豬瘟病毒強毒株SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR檢測方法的建立

張永英+馬騰壑+劉彥威+王慧真+朱美霞

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.13.040[HT9.]

摘要：為準確快速診斷豬瘟病毒（classical swine fever virus，簡稱CSFV）強毒，對GenBank已公布的CSFV 的基因組全序列進行分析，根據(jù)CSFV-5′NTR核苷酸序列設計1對特異的熒光定量引物，建立快速檢測豬瘟病毒強毒株SYBR Green-Ⅰ實時熒光定量PCR方法。結(jié)果表明，該法具有很好的敏感性，對豬瘟病毒最低檢出量為10拷 貝/μL；特異性強，與豬瘟兔化弱毒苗、偽狂犬病毒（簡稱PRV）、豬細小病毒（簡稱 PPV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（簡稱PRRSV）、圓環(huán)病毒組織苗（簡稱PCV2）沒有交叉反應；重復性好，變異系數(shù)（CV）為0.47%～1.36%。該方法可用于豬瘟病毒的快速檢測。

關鍵詞：豬瘟病毒；強毒株；SYBR GreenⅠ；定量PCR

中圖分類號： S852.65+1文獻標志碼： A[HK]

文章編號：1002-1302（2017）13-0142-02[HS）][HT9.SS]

[HJ1.2mm]

收稿日期：2016-03-15

基金項目：河北省邯鄲市科技局資助項目（編號：1422101047）。

作者簡介：張永英（1972—），女，河北衡水人，碩士，副教授，主要從事動物疾病防控研究。E-mail：1626074123@qq.com。[HJ]

[ZK）]

豬瘟（簡稱CSF），是由豬瘟病毒（classical swine fever virus，簡稱CSFV） 引起的豬的一種熱性、致死性、高度接觸性傳染病，是一種對豬危害性極大的傳染病[1]。目前我國將其定為一類傳染病，且已納入國家強制免疫計劃[2]。CSFV是單股正鏈RNA病毒，基因組大小約為12.3 kb。我國CSFV野毒株均屬于基因Ⅱ群，而C株屬于基因Ⅰ群，由于C株疫苗的廣泛使用，即使在實驗室檢測CSFV野毒感染時，也難以將兩者區(qū)分開。而且CSFV和牛病毒性腹瀉?。ê喎QBVDV）、綿羊邊界病毒（簡稱BDV）同屬，均能引起豬的感染，且存在血清學交叉反應，給CSF的鑒別診斷帶來了困難。因此，建立一種快捷、準確、靈敏的診斷方法，對有效控制和撲滅豬瘟是非常有必要的。

1材料與方法

1.1試驗材料

CSFV石門系強毒株、HCV兔化弱毒苗、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（簡稱PRRSV）、豬細小病毒滅活苗（簡稱PPV）、偽狂犬病毒滅活苗（簡稱PRV）、圓環(huán)病毒組織苗（簡稱PCV2）。由河北工程大學農(nóng)學院預防實驗室保存并提供。

SYBR Premi Ex Taq、Taq DNA 聚合酶、pMD18-T載體等均購自寶生物工程（大連）有限公司。小量質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收純化試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司。儀器主要有Bio-RAD Mini熒光定量PCR儀。

1.2引物的設計與合成

參照GenBank中公布的25株CSFV基因組進行比較分析，采用Primer Experss2.0軟件設計了1對特異性引物，上游引物為P1：5′-TTGGCATCATTGCATAAGGG-3′，下游引物為P2：5′-GATTACAACGCCATCTCTGTTACA-3′。引物由北京華大基因科技服務有限公司合成。

1.3病毒基因組總RNA的提取

參照Trizol試劑使用說明書提取樣品總RNA。

1.4反轉(zhuǎn)錄cDNA的合成

參照反轉(zhuǎn)錄酶 M-MuLV使用說明書合成 cDNA，反應產(chǎn)物于-20 ℃保存。20 μL反應體系：4 μL模板RNA、2 μL特異性引物P2 、6 μL DEPC水、4 μL 5×buffer、1 μL M-MuLV（200 U/μL）、1 μL RNA抑制劑、2 μL dNTPs，42 ℃水浴 90 min，70 ℃水浴10 min。

1.5標準品的制備

[JP2]反應結(jié)束后取cDNA產(chǎn)物進行電泳鑒定。回收大小為 548 bp 的目的條帶，純化后連接pMD18-T載體、轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)雙酶切和PCR鑒定為陽性的重組菌按試劑盒說明提取其DNA，D260 nm/D280 nm比值在1.8～2.0的陽性重組質(zhì)粒用于繪制標準曲線。根據(jù)D260 nm值計算質(zhì)粒濃度并換算成拷貝數(shù)，然后10倍稀釋成1.0×109～1.0×101拷貝/μL 9個梯度，分別以9個稀釋度為模板進行SYBR Green Ⅰ定量PCR檢測。并且判定在40個循環(huán)內(nèi)出現(xiàn)特異性擴增曲線的最低拷貝數(shù)。[JP]

1.6SYBR GreenⅠ定量PCR標準曲線的繪制

采用25 μL反應體系：SYBR Premix ExTaq（2×）12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板1.0 μL，用雙蒸水補足至25 μL。反應程序：95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 25 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)。反應結(jié)束后，采用軟件制作熔解曲線。當熒光定量PCR檢測結(jié)果有S形擴增曲線，判定待測樣品為陽性；如為一條直線，則判定樣品為陰性。

1.7敏感性試驗

[JP3]將陽性模板從1.0×109～1.0×101經(jīng)10倍系列稀釋的9個濃度梯度，各梯度稀釋液分別取1 μL作為模板，測定其敏感性。[JP]

1.8特異性試驗

SYBR Green Ⅰ實時熒光PCR擴增豬瘟病毒兔化弱毒疫苗株、石門強毒株、PRRSV、PCV2、PRV、PPV基因組。

1.9重復性試驗

將cDNA進行10倍系列稀釋，選3個稀釋度，每個稀釋度進行3次平行試驗，用SYBR GreenⅠ定量PCR檢測，根據(jù)CT值差異計算組內(nèi)變異系數(shù)（CV）。endprint

2結(jié)果與分析

2.1SYBR Green-Ⅰ實時熒光PCR確定病毒的Tm值

以石門毒株cDNA為模板，進行SYBR Green-Ⅰ實時熒光定量PCR，結(jié)果見圖1。判定標準：動力學曲線呈現(xiàn)指數(shù)擴增，陰性對照無擴增，Tm在83.5～84.5 ℃出現(xiàn)特異熒光信號時，判定為石門毒株（圖1）。

2.2熒光定量PCR標準曲線的建立

通過優(yōu)化熒光定量PCR反應條件和體系，繪制檢測豬瘟病毒的標準曲線（圖2）。結(jié)果顯示，石門病毒熒光定量PCR標準品濃度從109～101拷貝/μL具有很好的線性關系。

2.3特異性試驗

用建立的實時熒光定量PCR方法對豬瘟兔化弱毒苗、PRV、PPV、PRRSV、PCV2、CSFV進行檢測。結(jié)果顯示，根據(jù)判定標準，除CSFV為陽性外，其他檢測結(jié)果均為陰性（圖3）。

2.4敏感性試驗

利用石門病毒實時熒光定量PCR方法能檢測到最低極限濃度為10個拷貝/μL。

2.4重復性試驗

從表1可以看出，各濃度梯度CT變異系數(shù)在0.47%～1.36%之間。提示該定量PCR方法穩(wěn)定，重復性較好。

3結(jié)論與討論

SYBR Green Ⅰ染料實時熒光定量PCR法在核酸檢測方面與血清抗體中和試驗、間接ELISA等方法相比較，在敏感性、特異性、耗時等方面有許多優(yōu)點，且能區(qū)分病毒株和疫苗株。SYBR Green Ⅰ與所有的雙鏈DNA 相結(jié)合，不需要特別定制，通用性好，而且它不需要用到對人體有致癌危害的EB[3-4]。但是該方法易受引物二聚體或非特異性擴增產(chǎn)物干擾，對引物要求高[5-6]。為確保試驗，嚴格按定量PCR要求設計1對特異性引物，經(jīng)過反應體系優(yōu)化，熔解曲線測試和凝膠電泳驗證，結(jié)果顯示，熔解曲線為單一波峰，Tm值均一；凝膠電泳顯示，目的條帶都在同一位置，并無雜帶干擾。因此，證實該引物設計和反應體系完全符合試驗要求。

經(jīng)過陽性模板稀釋檢測證明，本試驗可以檢測到1×101 拷貝/μL的病毒模板，靈敏度較高。在特異性試驗中該方法與PRRSV、PPV、PRV、 PCV2、豬瘟兔化弱毒苗不存在交叉反應，說明該方法特異性強。本研究建立了豬瘟強毒株SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR快速檢測方法，為豬瘟病毒早期診斷奠定了基礎，提供了防控豬瘟的有效技術(shù)手段。

[HS2]參考文獻：[HJ1.3mm]

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