs17235409)、3′UTR(rs17235416)、INT4(rs3731865)和5′(GT)n等4個(gè)位點(diǎn)多態(tài)性可能會(huì)影響到免疫系統(tǒng)對(duì)結(jié)核分枝桿菌的清除殺滅功能，進(jìn)而說明SLC11A1基因多態(tài)性與結(jié)核病易感性相關(guān)。從復(fù)習(xí)國(guó)內(nèi)外一些學(xué)者對(duì)不同民族、地域的人群的研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，rs17235409、rs17235416和rs3731865等3個(gè)位點(diǎn)多態(tài)性與肺結(jié)核的發(fā)生相關(guān)性較大[9-16]，但也存在著一定的差異。筆者以寧夏回族自治區(qū)南部人群為研究對(duì)象，選擇這3個(gè)位點(diǎn)展開研究。利用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)SLC11A1基因的rs17235409、rs17235416和rs3731865位點(diǎn)進(jìn)行病例-對(duì)照研究，探討其與寧夏南部人群肺結(jié)核發(fā)生的相關(guān)性。

資料和方法

1.樣本量計(jì)算：根據(jù)前期回顧性調(diào)查[17]，寧夏回族自治區(qū)南部地區(qū)肺結(jié)核登記年患病率為500/10萬～700/10萬。以α=0.05，β=0.5～0.8，計(jì)算顯示樣本量應(yīng)≥1800檢驗(yàn)效能可達(dá)50%～80%。具體計(jì)算方法參見http://pngu.mgh.harvard.edu/～purcell/gpc/cc2.html。

2.研究對(duì)象：于2010年7—11月選取寧夏回族自治區(qū)南部的西吉、海原、涇原、彭陽(yáng)、原州、同心、中衛(wèi)、隆德等8個(gè)地區(qū)，并在該地區(qū)居住10年以上，且經(jīng)當(dāng)?shù)丶膊☆A(yù)防控制中心確診為活動(dòng)性肺結(jié)核的患者作為觀察組，共965例。同期選取上述地區(qū)的健康人群作為對(duì)照組，共897名。對(duì)照組研究對(duì)象均與觀察組研究對(duì)象的年齡、性別、民族分布相匹配。采集研究對(duì)象外周靜脈血5 ml，應(yīng)用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，-80 ℃保存，用于提取基因組DNA，共收集血液標(biāo)本1862份。所有研究對(duì)象均經(jīng)知情同意。

3.納入和排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)觀察組納入標(biāo)準(zhǔn)為年滿18周歲，嚴(yán)格按照肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)[18]，即細(xì)菌學(xué)(痰涂片或分離培養(yǎng))診斷陽(yáng)性、胸部X線攝影檢查顯示結(jié)核征象及有臨床表現(xiàn)。排除糖尿病、高血壓、哮喘、慢性阻塞性肺疾病、肺癌等并發(fā)癥患者；HIV、肝炎病毒感染者；腫瘤患者及長(zhǎng)期使用激素者和器官移植等免疫功能低下者；有家族遺傳病史者。(2)對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)為年滿18周歲，無結(jié)核病史，痰涂片檢查陰性，胸部X線攝影檢查無結(jié)核征象，肝功能正常。排除標(biāo)準(zhǔn)同觀察組。

4.調(diào)查方法：對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行一對(duì)一的問卷調(diào)查，填寫《肺結(jié)核易感性調(diào)查登記表》。調(diào)查表主要內(nèi)容包括基本信息(姓名、性別、年齡、民族、家庭住址、聯(lián)系方式等)，結(jié)核既往史，卡介苗接種史，乙肝史和其他疾病史。調(diào)查人員為各縣市疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病防治所相關(guān)負(fù)責(zé)人員，工作開展前對(duì)調(diào)查人員在寧夏醫(yī)科大學(xué)進(jìn)行集中培訓(xùn)。本次調(diào)查對(duì)所有研究對(duì)象進(jìn)行一般性臨床檢查和乙型肝炎(簡(jiǎn)稱“乙肝”)全套檢查及肝功能檢查。

5. PCR反應(yīng)：以裂解紅細(xì)胞法提取基因組DNA，具體提取方法和DNA質(zhì)量檢測(cè)參照文獻(xiàn)[11]，提取結(jié)果經(jīng)核酸測(cè)試儀測(cè)定，所有標(biāo)本波長(zhǎng)260 nm和280 nm可見光吸光度值(A值)比值A(chǔ)260/A280均在1.8～2.0之間，純度符合實(shí)驗(yàn)要求。引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)[14]，經(jīng)Primer Premier 5.0 軟件驗(yàn)證其合理性。引物均由北京普洛麥格生物公司合成。rs17235409及rs17235416位點(diǎn)采用同一引物進(jìn)行擴(kuò)增(擴(kuò)增的序列中包含此2個(gè)位點(diǎn))，其引物序列：上游：5′-GCATCTCCCCAATTCATGGT-3′，下游：5′-AACTGTCCCACTCTATCCTG-3′。PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為244 bp或240 bp。rs3731865位點(diǎn)引物序列：上游：5′-TCTCTGGCTGAAGGCTC-TCC-3′，下游：5′-TGTGCTATCAGTTGAGCCTC-3′。PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為624 bp。采用96孔板進(jìn)行反應(yīng)，SLC11A1基因 rs17235409、rs17235416 及rs3731865的 PCR 反應(yīng)總體積均為25 μl，其中，2×Mix混合液12.5 μl，上下游引物各0.4 μl，ddH2O 11.7 μl，rs17235409、rs17235416位點(diǎn)的DNA模板為150 ng，rs3731865位點(diǎn)的DNA模板為200 ng。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性30 s，rs17235409和rs17235416位點(diǎn)57.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)35次；rs3731865位點(diǎn)61 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30次；72 ℃終末延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

6.酶切分型：應(yīng)用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)分析各位點(diǎn)基因型。分別用AvaⅡ內(nèi)切酶、FokⅠ內(nèi)切酶、ApaⅠ內(nèi)切酶對(duì)SLC11A1基因的rs17235409、rs17235416 及rs3731865多態(tài)性進(jìn)行分型。采用96孔板進(jìn)行酶切，酶切反應(yīng)體系均為20 μl。rs17235409酶切反應(yīng)體系及條件：7 μl DNA產(chǎn)物，AvaⅡ內(nèi)切酶1.7 μl，RE buffer緩沖液(10×)2 μl，BSA緩沖液 100 μg/μl 2 μl，7.5 μl ddH2O，37 ℃ 酶切2 h，65 ℃酶切20 min。rs17235416酶切反應(yīng)體系及條件：7 μl DNA產(chǎn)物，F(xiàn)okⅠ內(nèi)切酶1 μl，BEB緩沖液(10×)2 μl，7.5 μl ddH2O，37 ℃酶切4 h，65 ℃酶切20 min。rs3731865酶切反應(yīng)體系及條件：8 μl DNA產(chǎn)物，ApaⅠ內(nèi)切酶0.5 μl，RE buffer緩沖液(10×)2 μl，BSA 100 μg/μl 2 μl，7.5 μl ddH2O，37 ℃酶切3 h，65 ℃酶切20 min。rs17235409、rs17235416及rs3731865酶切產(chǎn)物各取10 μl，以50～500 bp或100～700 bp的DNA Marker為對(duì)照，采用3%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

rs17235409位點(diǎn)A/G酶切結(jié)果：GG基因型，酶切產(chǎn)物顯示39、79、126 bp等3個(gè)片段；AG基因型，酶切產(chǎn)物顯示39、79、126、201 或205 bp等4個(gè)片段；AA 基因型，酶切產(chǎn)物顯示39、201或205 bp等2個(gè)片段。rs17235416位點(diǎn)TGTG(+)/TGTG (-)酶切結(jié)果：TGTG(+)/(+)基因型，酶切產(chǎn)物顯示33、211 bp等2個(gè)片段；TGTG(+)/(-)基因型，酶切產(chǎn)物顯示33、211、240 bp等3個(gè)片段；TGTG(-)/(-) 基因型，酶切產(chǎn)物顯示240 bp片段。rs3731865位點(diǎn)G/C酶切結(jié)果：GG基因型，酶切產(chǎn)物顯示604 bp片段；GC基因型，酶切產(chǎn)物顯示604、455、149 bp等3個(gè)片段；CC基因型，酶切產(chǎn)物顯示455、149 bp等2個(gè)片段。

7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析。觀察組和對(duì)照組研究對(duì)象性別、民族構(gòu)成的比較采用χ2檢驗(yàn)；年齡差異的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。采用依據(jù)Hardy-Weinberg平衡法則，檢驗(yàn)研究對(duì)象的基因型頻率是否達(dá)到遺傳平衡，以O(shè)R(95%CI)值表示基因型與疾病的危險(xiǎn)程度。對(duì)觀察組和對(duì)照組中各基因單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)基因型及等位基因頻率進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，并用HaploView 4.2軟件對(duì)其結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證；分析各基因SNP位點(diǎn)的顯性模型、隱性模型、共顯性模型在觀察組與對(duì)照組之間的分布差異；對(duì)各基因SNP位點(diǎn)的顯性和隱性模型進(jìn)行單因素和多因素logistic回歸分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.基本情況：觀察組965例，其中，男527例(54.6%)，女438例(45.4%)；回族618例(64.0%)，漢族347例(36.0%)；平均年齡為(46.4±17.2)歲。對(duì)照組共897名，其中，男498名(55.5%)，女399名(44.5%)；回族550名(61.3%)，漢族347名(38.7%)；平均年齡為(47.8±17.6)歲。觀察組和對(duì)照組性別、民族構(gòu)成及年齡差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.16，P=0.690；χ2=0.85，P=0.358；t=1.91，P=0.060)。

經(jīng)遺傳平衡檢驗(yàn)，SLC11A1基因rs17235409、rs17235416、rs3731865位點(diǎn)基因型頻率均符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡規(guī)律，說明所選擇的人群具有群體代表性，可進(jìn)行下一步研究(表1)。由于此研究受檢的SNP位點(diǎn)數(shù)目為3，所以校正概率P=0.05/3≈0.017。

2.等位基因與基因型頻率比較：等位基因研究顯示，rs17235409位點(diǎn)等位基因A和G，rs17235416位點(diǎn)等位基因TGTG(-)和TGTG(+)，rs3731865位點(diǎn)等位基因C和G在觀察組和對(duì)照組中的分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?；蛐脱芯匡@示，rs17235409位點(diǎn)基因型AA、AG、GG，rs17235416位點(diǎn)基因型TGTG(-)/(-)、TGTG(+)/(-)、TGTG(+)/(+)，rs3731865位點(diǎn)基因型CC、GC、GG在觀察組和對(duì)照組中的分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2～4)。

3.不同遺傳模型的基因頻率比較：?jiǎn)我蛩胤治鲲@示，rs17235409位點(diǎn)在隱性模型中基因頻率在觀察組和對(duì)照組中的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表5)；rs17235416位點(diǎn)在隱性模型中基因型頻率在觀察組和對(duì)照組中的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，攜帶TGTG(+)/(-)和(或)TGTG(+)/(+)基因型的個(gè)體患肺結(jié)核的風(fēng)險(xiǎn)較攜帶TGTG(-)/(-)基因型的個(gè)體大[OR(95%CI)值：1.91(1.04～3.51)]，是肺結(jié)核發(fā)病的危險(xiǎn)因素；而TGTG(-)/(-)基因型與肺結(jié)核的患病呈負(fù)相關(guān)[OR(95%CI)值：0.52(0.23～0.97)]，是隱性模型中的保護(hù)因素(表6)。

表1 SLC11A1基因rs17235409、rs17235416、rs3731865位點(diǎn)基因型Hardy-Weinberg遺傳平衡分析

注表中括號(hào)外數(shù)值為“例數(shù)”，括號(hào)內(nèi)數(shù)值為“比率(%)”；剔除無實(shí)驗(yàn)結(jié)果的樣本后，rs17235409位點(diǎn)觀察組950例，對(duì)照組842名；rs17235416位點(diǎn)觀察組939例，對(duì)照組824名；rs3731865位點(diǎn)觀察組951例，對(duì)照組843名

表2 rs17235409位點(diǎn)不同基因型及等位基因頻率在觀察組和對(duì)照組的分布情況

注表中括號(hào)外數(shù)值為“例數(shù)”，括號(hào)內(nèi)數(shù)值為“比率(%)”

表3 rs17235416位點(diǎn)不同基因型及等位基因頻率在觀察組和對(duì)照組的分布情況

注表中括號(hào)外數(shù)值為“例數(shù)”，括號(hào)內(nèi)數(shù)值為“比率(%)”

表4 rs3731865位點(diǎn)不同基因型及等位基因頻率在觀察組和對(duì)照組的分布情況

注表中括號(hào)外數(shù)值為“例數(shù)”，括號(hào)內(nèi)數(shù)值為“比率(%)”

表5 rs17235409位點(diǎn)不同遺傳模型的基因型單因素分析

注表中括號(hào)外數(shù)值為“例數(shù)”，括號(hào)內(nèi)數(shù)值為“比率(%)”

表6 rs17235416位點(diǎn)不同遺傳模型的基因型單因素分析

注表中括號(hào)外數(shù)值為“例數(shù)”，括號(hào)內(nèi)數(shù)值為“比率(%)”

表7 三個(gè)SNP位點(diǎn)顯性和隱性模型的多因素logistic回歸分析

經(jīng)多因素logistic回歸分析，rs17235409位點(diǎn)排除性別、年齡和民族因素對(duì)結(jié)果的影響后，發(fā)現(xiàn)條件因素對(duì)結(jié)果有一定的影響，所以不能說明rs17235409位點(diǎn)與肺結(jié)核患病相關(guān)；rs17235416位點(diǎn)排除性別、年齡和民族因素對(duì)結(jié)果的影響，發(fā)現(xiàn)條件因素對(duì)結(jié)果無影響，說明攜帶rs17235416位點(diǎn)TGTG(+)/(-)和(或)TGTG(+)/(+)基因型的個(gè)體較攜帶TGTG(-)/(-)基因型的個(gè)體患肺結(jié)核的風(fēng)險(xiǎn)增加(表7)。

討 論

21世紀(jì)，雖然人們通過接種卡介苗以及藥物治療來控制結(jié)核病的流行和感染的發(fā)展，但結(jié)核病目前仍然是傳染性疾病中導(dǎo)致死亡率較高的疾病之一。世界范圍內(nèi)有1/3的人口受到結(jié)核病的威脅,每年有接近300萬例患者死于結(jié)核病。雖然全球有1/3的人感染結(jié)核分枝桿菌，但在感染人群中僅1/10 發(fā)病，這提示個(gè)體差異對(duì)結(jié)核病易感性不同。

近幾年，隨著遺傳流行病學(xué)的迅速發(fā)展，宿主易感基因的調(diào)查在疾病發(fā)生發(fā)展的研究中也日益受到重視，越來越多與結(jié)核病易感性和疾病發(fā)展相關(guān)的候選基因被發(fā)現(xiàn)。而SLC11A1基因在眾多候選基因中被研究較多，并且在國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果中有較大差異。本次針對(duì)寧夏南部人群的研究顯示：rs17235409、rs17235416和rs3731865等3個(gè)位點(diǎn)等位基因和基因型頻率在觀察組和對(duì)照組中均無明顯差異，可能不是寧夏南部人群肺結(jié)核發(fā)病的易感基因，這與國(guó)內(nèi)一些研究結(jié)果存在差異，如李春柱等[9]研究發(fā)現(xiàn)，rs17235416位點(diǎn)TGTG缺失等位基因可能是新疆哈薩克族人群結(jié)核病的易感基因；熊宇和李革[10]的研究發(fā)現(xiàn)，NRAMP1基因的rs17235409位點(diǎn)A等位基因和rs17235416位點(diǎn)TGTG(-)等位基因可能是重慶市漢族人群肺結(jié)核患病的易感基因。

此外，本研究還對(duì)rs17235409、rs17235416和rs3731865等3個(gè)位點(diǎn)不同模型基因型頻率進(jìn)行單因素分析，并經(jīng)多因素分析排除性別、年齡和民族因素對(duì)結(jié)果的影響，發(fā)現(xiàn)rs17235409和rs3731865位點(diǎn)多態(tài)性可能與寧夏南部人群肺結(jié)核易感性不相關(guān)，而rs17235416位點(diǎn)多態(tài)性與寧夏南部人群肺結(jié)核易感性相關(guān)。這與一些研究結(jié)果有不同之處，如Bellamy等[11]發(fā)現(xiàn)NRAMP1基因的INT4、D543N及3′UTR等3個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)與非洲人群肺結(jié)核患病均有相關(guān)性。也與一些學(xué)者的研究結(jié)果有相似之處，如Abe等[12]發(fā)現(xiàn)3′UTR位點(diǎn)基因型變異與日本人群結(jié)核病的患病明顯相關(guān)；Ryu等[13]和 Kim等[14]發(fā)現(xiàn)TGTG(+)/(-)基因型頻率升高與韓國(guó)人群結(jié)核易感性明顯相關(guān)；林容等[15]發(fā)現(xiàn)NRAMP1基因 3′UTR TGTG(+)/(-)、TGTG(-)/(-)位點(diǎn)多態(tài)性可能是海南黎族人群結(jié)核病患病的易感因素；王喜等[16]研究發(fā)現(xiàn)，TGTG/del基因型可能是新疆維吾爾族人群結(jié)核病易感基因型。雖與這些結(jié)果有相似之處，但在本研究中發(fā)現(xiàn)攜帶TGTG(+)/(-)和(或)TGTG(+)/(+)基因型的個(gè)體發(fā)病率較高，并且攜帶TGTG(-)/(-)為保護(hù)因素，而在大部分的研究報(bào)導(dǎo)中，發(fā)現(xiàn)攜帶TGTG(-)/(-)和(或)TGTG(+)/(-)的個(gè)體患病率較高。

本研究結(jié)果與先前的研究結(jié)果存在差異，原因可能與樣本量、地區(qū)差異有關(guān)。從筆者對(duì)目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者在相同基因研究的文獻(xiàn)調(diào)查結(jié)果可以看出，前期的研究樣本量均比較小(沒有超過500例患者)；本研究根據(jù)結(jié)核病在寧夏地區(qū)的年發(fā)病率，將同民族地域的樣本收集，按統(tǒng)計(jì)效能所需樣本量計(jì)算為基本條件，在擴(kuò)大樣本量的前提下，對(duì)寧夏南部地區(qū)的人群進(jìn)行研究，理論上認(rèn)為其結(jié)果能代表這個(gè)地域人群遺傳特征。這些研究結(jié)果的差異還可能與不同研究者對(duì)病例和對(duì)照來源的入選標(biāo)準(zhǔn)，以及研究對(duì)象群體的遺傳結(jié)構(gòu)的不同有關(guān)。本研究所選取的對(duì)照組是與觀察組年齡、性別相似的人群，年齡、性別相似則說明人群具有相似的體質(zhì)，比較好的排除了年齡、性別對(duì)結(jié)果的干擾。另外，還應(yīng)考慮到SLC11A1基因多態(tài)性位點(diǎn)可能與其他基因位點(diǎn)存在連鎖不平衡現(xiàn)象。因?yàn)?，雖然SLC11A1基因?qū)Ψ谓Y(jié)核易感性的影響與巨噬細(xì)胞有關(guān)，但就目前所發(fā)現(xiàn)的與巨噬細(xì)胞相關(guān)的基因較多(如SP110基因、P2X7受體基因等)。因此，還應(yīng)該考慮可能SLC11A1基因與上述這些基因之間存在交互作用而影響疾病易感性或疾病發(fā)生發(fā)展的結(jié)果。

另外，還有研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)，SLC11A1基因與結(jié)核病易感性相關(guān)，并且證實(shí)了這個(gè)基因家族是局限于年輕女性[19]。國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)SLC11A1基因3′UTR位點(diǎn)變異研究提示，這個(gè)變異可能與中國(guó)兒童結(jié)核病易感性相關(guān)，并且提示性別對(duì)結(jié)核病發(fā)生發(fā)展的結(jié)果有影響[20]。這說明SLC11A1基因與結(jié)核病的相關(guān)性可能與個(gè)體的年齡、性別及環(huán)境等諸多因素有關(guān)(如發(fā)育的成熟程度，以及激素體液等因素共同作用的結(jié)果)。

綜上，因?yàn)闄C(jī)體清除結(jié)核分枝桿菌的功能是由不同的免疫細(xì)胞和免疫因子配合完成的，僅對(duì)單個(gè)基因的研究不能徹底闡述人群易感性的全面特征。因此，應(yīng)當(dāng)在擴(kuò)大樣本量的基礎(chǔ)上研究多基因位點(diǎn)之間的相互作用，并結(jié)合年齡、性別及環(huán)境等因素進(jìn)行更深入的探討，這不僅對(duì)疾病的正確診斷、治療及預(yù)防有重要意義，還將有助于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)結(jié)核病的發(fā)病機(jī)制，找到控制結(jié)核感染、發(fā)病和治療的新方法。

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(本文編輯：李敬文)

SLC11A1genepolymorphismsandassociationofsusceptibilitytotuberculosisamongstpopulationinsouthernNingxiaofChina

ZHUGui-na*,HOUHuai-zhe,YINYuan-jie,CHENDan-dan,EllisK.Magda,GUANGuang-yu,YANGShu-kun,YANGYan-hui,DonaldP.McManus,JINGYong-feng,WANGPing,YANGYu-rong.

*LaboratoryDepartment，QingyangCentreforDiseaseControlandPrevention,GansuProvince,Qingyang745000,China

Correspondingauthor:YANGYu-rong,Email:yangyurong@hotmail.com

ObjectiveTo explore the relationship between the polymorphism ofSLC11A1 gene (such as rs17235409, rs17235416 and rs3731865) and tuberculosis susceptibility in the population in the southern part of Ningxia Hui Autonomous Region.MethodsBetween July and November 2010, a total of 965 patients, who were from eight regions including Xiji, Haiyuan, Jingyuan, Pengyang, Yuanzhou, Tongxin, Zhongwei and Longde, in the southern part of Ningxia Hui Autonomous Region, had lived in these regions for more than 10 years and diagnosed with active tuberculosis by the local Centers for Disease Control and Prevention, were taken as case group. During the same period, a total of 897 healthy volunteers from the above regions were selected as control group. Their basic characteristics were collected. In addition, 5 ml of peripheral venous blood was collected from the study subjects, followed by the addition of anticoagulant-ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA), and then stored at -80 ℃ for the following extraction of genomic DNA. The genotyping of rs17235409, rs17235416 and rs3731865 inSLC11A1 gene was performed using polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP), and then the relationship between three single nucleotide polymorphisms (SNPs) and tuberculosis susceptibility was analyzed.ResultsThe distribution frequency of genotypes AA, AG, and GG at rs17235409 site in the case group was 1.4% (13/950), 23.5% (223/950) and 75.1% (714/950), respectively, while which was 2.7% (23/842), 25.1% (211/842) and 72.2% (608/842) in the control group, respectively; the difference was not statistically significant between two groups (χ2=5.12,P=0.077). The distribution frequency of genotypes TGTG (-)/(-), TGTG (+)/(-) and TGTG (+)/(+) at rs17235416 site in the case group was 1.8% (17/939), 22.7% (213/939) and 75.5% (709/939), respectively, while which was 3.4% (28/824), 23.8% (196/824) and 72.8% (600/824) in the control group, respectively; there was no significant difference between two groups (χ2=4.99,P=0.082). The distribution frequency of genotypes CC, GC and GG at rs3731865 site in the case group was 2.3% (22/951), 26.1% (248/951) and 71.6% (681/951), respectively, while which was 2.4 % (20/843), 24.9% (210/843) and 72.7% (613/843) in the control group, respectively; the difference was not statistically significant (χ2=0.32,P=0.852). In the recessive genetic model, the distribution frequency of genotypes AA and AG+GG at rs17235409 site in the case group was 1.4% (13/950) and 98.6% (937/950), respectively, while which was 2.7% (23/842) and 97.3% (819/842) in the control group, respectively; the difference was statistically significant (χ2=4.21,P=0.040). However, multivariable logistic regression analysis had inconsistent results with the univariate analyses, which indicated that the different condition factors, including genders, ages and ethnicity, had a certain effect on the results. Thus, these results did not explain that rs17235409 was related to the occurrence of tuberculosis (OR=0.51, 95%CI=0.25-1.03,P=0.060). The distribution frequencies of genotypes TGTG (-)/(-) and TGTG (+)/(-)+TGTG (+)/(+) at rs17235416 site were 1.8% (17/939) and 98.2% (922/939) in the case group, while 3.4% (28/824) and 96.6% (796/824) in the control group, respectively; there was no significant difference between two groups (χ2=4.45,P=0.038,OR=0.52, 1.91, 95%CI=0.23-0.97 and 1.04-3.51, respectively). Based on multifactor logistic regression analysis adjusted to the condition factors, including gender, age and ethnicity, multifactor results were similar to single factor results, and condition factors were found to have no effects on the results, as well as the results were still significant (OR=0.54, 95%CI=0.29-1.00,P=0.049), which indicated that the individuals with genotypes TGTG (+)/(-) and (or) TGTG (+)/(+) at rs17235416 site had increased risk of suffering from tuberculosis compared to individuals with genotype TGTG (-)/(-) (OR=0.54, 95%CI=0.29-1.00,P=0.049).ConclusionThe polymorphisms of rs17235409 and rs3731865 inSLC11A1 gene were not correlated with tuberculosis susceptibility in the southern region of Ningxia. However, in the recessive genetic model, the onset risk of individuals with genotype TGTG (+)/(-) and TGTG (+)/(+) at rs17235416 site was increased.

Tuberculosis, pulmonary; Polymorphism, single nucleotide; Disease susceptibility; Case-control studies

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.10.011

National Health Medical Research Councils(APP1025166)；國(guó)家自然科學(xué)基金(81460311)

745000 甘肅省慶陽(yáng)市疾病預(yù)防控制中心檢驗(yàn)科(朱圭娜、景永峰、王平)；甘肅省慶陽(yáng)市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科(侯懷哲)；寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)系(尹媛婕、楊延輝、楊玉榮)；山東省濰坊康華生物技術(shù)有限公司(陳丹丹)；澳大利亞新南威爾士州結(jié)核研究所(Ellis K. Magda)；寧夏回族自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心中心研究所(關(guān)光玉)；寧夏醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院(銀川市第一人民醫(yī)院)影像診斷室(楊書鯤)；澳大利亞昆士蘭醫(yī)學(xué)研究所傳染病研究部[Donald P.McManus、楊玉榮(客座教授)]

楊玉榮，Email：yangyurong@hotmail.com

2017-07-14)