乳制品中三聚氰胺的免疫親和凝膠柱檢測(cè)方法

齊玉杰，生威，王俊平，張燕，王碩

(天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457)

乳制品中三聚氰胺的免疫親和凝膠柱檢測(cè)方法

齊玉杰，生威，王俊平，張燕，王碩

(天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457)

為建立用于檢測(cè)乳制品中三聚氰胺的免疫親和凝膠柱檢測(cè)方法，本研究采用活化酯法制備三聚氰胺酶標(biāo)抗原，將三聚氰胺抗體、HRP抗體分別與溴化氰活化的瓊脂糖凝膠偶聯(lián)制備相應(yīng)的抗體膠作為檢測(cè)層和質(zhì)控層，方法檢測(cè)限為200 μg/L。選取牛奶、奶粉、發(fā)酵乳等乳制品進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)得所檢樣品中三聚氰胺的檢測(cè)限為1 mg/kg。該方法具有良好的特異性，除與環(huán)丙氨嗪存在一定的交叉反應(yīng)外，與其他3種結(jié)構(gòu)類似物和6種常用獸藥沒有交叉反應(yīng)。該檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果判斷容易，整個(gè)檢測(cè)過程約15 min，可用作三聚氰胺現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的有效手段。

免疫親和凝膠檢測(cè)柱；三聚氰胺；乳制品

0 引 言

三聚氰胺[1]，俗稱密胺、蛋白精，是一類重要的有機(jī)化工原料，在木材、塑料、造紙、紡織、皮革等行業(yè)有廣泛的應(yīng)用。由于其價(jià)格低廉被一些不法企業(yè)違規(guī)使用到食品中，以達(dá)到檢測(cè)中蛋白質(zhì)含量達(dá)標(biāo)或超標(biāo)的假象，導(dǎo)致人們食用后出現(xiàn)若干不良反應(yīng)，嚴(yán)重時(shí)甚至危及生命。2011年我國衛(wèi)生部聯(lián)合5個(gè)部門發(fā)布第10號(hào)公告，明確規(guī)定各類乳制品中三聚氰胺的限量值，凡是高于此標(biāo)準(zhǔn)的食品一概嚴(yán)禁銷售[2]。目前，檢測(cè)食品中三聚氰胺的方法有HPLC[3-5]、LC-MS/MS[6-8]、GC-MS[9]、拉曼光譜法[10-11]、ELISA[12]、膠體金免疫層析法[13-15]等。本研究建立的檢測(cè)食品中三聚氰胺的免疫親和凝膠檢測(cè)柱方法，具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速、結(jié)果可視化、定性半定量的特點(diǎn)，適用于大量樣品中三聚氰胺的現(xiàn)場(chǎng)初步篩查。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 儀器設(shè)備

超純水系統(tǒng)，蛋白純化儀，紫外分光光度計(jì)，磁力攪拌器，周轉(zhuǎn)式振搖器，旋渦混合器，冷凍離心機(jī)，真空泵，具砂板層析柱，無填料SPE小柱（1 mL），聚乙烯墊片。

1.2 藥品

三聚氰胺，環(huán)丙氨嗪，三聚氰酸，阿特拉津，呋喃它酮，諾氟沙星，磺胺喹惡啉，氯霉素，慶大霉素，四環(huán)素，辣根過氧化物酶（HRP），溴化氰活化的瓊脂糖凝膠，HRP抗體，三聚氰胺抗體。

1.3 常用溶液的配制

（1）偶聯(lián)緩沖液。準(zhǔn)確稱取7.3 g NaCl，2.1 g NaHCO3，加入250 mL超純水，用NaOH調(diào)pH至8.3。

（2）封閉液。稱取0.6 g甘氨酸，加入20 mL偶聯(lián)緩沖液溶解，放置4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）醋酸緩沖液。準(zhǔn)確稱取5.84 g NaCl，0.9 g CH3COONa，1.16 mL CH3COOH，加入200 mL超純水。

（4）溶脹酸液（濃度1 mmol/L的HCL）。量取0.5 mL濃度為1 mol/L鹽酸，加入500 mL超純水。

（5）底物顯色液（TMB-過氧化氫脲溶液）。

底物液A：稱取無水醋酸鈉4.1 g，β-環(huán)糊精1.25 g，檸檬酸1.58 g，過氧化氫脲214.5 mg，加超純水至500 mL，4℃保存，使用時(shí)需要事先恢復(fù)至室溫。

底物液B：稱取100 mg TMB，加入10 mL DMSO溶解，室溫避光保存。

使用前15 min混合：12.43 mL A溶液和0.075 mL B溶液。

（6）磷酸鹽緩沖溶液（PBS，濃度0.05 mol/L，pH 7.4）。 稱 取 Na2HPO4·12H2O 13.76 g，NaH2PO4·2H2O 1.794 g，NaCl 9.0 g，溶于1 000 mL超純水。

1.4 方法

1.4.1 酶標(biāo)抗原（MEL-HRP）的制備

三聚氰胺半抗原由本實(shí)驗(yàn)室提供，采用活化酯法與HRP偶聯(lián)制備酶標(biāo)抗原。具體操作：稱取三聚氰胺半抗原1.0 mg置于棕色瓶中，加入1.0 mg N-羥基琥珀酰亞胺（NHS），之后加入100 μL N，N-二甲基甲酰胺（DMF）使其溶解，再加入1.4 mg N,N-二環(huán)已基碳二亞胺（DCC），置于4℃條件下攪拌反應(yīng)20 h，這個(gè)過程中會(huì)出現(xiàn)渾濁，反應(yīng)結(jié)束后于4℃，4 500 r/min離心10 min，取上清液。取5.0 mg的HRP加入到2.0 mL的PBS緩沖溶液（濃度0.01 mol/L，pH=8.5）溶解，此為HRP蛋白溶液。然后將上清液在冰浴條件下逐滴緩慢加入到HRP蛋白溶液中，攪拌過夜。結(jié)束后取出反應(yīng)液用PBS緩沖溶液4℃透析3 d，收集透析后溶液加等體積甘油，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 免疫親和凝膠檢測(cè)柱的制備

（1）封閉膠的制備。稱取1.0 g溴化氰活化的瓊脂糖凝膠，加入80 mL濃度為1 mmol/L的HCl溶液于小燒杯中，用玻璃棒充分?jǐn)嚢枞芙?。先用約10 mL HCl溶液對(duì)具砂板層析柱進(jìn)行清洗，將溶脹充分的凝膠轉(zhuǎn)移其中，繼續(xù)用大概200 mL HCl溶液清洗凝膠，然后用約30 mL偶聯(lián)緩沖液沖洗凝膠。再加入9 mL甘氨酸封閉液，室溫下在定向搖床上振搖反應(yīng)2 h，反應(yīng)完后依次用偶聯(lián)緩沖液、醋酸緩沖液清洗3次，每次10 mL，最后再用偶聯(lián)緩沖液清洗一次。最后抽空，用約10 mL的PBS緩沖溶液將制備好的封閉膠重新懸起，加入3 μL的proclin 300抑菌素，置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）三聚氰胺抗體膠的制備。將三聚氰胺抗體與溴化氰活化的瓊脂糖凝膠偶聯(lián)制備抗體膠用作檢測(cè)層。具體步驟為稱取0.25 g溴化氰活化的瓊脂糖凝膠，加入40 mL濃度為1 mmol/L的HCl溶液于小燒杯中，用玻璃棒充分?jǐn)嚢枞芙?。先用約10 mL的HCl溶液對(duì)具砂板層析柱進(jìn)行清洗，將溶脹充分的凝膠轉(zhuǎn)移其中，繼續(xù)用大概200 mL的HCl溶液清洗凝膠，然后用約30 mL偶聯(lián)緩沖液沖洗凝膠。取0.5 mg三聚氰胺抗體，加入1～2 mL偶聯(lián)緩沖液進(jìn)行稀釋，混合均勻后轉(zhuǎn)移到柱子中，并于室溫振搖反應(yīng)2 h。然后用10～20 mL偶聯(lián)緩沖液清洗凝膠，以去除多余的抗體。再加入3.5 mL甘氨酸封閉液，室溫下在定向搖床上振搖反應(yīng)2 h。應(yīng)完后依次用偶聯(lián)緩沖液、醋酸緩沖液清洗3次，每次10 mL，最后再用偶聯(lián)緩沖液清洗一次。最后抽空，用約5 mL PBS緩沖溶液將制備好的抗體膠重新懸起，加入1.5 μL proclin 300抑菌素，置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）HRP抗體膠的制備。將HRP多克隆抗體與溴化氰活化的瓊脂糖凝膠偶聯(lián)制備HRP抗體膠用作質(zhì)控層。制備步驟同1.4.2.2三聚氰胺抗體膠的制備。

1.4.3 免疫親和凝膠檢測(cè)柱分析方法的建立

（1）三聚氰胺免疫親和凝膠檢測(cè)柱的組裝及檢測(cè)步驟。免疫親和凝膠檢測(cè)柱由上下兩部分組成，檢測(cè)層在上，質(zhì)控層在下，兩層之間有一個(gè)約2 mm的空氣隔層。將150 μL封閉膠按一定比例混合的HRP抗體膠由SPE小柱上部加入到底部的聚乙烯墊片上，用注射器瀝干緩沖液，加入第二個(gè)墊片，力度以緊密接觸凝膠且又不對(duì)其造成擠壓為宜。在距離下層墊片約2 mm處放置第三個(gè)聚乙烯墊片，將150 μL封閉膠按一定比例混合的三聚氰胺抗體膠加入到聚乙烯墊片上，用注射器瀝干緩沖液，最后固定第四個(gè)聚乙烯墊片，完成檢測(cè)柱的組裝。

檢測(cè)步驟：按上述方法組裝好檢測(cè)柱，用PBS緩沖溶液清洗兩次，每次清洗體積為1 mL。將PBS緩沖溶液按一定比例稀釋酶標(biāo)抗原與標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液，取1 mL混合溶液以1 mL/min的流速通過檢測(cè)柱。然后用3 mL的PBST緩沖溶液和2 mL PBS緩沖溶液清洗檢測(cè)柱，目的是除去干擾實(shí)驗(yàn)的殘留物。最后取300 μL底物溶液加入到檢測(cè)柱中，與檢測(cè)層和質(zhì)控層充分反應(yīng)30 s后推出，觀察4 min內(nèi)檢測(cè)柱上下層的顯色情況。

（2）三聚氰胺免疫親和凝膠檢測(cè)柱工作條件的優(yōu)化

①酶標(biāo)抗原最低稀釋比例的確定。從SPE柱的進(jìn)樣口加入150 μ L封閉膠到底部的聚乙烯墊片上，用注射器把緩沖液打出后放入第二個(gè)聚乙烯墊片。用PBS緩沖溶液對(duì)酶標(biāo)抗原進(jìn)行稀釋，稀釋比例分別為 1∶1 000，1∶5 000，1∶10 000，1∶50 000，1∶10 0000，1∶50 0000，取1 mL酶標(biāo)抗原溶液加入到檢測(cè)柱中，用注射器在1 min內(nèi)勻速排出，最后加入底物反應(yīng)30 s后排出，觀察4 min內(nèi)凝膠層的顏色變化，當(dāng)封閉膠無色時(shí)，說明沒有非特異性吸附，此時(shí)酶標(biāo)抗原的稀釋比例為其最低稀釋比例。

②抗體膠及酶標(biāo)抗原最佳稀釋比例的優(yōu)化。將三聚氰胺抗體膠和封閉膠分別按不同比例1∶4，1∶9，1∶19(體積比)進(jìn)行混合，酶標(biāo)抗原選取最低稀釋比例以上的幾組數(shù)據(jù)，兩者任意組合進(jìn)行優(yōu)化，按檢測(cè)步驟操作，觀察4 min內(nèi)檢測(cè)層的顏色變化，當(dāng)檢測(cè)層的藍(lán)色清晰且梯度明顯時(shí)，此時(shí)三聚氰胺抗體膠和酶標(biāo)抗原的稀釋比例分別為其最佳稀釋比例。

③HRP抗體膠最佳稀釋比例的優(yōu)化。在上述已確定的條件基礎(chǔ)上，將HRP抗體膠與封閉膠分別按不同比例1∶9，1∶49，1∶99，1∶149，1∶199(體積比)進(jìn)行混合，同上述檢測(cè)步驟，選擇與檢測(cè)層顯色一致時(shí)，HRP抗體膠稀釋比例為質(zhì)控層的最佳稀釋比例。

④樣品稀釋液的優(yōu)化。按優(yōu)化好的條件組裝檢測(cè)柱，分別用不同pH值（5.7，7.4，8.5）的PBS和PBST緩沖溶液稀釋三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)檢測(cè)柱分析，探究不同稀釋液對(duì)顯色情況及檢測(cè)限的影響，進(jìn)而選擇出最佳的樣品稀釋液。

（3）免疫親和凝膠檢測(cè)柱檢測(cè)限的確定。選擇上述已優(yōu)化確定的工作條件按要求組裝檢測(cè)柱，建立三聚氰胺免疫親和凝膠檢測(cè)柱分析方法，分別檢測(cè)不同濃度的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以目測(cè)檢測(cè)層顏色消失時(shí)，對(duì)應(yīng)的三聚氰胺的最低濃度定義為三聚氰胺免疫親和凝膠檢測(cè)柱分析方法的檢測(cè)限。

（4）免疫親和凝膠檢測(cè)柱特異性實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)選取環(huán)丙氨嗪、三聚氰酸、阿特拉津、三聚氯氰4種結(jié)構(gòu)類似物，以及呋喃它酮、諾氟沙星、磺胺喹惡啉、氯霉素、慶大霉素、四環(huán)素6種其他種類的獸藥進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)。

（5）免疫親和凝膠檢測(cè)柱實(shí)際樣品的檢測(cè)。

本實(shí)驗(yàn)選取牛奶、發(fā)酵乳和奶粉等乳制品進(jìn)行檢測(cè)，牛奶不需要經(jīng)過復(fù)雜的前處理，稀釋5倍即可直接用于檢測(cè)。發(fā)酵乳采用稀釋和離心的方法，具體步驟為取1 mL發(fā)酵乳，加入2 mL樣品稀釋液，高速漩渦混勻，10 000 r/min，4℃，離心10min，取上清液稀釋2.5倍后用于檢測(cè)。奶粉的具體處理步驟為稱取1 g奶粉，加入2.5 mL樣品稀釋液，高速漩渦混勻，10 000 r/min，4℃，離心10 min，取上清液稀釋2倍進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果和討論

2.1 工作條件的優(yōu)化

2.1.1 三聚氰胺抗體膠和酶標(biāo)抗原稀釋比例的優(yōu)化

為消除封閉膠的影響需要對(duì)酶標(biāo)抗原的稀釋比例進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)酶標(biāo)抗原的稀釋比例為1∶5 000，凝膠層不顯示藍(lán)色，表明此稀釋比例下，酶標(biāo)抗原與封閉膠之間沒有發(fā)生非特異吸附反應(yīng)，因而確定酶標(biāo)抗原的最低稀釋比例為1∶5 000，在此基礎(chǔ)上對(duì)三聚氰胺抗體膠和酶標(biāo)抗原的稀釋比例繼續(xù)進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如表1所示了。由表1可以看出，隨著酶標(biāo)抗原和抗體膠稀釋比例的增大，檢測(cè)層顏色也逐漸變淺。當(dāng)三聚氰胺抗體膠與封閉膠的混合比例為1∶4，酶標(biāo)抗原的稀釋比例為1∶10 000以及三聚氰胺抗體膠與封閉膠的混合比例為1∶9，酶標(biāo)抗原的稀釋比例為1∶5 000時(shí)，檢測(cè)層顯色適當(dāng)便于觀察，且前者較后者梯度更加明顯，檢測(cè)限更低。綜合考慮顯色情況、方法靈敏度，最終選擇三聚氰胺抗體膠與封閉膠的混合比例為1∶4，酶標(biāo)抗原的稀釋比例為1∶10 000。

表1 三聚氰胺抗體膠和酶標(biāo)抗原稀釋比例的優(yōu)化結(jié)果

2.1.2 HRP抗體膠最佳稀釋比例的優(yōu)化

在三聚氰胺抗體膠與酶標(biāo)抗原的稀釋比例確定的基礎(chǔ)上后，按照空白對(duì)照，質(zhì)控層與檢測(cè)層顏色保持一致的原則，優(yōu)化質(zhì)控層HRP抗體膠的稀釋比例。結(jié)果顯示，當(dāng)HRP抗體膠與封閉膠的混合比例為1∶149時(shí)，符合實(shí)驗(yàn)要求。圖1為質(zhì)控層和檢測(cè)層的優(yōu)化結(jié)果。

圖1 質(zhì)控層和檢測(cè)層優(yōu)化結(jié)果

2.1.3 樣品稀釋液的優(yōu)化

本研究分別選擇pH值為5.7，7.4，8.5的PBS緩沖溶液和PBST緩沖溶液稀釋三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品，質(zhì)量濃度為0和200 μg/L，以最優(yōu)工作條件組裝檢測(cè)柱進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖2和圖3所示。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)選擇pH值為5.7的PBST緩沖溶液時(shí)，此時(shí)檢測(cè)柱上下層顏色適中便于觀察，且三聚氰胺質(zhì)量濃度為200 μg/L，檢測(cè)柱上層消色。而當(dāng)選擇pH值為5.7和7.4的PBS緩沖溶液和pH值為7.4的PBST緩沖溶液，且當(dāng)三聚氰胺質(zhì)量濃度為200 μg/L時(shí)，檢測(cè)柱上層有輕微藍(lán)色，沒有完全消線。選擇pH值為8.5的PBS緩沖溶液和PBST緩沖溶液時(shí)，檢測(cè)柱整體顏色較淺，且三聚氰胺濃度為200 μg/L時(shí)，檢測(cè)柱上層藍(lán)色沒有完全消失。因而選擇pH值5.7的PBST溶液作為三聚氰胺免疫親和凝膠檢測(cè)柱的最佳樣品稀釋液。

圖2 不同pH值的PBS優(yōu)化結(jié)果

圖3 不同pH值的PBST優(yōu)化結(jié)果

2.2 三聚氰胺免疫親和凝膠檢測(cè)柱檢測(cè)限的確定

以最優(yōu)工作條件組裝檢測(cè)柱，依次加入三聚氰胺質(zhì)量濃度為0，50，100，200 μg/L；可以看出，當(dāng)三聚氰胺質(zhì)量濃度為200 μg/L時(shí)，檢測(cè)層上層的藍(lán)色完全消失，因此確定三聚氰胺免疫親和凝膠檢測(cè)柱的檢測(cè)限為200 μg/L（圖4）。從左至右依次為0 μg/L 50 μg/L 100 μg/L 200 μg/L

圖4 三聚氰胺免疫親和凝膠檢測(cè)柱方法檢測(cè)限

2.3 三聚氰胺免疫親和凝膠檢測(cè)柱特異性實(shí)驗(yàn)

本研究選擇4種三聚氰胺結(jié)構(gòu)類似物，分別為環(huán)丙氨嗪、三聚氰酸、阿特拉津、三聚氯氰，以及6種其他種類獸藥，分別為呋喃它酮、諾氟沙星、磺胺喹惡啉、氯霉素、慶大霉素、四環(huán)素進(jìn)行交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，其中三聚氰胺與環(huán)丙氨嗪的質(zhì)量濃度為200 μg/L，其他物質(zhì)的質(zhì)量濃度均為20 mg/L。由圖6可以看出，除與環(huán)丙氨嗪存在一定的交叉反應(yīng)外，與其他藥物均沒有交叉反應(yīng)，表明本實(shí)驗(yàn)所研制的檢測(cè)柱具有良好的特異性。

圖5 與結(jié)構(gòu)類似物和其他種類獸藥的交叉反應(yīng)

2.4 三聚氰胺免疫親和凝膠檢測(cè)柱實(shí)際樣品的檢測(cè)

本研究選取牛奶、發(fā)酵乳、奶粉等乳制品作為檢測(cè)樣品，按1.4.3.5對(duì)樣品進(jìn)行前處理，實(shí)驗(yàn)確定待測(cè)樣品經(jīng)5倍稀釋即可消除基質(zhì)影響，依次加入三聚氰胺濃度為0 mg/kg、1 mg/kg，由圖7可以看出，當(dāng)三聚氰胺濃度為1 mg/kg時(shí)，檢測(cè)柱上層的顏色完全消失，因此確定乳制品中三聚氰胺的檢測(cè)限為1 mg/kg。

圖6 乳制品中三聚氰胺的檢測(cè)限

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)研究建立乳制品中三聚氰胺的免疫親和凝膠檢測(cè)柱分析方法，方法檢測(cè)限為200 μg/L。該檢測(cè)柱具有良好的特異性，除與環(huán)丙氨嗪有一定的交叉反應(yīng)外，與其他結(jié)構(gòu)類似物和獸藥均沒有交叉反應(yīng)。針對(duì)乳制品中三聚氰胺的檢測(cè)限為1 mg/kg。本方法檢測(cè)快速，樣品前處理簡(jiǎn)單，結(jié)果易于判斷。牛奶樣品僅需稀釋就可直接檢測(cè)，用時(shí)少，約15 min即可完成整個(gè)樣品處理和檢測(cè)過程，適合乳制品中三聚氰胺的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，具有良好的應(yīng)用前景。

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Gel-based immunoaffinity test columnmethod for the detection of melamine in dairy products

QI Yujie,SHENG Wei,WANG Junping,ZHANG Yan,WANG Shuo

(Tianjin University of Science and Technology,College of Food Engineering and Biotechnology,Tianjin 300457，China)

A new gel-based immunoaffinity test column method for detecting melamine in the dairy productswas developed.MEL-HRPcon?jugatewas prepared using activated ester method.Melamine antibody and HRP antibody were coupled with the CNBr-activated agarose gel to prepare the test layer and control layer,respectively.The limit of detection(LOD)of this assay was 200 μg/L,and the LOD of melamine in dairy products was 1 mg/kg.The method has good specificity,it showed no cross-reactivity with the structural analogues and other veteri?nary drugsexcept cyromazine.This method is simple and easy to judge the result,the entire detection process can be finished within 15 min,which can be used as a usefull tool for the detection of melamine.

gel-based immunoaffinity test column;melamine;dairy products

TS252.7

A

1001-2230（2017）08-0047-04

2016-12-20

“十二五”科技支撐計(jì)劃(2013BAD18B11)；國家國際科技合作專項(xiàng)項(xiàng)目(2014DFR30350)。

齊玉杰（1990-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称钒踩珯z測(cè)。

王碩