抗生素暴露對小白菜幼苗生長及內(nèi)生細(xì)菌的影響

王盼亮，張 昊，2，3*，王瑞飛，3，楊清香，2，3，龔福利，常芳媛

抗生素暴露對小白菜幼苗生長及內(nèi)生細(xì)菌的影響

王盼亮1，張 昊1，2，3*，王瑞飛1，3，楊清香1，2，3，龔福利1，常芳媛1

（1.河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng)453007；2.河南師范大學(xué)環(huán)境學(xué)院，河南 新鄉(xiāng)453007；3.資源微生物與功能分子河南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地（河南師范大學(xué)），河南 新鄉(xiāng)453007）

采用水培實(shí)驗(yàn)研究了不同濃度四環(huán)素、環(huán)丙沙星暴露對小白菜種子萌發(fā)和幼苗生長的影響，進(jìn)一步通過微生物培養(yǎng)方法探討了抗生素暴露對小白菜幼苗中抗生素耐藥內(nèi)生細(xì)菌的影響。結(jié)果表明，4 mg·L-1四環(huán)素暴露能促進(jìn)小白菜種子萌發(fā)時(shí)的根伸長和芽伸長，高于4 mg·L-1的四環(huán)素和不同濃度環(huán)丙沙星暴露均抑制小白菜種子萌發(fā)，且暴露劑量越高抑制作用越明顯。在幼苗生長階段，兩種抗生素暴露下植株的根長和株高均呈現(xiàn)隨著暴露劑量增加抑制作用加強(qiáng)的趨勢。同時(shí)，抗生素暴露明顯提高了小白菜幼苗中耐藥內(nèi)生細(xì)菌的比例，且該比例隨著抗生素暴露劑量的增加顯著上升。

抗生素；蔬菜；抗生素耐藥內(nèi)生細(xì)菌；生態(tài)毒性

自20世紀(jì)50年代美國食品與藥物管理局（FDA）首次批準(zhǔn)抗生素可以用作飼料添加劑以來，因其能促進(jìn)動(dòng)物生長和增產(chǎn)而被廣泛應(yīng)用于禽畜養(yǎng)殖業(yè)[1]。據(jù)調(diào)查，中國每年生產(chǎn)超過21萬t抗生素，其中48%用于禽畜養(yǎng)殖等農(nóng)業(yè)生產(chǎn)[2]。然而，大多數(shù)獸藥抗生素在動(dòng)物體內(nèi)不能被完全吸收代謝，其中30%～90%會(huì)隨著動(dòng)物糞尿排出而進(jìn)入自然環(huán)境[3]，造成農(nóng)田土壤中抗生素污染日益嚴(yán)重[4]。國內(nèi)外大量研究證實(shí)，土壤中四環(huán)素類、磺胺類、大環(huán)內(nèi)酯類和喹諾酮類抗生素的殘留濃度達(dá)到0.4～300 μg·kg-1，對生態(tài)環(huán)境造成了嚴(yán)重威脅[5-9]。

已有研究表明，在抗生素污染的土壤中，植物根系會(huì)吸收抗生素而造成藥物在植株中積累[10]。吳小蓮等[11]分析了珠三角地區(qū)長期施用糞肥的蔬菜基地的蔬菜中16種典型抗生素的含量，發(fā)現(xiàn)抗生素檢出率高達(dá)100%，平均殘留量為0.91 μg·kg-1。Dolliver等[12]用含有50、100 mg·L-1磺胺甲嘧啶的豬糞施肥后，玉米、萵苣及馬鈴薯中均檢測到了磺胺甲嘧啶殘留。王瑾等[13]報(bào)道了在長期施用豬糞的農(nóng)田中種植韭菜后，植物根部有土霉素和金霉素檢出，而未施用豬糞的對照組中則未檢測出上述兩種抗生素。據(jù)報(bào)道，農(nóng)作物吸收和積累抗生素后首先會(huì)對植物生長造成影響。Kong等[14]研究土霉素暴露下紫花苜蓿生長時(shí)發(fā)現(xiàn)，幼苗芽生長和根生長的抑制率分別高達(dá)61%和85%。農(nóng)作物中抗生素的污染會(huì)通過食物鏈的傳播影響人類健康，食品中殘留的抗生素被人體尤其是幼兒吸收之后，可能會(huì)引起過敏反應(yīng)甚至中毒反應(yīng)[15-16]。

植物內(nèi)生細(xì)菌是存在于植物組織中的細(xì)菌，與植株的生長發(fā)育關(guān)系密切[17]。一方面，植物體為內(nèi)生細(xì)菌提供了營養(yǎng)物質(zhì)和適宜的生長條件。Rudrappa等[18]發(fā)現(xiàn)，植物組織中充分的水分和產(chǎn)生的一些分泌物有利于內(nèi)生細(xì)菌在植物組織上的黏附，從而更好地為內(nèi)生細(xì)菌的生長提供能量；另一方面，植物內(nèi)生細(xì)菌能夠促進(jìn)植物體對環(huán)境中氮、磷和鐵元素的吸收。如豆科植物根瘤菌的固氮作用就是根瘤細(xì)菌通過在宿主豆科植物的根部形成結(jié)瘤，再通過固氮作用為豆科植物提供氮素營養(yǎng)。同時(shí)，內(nèi)生細(xì)菌還可以產(chǎn)生一些植物激素（如生長素、細(xì)胞分裂素和乙烯等）促進(jìn)植株生長[19]，如紅辣椒幼苗根系中內(nèi)生的蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、延長芽孢桿菌（Bacillus macroides）和短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）產(chǎn)生的赤霉素就可以對幼苗生長產(chǎn)生促進(jìn)作用[20]。另外值得注意的是，一些致病性的內(nèi)生細(xì)菌也會(huì)引起植物病害甚至導(dǎo)致植株的死亡。例如，能引起人類新生兒和免疫缺陷病人敗血癥的銅綠假單胞菌就可以定植在擬南芥中，并能夠合成侵染葉片的特有毒力因子海藻糖，以幫助菌體在葉片細(xì)胞中增殖[21-22]。

目前，農(nóng)作物對抗生素的吸收和積累問題以及對人類的健康威脅已經(jīng)引起了人們的重視，但鮮有抗生素暴露對蔬菜內(nèi)生細(xì)菌耐藥性影響的報(bào)道。本研究選擇日常生活中常見蔬菜小白菜為研究對象，模擬了水培環(huán)境下不同劑量四環(huán)素、環(huán)丙沙星暴露對種子萌發(fā)及苗期生長的影響，以了解環(huán)境中抗生素脅迫對蔬菜生長的毒性效應(yīng)，并通過對幼苗中耐藥性內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量變化的解析，探討抗生素污染與作物內(nèi)生細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生之間的關(guān)系，以期為畜禽糞肥應(yīng)用于蔬菜種植而可能帶來的生態(tài)安全和健康風(fēng)險(xiǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 蔬菜

小白菜品種為上海青（Brassica chinensis L.，冬野美冠），發(fā)芽率98%，購自新鄉(xiāng)市科達(dá)種子有限公司。

1.1.2 抗生素

四環(huán)素，分子式C22H24N2O8，分析純（≥97.0%）；環(huán)丙沙星，分子式C17H18FN3O3，分析純（≥95.0%）。均為Dr.Ehrenstorfer GmbH公司生產(chǎn)。

1.1.3 培養(yǎng)基

蔬菜水培體系采用1/2濃度Hoagland營養(yǎng)液[23-24]。蔬菜幼苗中總可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的培養(yǎng)采用LB固體培養(yǎng)基[25]，耐藥性內(nèi)生細(xì)菌培養(yǎng)采用含四環(huán)素、環(huán)丙沙星終濃度分別為16、4 μg·mL-1的LB固體培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中抗生素濃度的設(shè)定參考CLSI（2013）[26]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)

選取飽滿度一致的種子，浸泡于0.1%的NaClO溶液中表面消毒10 min，然后用去離子水沖洗干凈[27]。在鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中加入10 mL新配制的不同濃度抗生素溶液（四環(huán)素濃度分別為4、16、30、50、100 mg·L-1；環(huán)丙沙星濃度分別為1、4、10、20、50 mg·L-1），對照組中添加等體積無菌水。將表面消毒的種子均勻擺放入內(nèi)，每皿20粒。每種抗生素每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)，25℃恒溫遮光培養(yǎng)，待對照組種子根伸長約20 mm時(shí)停止實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 水培育苗實(shí)驗(yàn)

挑取1.2.1對照組中長勢均一的種子播種于穴盤中育苗。苗齡兩葉一心時(shí)，選取生長均一的幼苗移至含1/2濃度Hoagland營養(yǎng)液的水培箱中，每箱定植12株。同時(shí)水培箱中含有與1.2.1中一致的不同濃度抗生素溶液，對照組處理僅含有營養(yǎng)液，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。水培箱采用打氧通氣，調(diào)節(jié)營養(yǎng)液pH為6.0～6.4，培養(yǎng)環(huán)境保持白天溫度（25±2）℃，夜晚溫度（18±2）℃，每日光照12 h，濕度維持在65%～70%。幼苗生長15 d后收獲。

1.2.3 蔬菜生長指標(biāo)測定

種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后測量種子的根伸長和芽伸長[17]。幼苗收獲后，先用去離子水將植株表面沖洗干凈，再置于無菌濾紙上將表面殘余水分吸干，然后測量植株的根長和株高。種子萌發(fā)的根伸長、芽伸長和幼苗的根長、株高抑制率計(jì)算公式如下[28]：

抑制率=（對照組測量值－實(shí)驗(yàn)組測量值）/對照組測量值×100%

1.2.4 蔬菜幼苗中內(nèi)生細(xì)菌計(jì)數(shù)

將各處理的蔬菜幼苗按以下步驟進(jìn)行表面消毒：70%乙醇3 min，0.1%氯化汞3 min，70%乙醇1 min，滅菌蒸餾水沖洗6～7次后，用無菌濾紙吸干水分。將幼苗轉(zhuǎn)入滅菌研缽中研磨成汁，經(jīng)梯度稀釋后涂布在LB固體培養(yǎng)基上。同時(shí)四環(huán)素暴露處理的樣品涂布在含四環(huán)素的LB培養(yǎng)基上，環(huán)丙沙星暴露處理的樣品涂布在含環(huán)丙沙星的LB培養(yǎng)基上，每個(gè)樣品每個(gè)稀釋度重復(fù)3次。28℃恒溫培養(yǎng)72 h后，計(jì)數(shù)平板上的菌落數(shù)目，計(jì)算總可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌數(shù)、四環(huán)素耐藥內(nèi)生細(xì)菌數(shù)和環(huán)丙沙星耐藥內(nèi)生細(xì)菌數(shù)[28]。

1.3 數(shù)據(jù)處理及分析

用Excel 2016軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理并繪制圖表，用SPSS V22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗生素暴露對小白菜種子萌發(fā)的影響

用不同濃度的四環(huán)素和環(huán)丙沙星處理小白菜種子，種子萌發(fā)過程中的根伸長和芽伸長結(jié)果以及不同濃度抗生素對種子萌發(fā)的抑制率見圖1。

從圖1A可知，與對照處理相比，四環(huán)素暴露劑量為4 mg·L－1時(shí)，能促進(jìn)小白菜種子的根伸長和芽伸長，且對根伸長的促進(jìn)作用達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）。16 mg·L－1四環(huán)素暴露也能促進(jìn)種子芽伸長，但極顯著抑制了種子根伸長。隨著暴露劑量增加，四環(huán)素對種子根伸長和芽伸長均表現(xiàn)出抑制作用，且抑制率與暴露劑量呈正相關(guān)。在最高濃度100 mg·L－1的四環(huán)素暴露下，小白菜種子根伸長的抑制率達(dá)到77.51%，芽伸長抑制率達(dá)到26.36%。圖1B顯示，環(huán)丙沙星暴露時(shí)，除1 mg·L－1的暴露劑量能促進(jìn)種子芽伸長外，在供試劑量下，環(huán)丙沙星對小白菜種子的萌發(fā)均表現(xiàn)出抑制作用，抑制率也與暴露劑量呈正相關(guān)性。高于4 mg·L－1的暴露劑量對種子的根伸長即表現(xiàn)出極顯著的抑制作用，最高50 mg·L－1環(huán)丙沙星暴露時(shí)，對根伸長的抑制率達(dá)到76.94%，對芽伸長的抑制率達(dá)到58.53%。

圖1 四環(huán)素（A）、環(huán)丙沙星（B）暴露下小白菜種子萌發(fā)的根伸長、芽伸長及其抑制率Figure 1 Root elongation，shoot elongation and their inhibition rates of Chinese cabbage seeds under the exposure of tetracycline（A）and ciprofloxacin（B）

2.2 抗生素暴露對小白菜幼苗生長的影響

用含有不同濃度四環(huán)素、環(huán)丙沙星的營養(yǎng)液分別培養(yǎng)小白菜幼苗，幼苗的株高、根長測量結(jié)果以及抗生素對其抑制率結(jié)果見圖2。

從圖2A可以看出，與對照處理相比，供試濃度的四環(huán)素暴露對小白菜幼苗的生長均表現(xiàn)出極顯著的抑制作用（P＜0.01），根長和株高均隨著暴露劑量的增加而下降，其抑制率分別達(dá)到33.54%～65.54%和23.46%～57.26%。同樣，環(huán)丙沙星暴露也抑制了小白菜幼苗的根長和株高（圖2B），抑制率隨著暴露劑量的增加普遍上升，最高50 mg·L-1環(huán)丙沙星對小白菜幼苗根長和株高的抑制率分別達(dá)到51.68%和70.11%。

2.3 抗生素暴露對小白菜幼苗中可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的影響

不同濃度四環(huán)素、環(huán)丙沙星暴露下，計(jì)數(shù)小白菜幼苗中總可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌及耐藥性內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量可知：無抗生素暴露時(shí)，植株中總內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量為1.14×105cfu·g-1；在供試四環(huán)素或環(huán)丙沙星暴露處理下，該數(shù)值分別減少到7.49×104～4.93×104cfu·g-1和8.45×104～4.57×104cfu·g-1。同時(shí)結(jié)果還顯示，四環(huán)素暴露下的植株中四環(huán)素耐藥內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量與對照處理相比均有所上升。環(huán)丙沙星暴露時(shí)，在1 mg·L-1的暴露劑量下，植株中環(huán)丙沙星耐藥內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量比對照處理有所降低，但隨著暴露劑量持續(xù)增加到50 mg·L-1，植株中環(huán)丙沙星耐藥內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量不斷上升，且均高于對照處理。進(jìn)一步比較抗生素暴露下幼苗中耐藥性內(nèi)生細(xì)菌占總可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的比例（圖3）可知，除1 mg·L-1環(huán)丙沙星處理的樣品之外，植株中四環(huán)素耐藥內(nèi)生細(xì)菌的比例從2.94%增加到13.10%（圖3A），環(huán)丙沙星耐藥內(nèi)生細(xì)菌的比例從10.40%增加到47.17%（圖3B），與對照處理相比均呈現(xiàn)極顯著性增加。

圖2 四環(huán)素（A）、環(huán)丙沙星（B）暴露下小白菜幼苗的根長、株高及其抑制率Figure 2 Root length，plant height and their inhibition rates of Chinese cabbage seedlings under the exposure of tetracycline（A）and ciprofloxacin（B）

3 討論

圖3 四環(huán)素（A）、環(huán)丙沙星（B）暴露下小白菜幼苗中耐藥性內(nèi)生細(xì)菌占總可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的比例Figure 3 Rates of antibiotic resistance endophytic bacteria of Chinese cabbage seedlings under the exposure of tetracycline（A）and ciprofloxacin（B）

本研究探討了不同劑量四環(huán)素、環(huán)丙沙星暴露對小白菜種子萌發(fā)及幼苗生長的影響。種子萌發(fā)過程中，4 mg·L-1四環(huán)素暴露促進(jìn)了種子的根伸長和芽伸長，說明低劑量抗生素處理對小白菜種子萌發(fā)具有促進(jìn)作用。魏子艷等[29]證實(shí)了低濃度的諾氟沙星和金霉素會(huì)促進(jìn)黃瓜種子芽的伸長；Migliore等[30-32]也發(fā)現(xiàn)低濃度恩諾沙星對黃瓜、生菜、豆、蘿卜的生長有促進(jìn)作用，這是由于低劑量抗生素暴露對植物生長有積極的興奮效應(yīng)。也有研究表明，環(huán)境中的低劑量抗生素提高了植物的應(yīng)激能力，植物體可以通過加強(qiáng)自身蛋白質(zhì)合成來提高抵抗抗生素迫害的能力[33]，從而表現(xiàn)出促生長現(xiàn)象。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，16 mg·L-1四環(huán)素或1 mg·L-1環(huán)丙沙星暴露僅能促進(jìn)種子的芽伸長，對根伸長卻表現(xiàn)出抑制作用。這可能是由于植物在較低含量的污染物脅迫下，當(dāng)根已經(jīng)受到毒害作用而表現(xiàn)出抑制時(shí)，芽的伸長還能夠從種子自身吸取養(yǎng)分而不被抑制[23]，隨后，當(dāng)抗生素暴露劑量繼續(xù)增加時(shí)，種子的根伸長和芽伸長均被持續(xù)抑制，且對根伸長的抑制效應(yīng)大于對芽伸長的抑制效應(yīng)。導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因一方面是由于抗生素對植物的生物毒性效應(yīng)[34]，另一方面是因?yàn)榉N子萌發(fā)時(shí)通過根部直接吸收抗生素，導(dǎo)致根部藥物積累而首先對根部生長產(chǎn)生脅迫，且隨著污染物含量的增加，污染物被根部吸收、運(yùn)輸?shù)椒N胚內(nèi)以后，就表現(xiàn)為抑制芽的伸長[23]。這與魏瑞成等[35]的研究結(jié)果相似。

進(jìn)一步比較四環(huán)素和環(huán)丙沙星對作物的生態(tài)毒性效應(yīng)發(fā)現(xiàn)，在作物受害程度相同的情況下（即小白菜根伸長抑制率達(dá)到50%），需要的四環(huán)素暴露劑量明顯高于環(huán)丙沙星，說明后者對作物的毒性要強(qiáng)于前者。已有研究證實(shí)，不同抗生素對同種蔬菜的生態(tài)毒性有很大差別。例如，魏子艷等[29]在研究金霉素、諾氟沙星和磺胺對甲氧嘧啶對黃瓜、油菜和小白菜種子根長和芽長的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，對于黃瓜，金霉素的毒性較強(qiáng)而諾氟沙星的毒害效應(yīng)相對較弱；對于油菜，則是磺胺對甲氧嘧啶的生態(tài)毒性相對較強(qiáng)。由于我國農(nóng)田土壤中普遍存在多種抗生素殘留[36]，應(yīng)針對蔬菜對不同抗生素的耐受程度差異，充分考慮土壤中糞肥施用和抗生素殘留情況，合理種植蔬菜，保障作物安全。

與抗生素暴露對種子萌發(fā)的影響類似，四環(huán)素、環(huán)丙沙星暴露均顯著抑制了小白菜幼苗的生長。這與林琳等[34]關(guān)于四環(huán)素污染對小白菜幼苗生長發(fā)育影響的研究結(jié)果相似，說明長時(shí)間抗生素污染對植物的生長發(fā)育產(chǎn)生了毒性。研究發(fā)現(xiàn)，污染環(huán)境下，植物對抗生素的吸收會(huì)降低其對葉酸的吸收，而葉酸與脫落酸和細(xì)胞分裂素前體嘌呤的合成有關(guān)[24，31]，因此抗生素污染會(huì)影響植物體正常的生長發(fā)育。本研究發(fā)現(xiàn)，不論四環(huán)素還是環(huán)丙沙星，藥物在某一暴露濃度下對小白菜幼苗根長的抑制率普遍高于對幼苗株高的抑制率。該現(xiàn)象與抗生素暴露對種子萌發(fā)的影響一致。作為植物重要的吸收和代謝器官，根系為植物的生長提供了充足的養(yǎng)分和水分，在抗生素污染脅迫下，藥物在根部蓄積量最多，僅小部分會(huì)在根上部分積累[37]，因此導(dǎo)致了藥物對植株根生長的抑制作用更為明顯。隨著抗生素暴露劑量的增加，對植物根長和株高的抑制作用也逐漸增強(qiáng)[23]。

進(jìn)一步分析抗生素暴露對小白菜幼苗中內(nèi)生細(xì)菌的影響發(fā)現(xiàn)，兩種抗生素暴露下植株中總可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量均有所下降，且降低的趨勢與抗生素暴露劑量的增加相對應(yīng)。由于本研究選擇的供試藥物四環(huán)素和環(huán)丙沙星均屬于殺菌效果較好的廣譜性抗生素[38-39]，其在環(huán)境中的殘留可以有效降低敏感細(xì)菌的數(shù)量。同時(shí)值得注意的是，除1 mg·L-1環(huán)丙沙星暴露外，本研究中隨著抗生素暴露劑量的增加，植株中耐藥性內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量也隨之上升，且耐藥菌占總可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的比例均極顯著高于無抗生素暴露的對照處理。據(jù)報(bào)道，環(huán)境中細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的方式主要有三種：細(xì)菌本身具有耐藥性；菌體發(fā)生突變或在外界環(huán)境條件誘導(dǎo)下產(chǎn)生耐藥性；通過耐藥基因水平轉(zhuǎn)移的方式使細(xì)菌獲得耐藥性[40-41]。由于本研究在無抗生素暴露的對照處理中也檢出了一定量的四環(huán)素和環(huán)丙沙星耐藥細(xì)菌，說明植株中的耐藥內(nèi)生細(xì)菌是自然存在的，但其數(shù)量仍少于抗生素暴露環(huán)境中檢出的耐藥菌數(shù)。

分析抗生素暴露下植物耐藥性內(nèi)生細(xì)菌數(shù)增加的可能原因：一方面是因?yàn)樗鄺l件下植物體更易于吸收環(huán)境中的抗生素，而植株中抗生素的積累為內(nèi)生細(xì)菌的生存提供了持續(xù)的選擇壓力，在環(huán)境誘導(dǎo)和選擇壓力作用下，耐藥性內(nèi)生細(xì)菌得以優(yōu)勢生長，因而在總內(nèi)生細(xì)菌中的比例顯著增加。Schmitt等[42]在研究不同濃度磺胺氯噠嗪對土壤微生物群落的抗性誘導(dǎo)效應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，與對照相比，藥物濃度升至7.3 mg·kg-1時(shí)，土壤微生物群落的抗性增長了10%。群落誘導(dǎo)抗性（Pollution-Induced Community Tolerance，PICT）理論[43]也認(rèn)為，微生物群落為了在抗生素等污染環(huán)境中繼續(xù)生存，會(huì)通過生理生化與遺傳特征的改變或以抗性類群代替敏感性類群的方式，使整個(gè)群落抗性產(chǎn)生并不斷提高。另一方面，植物內(nèi)生菌的研究表明，環(huán)境中的微生物可以通過植物根系進(jìn)入植株并定植在植物細(xì)胞中成為內(nèi)生細(xì)菌[44]。因此，分析本研究中耐藥內(nèi)生細(xì)菌的另一來源可能是抗生素暴露環(huán)境中的耐藥細(xì)菌，通過植物根系的吸收進(jìn)入植物體內(nèi)，從而導(dǎo)致植株中耐藥內(nèi)生細(xì)菌的比例顯著增加。例如，針對小麥內(nèi)生細(xì)菌的研究發(fā)現(xiàn)，土霉素耐藥菌Bacillus licheniformis在小麥的根際土壤和根、莖器官中均有分布，表明該菌株在小麥內(nèi)生系統(tǒng)中具有一定的傳播性，但其在小麥種子中并未分離得到[45]。本課題組前期研究施用雞糞（來自于使用抗生素的養(yǎng)殖場）對蔬菜內(nèi)生細(xì)菌的影響時(shí)也發(fā)現(xiàn)，經(jīng)常施用糞肥的菜地土壤以及芹菜、小白菜和黃瓜植株中的阿莫西林、卡那霉素、慶大霉素和頭孢氨芐耐藥性內(nèi)生細(xì)菌的比例均明顯高于不施用糞肥的對照樣品[46]。但是，關(guān)于耐藥細(xì)菌在環(huán)境-根際-植物系統(tǒng)中的遷移轉(zhuǎn)化過程仍需要進(jìn)一步的深入研究。

綜上所述，抗生素暴露不僅會(huì)抑制蔬菜的生長發(fā)育，而且可以導(dǎo)致植株中耐藥性內(nèi)生細(xì)菌的增加。目前，在全球范圍內(nèi)，細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生及其傳播已經(jīng)成為一個(gè)棘手的問題。尤其耐藥性病原菌感染人的病例日益增多，甚至某些“超級(jí)細(xì)菌”的感染已經(jīng)造成了“無藥可醫(yī)”的局面。考慮到蔬菜中的耐藥性內(nèi)生細(xì)菌會(huì)隨著食物鏈傳遞到人體，對人類健康構(gòu)成威脅，對此應(yīng)當(dāng)引起人們的關(guān)注。

4 結(jié)論

（1）4 mg·L-1四環(huán)素暴露能促進(jìn)小白菜種子萌發(fā)，高于4 mg·L-1的四環(huán)素和不同濃度環(huán)丙沙星暴露均抑制其萌發(fā)，且環(huán)丙沙星對作物的生態(tài)毒性效應(yīng)強(qiáng)于四環(huán)素。

（2）四環(huán)素、環(huán)丙沙星暴露均顯著抑制小白菜幼苗的生長，且對作物根生長的抑制作用更為明顯。

（3）除1 mg·L-1環(huán)丙沙星暴露外，四環(huán)素、環(huán)丙沙星暴露均顯著增加了小白菜中內(nèi)生耐藥細(xì)菌占總可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的比例，且與暴露劑量呈正相關(guān)性。

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Effects of antibiotic exposure on the growth and endophytic bacterial community of Chinese cabbage seedlings

WANG Pan-liang1,ZHANG Hao1,2,3*,WANG Rui-fei1,3,YANG Qing-xiang1,2,3,GONG Fu-li1,CHANG Fang-yuan1
（1.College of Life Sciences,Henan Normal University,Xinxiang 453007,China;2.School of Environment,Henan Normal University,Xinxiang 453007,China;3.Key Laboratory for Microorganisms and Functional Molecules（Henan Normal University）,University of Henan Province,Xinxiang 453007,China）

The effects of tetracycline and ciprofloxacin exposure on Chinese cabbage seed germination and seedling growth were assessed using hydroponic culture.Further,the effects of antibiotic exposure on antibiotic-resistant endophytic bacteria colonizing Chinese cabbage seedlings were evaluated through microbial cultivation.The results showed that ciprofloxacin and tetracycline at any concentration higher than 4 mg·L-1have inhibitory effects,and that these effects are more obvious at higher concentrations,on shoot and root elongation of Chinese cabbage seedlings,while tetracycline at a concentration of 4 mg·L-1promoted seed germination.At the seedling growth stage,the inhibitory effects on the root length and plant height of Chinese cabbage seedlings were strengthened with increase in the concentrations of both antibiotics.In addition,antibiotic exposure can significantly increase the abundance of corresponding resistant endophytic bacteria,which increase with an increase in the dosage of antibiotics,in vegetable seedlings.

antibiotic;vegetable;antibiotic-resistant endophytic bacteria;ecological toxicity

X171.5

A

1672-2043（2017）09-1734-07

10.11654/jaes.2017-0042

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2017－01－08

王盼亮（1991—），男，河南駐馬店人，碩士研究生，研究方向?yàn)榄h(huán)境微生物。E-mail：wangpl91@163.com

*通信作者：張 昊E-mail：kele1564@126.com

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（U1504219）；河南省科技攻關(guān)重點(diǎn)項(xiàng)目（142102210447）；河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研計(jì)劃項(xiàng)目（15A180016）

Project supported：The National Natural Science Foundation of China（U1504219）；The Key Science and Technology Project of Henan Province（142102210447）；The Key Research Program Plan of Henan Provincial Higher Institutions（15A180016）