重組酶聚合酶擴(kuò)增結(jié)合橫向流體試紙條快速檢測人腺病毒

趙康辰 葛以躍 崔侖標(biāo) 陳銀 史智揚(yáng) 朱鳳才 周明浩

210009 南京，江蘇省疾病預(yù)防控制中心 國家衛(wèi)計(jì)委腸道病原微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

·技術(shù)方法·

重組酶聚合酶擴(kuò)增結(jié)合橫向流體試紙條快速檢測人腺病毒

趙康辰 葛以躍 崔侖標(biāo) 陳銀 史智揚(yáng) 朱鳳才 周明浩

210009 南京，江蘇省疾病預(yù)防控制中心 國家衛(wèi)計(jì)委腸道病原微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

目的建立一種快速、敏感的人腺病毒等溫核酸擴(kuò)增檢測方法。方法針對(duì)人腺病毒hexon基因保守區(qū)序列設(shè)計(jì)特異性重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)引物及探針、優(yōu)化反應(yīng)時(shí)間和溫度、用橫向流體試紙條(LFD)和毛細(xì)管電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，建立人腺病毒RPA-LFD快速檢測方法，評(píng)價(jià)該方法的敏感度和特異性并與Real-time PCR法比較。結(jié)果RPA-LFD方法檢測人腺病毒的最低檢出限為2 拷貝DNA分子/反應(yīng)，且與其他呼吸道病原無交叉反應(yīng)，臨床樣本檢測結(jié)果與Real-time PCR法一致性為100 %。結(jié)論建立的RPA-LFD方法具有敏感性、特異性高、快速且不需要昂貴的儀器設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，為人腺病毒快速檢測提供了新工具。

腺病毒(Adenovirus, ADV)是一種引起兒童與成人疾病的重要病原。迄今為止，共發(fā)現(xiàn)超過50種型別[1]，大約1/3與人類疾病相關(guān)[2]。其中，大部分與上、下呼吸道，腸道以及眼部感染有關(guān)。最近，一些基于哺乳動(dòng)物模型和人類惡性疾病的研究結(jié)果顯示腺病毒感染還可能導(dǎo)致人類腫瘤的發(fā)生[3-5]。

腺病毒感染很容易在人與人之間傳播?？焖佟⒏咝У脑\斷方法無疑有助于阻止疾病的蔓延。病毒分離作為確認(rèn)腺病毒感染的金標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)周期過長而且對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的操作要求較高。免疫學(xué)試驗(yàn)，例如直接免疫熒光法能夠快速檢測出病毒，但這種檢測方法也有著靈敏度較低且需要特異的抗血清的缺點(diǎn)。隨著分子檢測技術(shù)的發(fā)展，PCR與Real-time PCR技術(shù)逐漸作為一種快速、靈敏的診斷方法被用于腺病毒的分型和監(jiān)測[6-8]。然而，在實(shí)驗(yàn)條件有限的環(huán)境下，潛在的污染可能性和昂貴的儀器設(shè)備成為限制其現(xiàn)場應(yīng)用的瓶頸。新型的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)不需要熱循環(huán)儀便可檢測腺病毒。目前，一些用于檢測腺病毒的等溫?cái)U(kuò)增方法已經(jīng)被研發(fā)[9-11]。這些方法的建立全部基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)。本研究利用重組酶聚合酶擴(kuò)增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)方法，在短時(shí)間且較低的溫度下擴(kuò)增人腺病毒核酸，結(jié)合橫向流體試紙條(Lateral Flow Dipstick，LFD)判讀結(jié)果，以滿足其現(xiàn)場檢測的需求。

1 材料與方法

1.1毒株和臨床樣本199份臨床樣本收集于2004年至2013年間，其中包括176份咽拭子和23份結(jié)膜拭子。199份樣本中共分離16株腺病毒毒株，其中包括： ADV-3型7株，ADV-7型5株，ADV-11型3株，ADV-55型1株。用于評(píng)價(jià)試驗(yàn)特異性的陽性樣本或毒株包括：肺炎衣原體、肺炎支原體、軍團(tuán)菌、流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、腦膜炎奈瑟菌、人博卡病毒和單純皰疹病毒。以上毒株和陽性樣本均由本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定并與臨床樣本一同凍存于-70 ℃。

1.2儀器與試劑pMD19-T Vector和MiniBEST Plasmid Purification Kit購自TaKaRa公司，TwistAmp nfo kit購自twistDX公司，QIAquick PCR Purification Kit、QIAamp? MinElute? Virus Spin Kit、QIAxcel毛細(xì)管電泳儀及其配套試劑購自QIAgen公司，LightCycler Real-time PCR儀購自Roche公司，封閉式LFD核酸檢測裝置購自杭州優(yōu)思達(dá)生物技術(shù)公司。3130測序儀購自ABI公司。

1.3引物與探針的設(shè)計(jì)、篩選按照TwistAmp nfo kit說明書基于腺病毒hexon基因保守區(qū)序列設(shè)計(jì)RPA的引物及探針，并在正向引物的5’端標(biāo)記生物素，探針的5’端標(biāo)記異硫氰酸熒光素(FITC)，中間標(biāo)記四氫呋喃(THF)，3’端標(biāo)記C3間隔(SpC3)。以上引物和探針的合成均由上海生工生物有限公司完成。選擇5套引物并通過2%的瓊脂糖電泳進(jìn)行篩選，確定一套引物后再以相似的方法篩選探針。選擇瓊脂糖電泳中目的條帶最亮的一組用于RPA檢測。

1.4標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的制備與核酸提取將ADV hexon基因的擴(kuò)增產(chǎn)物連接至T載體，使用TaKaRa pMD19-T Vector 試劑盒制備質(zhì)粒。按照TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit說明書提取質(zhì)粒，在波長260 nm處測定濃度，并將其換算為靶基因的拷貝數(shù)[12]。質(zhì)粒純化后用于優(yōu)化RPA方法。根據(jù)QIAamp? MinElute? Virus Spin Kit操作說明提取毒株及臨床樣本核酸，最終洗脫體積50 μl，凍存于-70 ℃。

1.5Real-timePCR方法根據(jù)文獻(xiàn)[7]設(shè)計(jì)Real-time PCR方法檢測腺病毒。使用Premix Ex Taq Kit配制體系，體系包含10 μl 2×PCR buffer，200 nmol/L引物混合液，100 nmol/L探針混合液，2 μl模板DNA，總體系為20 μl。使用LightCycler Real-time PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：95°C，30 s； 95°C，5 s，56°C，20 s擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。

1.6RPA反應(yīng)體系根據(jù)TwistAmp nfo kit試劑盒說明書配制50 μl反應(yīng)體系，其中包括420 nmol/L引物，120 nmol/L探針以及1×rehydration buffer。向裝有試劑干粉的反應(yīng)管中加入上述混合液和2 μl模板DNA，并將2.5 μl醋酸鎂(MgOAc, 280 mmol/L)加入管蓋內(nèi)側(cè)，蓋上管蓋，短暫混勻、離心使醋酸鎂滑落管中與擴(kuò)增試劑混合，放入加熱器中孵育。

1.7RPA產(chǎn)物分析使用橫向流體試紙條和高分辨率毛細(xì)管電泳檢測RPA產(chǎn)物。其中用于毛細(xì)管電泳檢測的擴(kuò)增產(chǎn)物按照QIAquick PCR Purification Kit說明書純化后，通過QIAxcel毛細(xì)管電泳儀分析擴(kuò)增結(jié)果。電泳程序設(shè)定為DM400，alignment markers 選擇QX 15-bp/3-kb。

1.8RPA-LFD方法優(yōu)化以1 000 拷貝的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA作為模板，設(shè)定反應(yīng)時(shí)間為15 min，根據(jù)檢測結(jié)果從37 ℃、39 ℃、42 ℃中選擇最佳反應(yīng)溫度。測試不同反應(yīng)時(shí)間(5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min)對(duì)RPA法檢測結(jié)果的影響，并選擇最佳反應(yīng)時(shí)間。

1.9RPA方法的敏感度和特異性將質(zhì)粒10倍稀釋為1×100～1×104拷貝/ μl用以進(jìn)行敏感度實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以建立的方法對(duì)16株腺病毒毒株和肺炎衣原體、肺炎支原體、軍團(tuán)菌、流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、腦膜炎奈瑟菌、人博卡病毒、單純皰疹病毒陽性樣本或毒株進(jìn)行檢測評(píng)價(jià)RPA-LFD方法的特異性。

1.10RPA-LFD方法檢測臨床樣本以患有急性呼吸道感染或結(jié)膜炎的兒童中采集到的176份咽拭子樣本及23份結(jié)膜拭子樣本提取的核酸作為模板，同時(shí)使用Real-time PCR 和本研究建立的RPA-LFD方法的進(jìn)行檢測，比較檢測結(jié)果的一致性。根據(jù)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)腺病毒測序引物[13]，對(duì)檢出的陽性樣本進(jìn)行擴(kuò)增，標(biāo)記純化后使用3130測序儀檢測核酸序列并于GeneBank中進(jìn)行比對(duì)以確定是否為腺病毒。

2 結(jié)果

2.1RPA引物和探針按照上文提出的方法，篩選出一套引物和探針，正向引物ADV-RPA-F:biotin-GCTCATTGGAACAACTGCCGTAAATAGTGT，反向引物ADV-RPA-R：GGCCGAGAACGGTGTACGCAGGTAGACTGTC，探針ADV-RPA-P:FITC-CTCGATGACGCCGCGGTGTGGCTGGTGCAC-THF-CTGACCACGTCGAAGA(SpC3)，以JS201501(GenBank: KX289874.1)作為參考毒株，正向引物、反向引物和探針分別位于基因組的：20761～20790、21025～21055、20979～21025位核苷酸。使用這套引物經(jīng)RPA擴(kuò)增后將產(chǎn)生片段大小為295 bp的產(chǎn)物。

2.2RPA-LFD檢測方法的優(yōu)化RPA-LFD擴(kuò)增結(jié)果顯示不同的擴(kuò)增溫度對(duì)擴(kuò)增結(jié)果無明顯影響。因此，選擇37 ℃作為RPA方法的反應(yīng)溫度。反應(yīng)開始5 min后便可通過流體試紙條檢測到擴(kuò)增信號(hào)。不同反應(yīng)時(shí)間(5 min、10 min、15 min、20 min、25 min)對(duì)RPA法擴(kuò)增信號(hào)強(qiáng)度差別不大，但反應(yīng)時(shí)間達(dá)30 min時(shí)陰性對(duì)照出現(xiàn)假陽性結(jié)果，為避免RPA檢測中出現(xiàn)假陽性結(jié)果，將反應(yīng)時(shí)間設(shè)置在20 min。

2.3RPA-LFD檢測方法的敏感性通過檢測2～20 000 拷貝的質(zhì)粒DNA確定RPA-LFD方法的檢出限，使用LFD與毛細(xì)管電泳分別檢測反應(yīng)產(chǎn)物。兩種方法的檢出限均能達(dá)到2拷貝DNA分子/反應(yīng)。(圖1)

1-5:人腺病毒質(zhì)粒， DNA拷貝數(shù)分別為2×104～2×100 拷貝；N:陰性對(duì)照M: DNA marker 100 bp～2.5 kb圖1 LFD(A)和 毛細(xì)管電泳(B)檢測的RPA敏感性Fig.1 Sensitivity detection by LED(A) and capillary electrophoresis (B)of RPA assay1-5∶2×104 -2×100 copies for ADV；N: No template control;M:DNA marker 100 bp-2.5kb

2.4RPA-LFD檢測方法的特異性16株人腺病毒毒株的反應(yīng)管均出現(xiàn)陽性反應(yīng)，其他病原包括：肺炎衣原體、肺炎支原體、軍團(tuán)菌、流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、腦膜炎奈瑟菌、人博卡病毒和單純皰疹病毒均為陰性反應(yīng)(圖2A)，與毛細(xì)管電泳結(jié)果一致(圖2B),表明RPA-LFD方法具有高特異性。

N.陰性對(duì)照；1.肺炎衣原體;2.肺炎支原體;3.軍團(tuán)菌;4.流感嗜血桿菌;5.肺炎鏈球菌;6.腦膜炎奈瑟菌;7.人博卡病毒;8.單純皰疹病毒;9.人腺病毒 M.DNAmarker 100 bp～2.5 kb圖2 LFD和.毛細(xì)管電泳檢測的RPA特異性實(shí)驗(yàn)N.No template control,1. Chlamydia pneumoniae，2. Mycoplasma pneumoniae，3. Legionella pneumophila，4. Haemophilus influenzae，5.Streptococcus pneumoniae，6.Neisseria meningitidis，7.Human bocavirus，8. Herpes Simplex Virus，9. Human adenovirus, M.DNA marker 100 bp-2.5 kbFig.2 Specificity detection by LFD (A) and capillary electrophoresis (B) of RPA assay

2.5RPA-LFD與Real-timePCR方法的一致性199份臨床樣本同時(shí)以Real-time PCR 和RPA-LFD方法的進(jìn)行檢測，其中Real-time PCR以Ct值小于35判讀為陽性。結(jié)果如表1所示，16份咽拭子樣本和19份結(jié)膜拭子樣本經(jīng)Real-time PCR方法檢測結(jié)果呈陽性，與RPA-LFD方法檢測結(jié)果完全一致。經(jīng)3130測序儀測序鑒定此35份陽性樣本均為腺病毒。

3 討論

ADV是一種引起兒童與成人急性呼吸道感染的重要病原。其癥狀與其他病原引起的呼吸道感染癥狀極為相似，臨床上難以區(qū)分。因此，敏感、快速、特異的腺病毒檢測方法將為臨床診斷提供重要依據(jù)，尤其是在發(fā)展中國家，能起到防止藥物濫用，限制疾病傳播的作用。本項(xiàng)研究將RPA與LFD相結(jié)合，建立了一種新型人腺病毒分子檢測方法。RPA法的反應(yīng)溫度相對(duì)較低(37 ℃～42 ℃)，且不需要熱循環(huán)儀，一臺(tái)水浴裝置即可完成擴(kuò)增反應(yīng)。另一方面，通過封閉式LFD檢測裝置判讀結(jié)果可有效避免交叉污染[14-15]。這些特點(diǎn)讓該方法擺脫了對(duì)價(jià)格昂貴的擴(kuò)增儀器的依賴，更適合用于現(xiàn)場快速檢測。

表1 RPA-LFD方法與Real-time PCR方法檢測結(jié)果比較

目前，基于LAMP技術(shù)建立的人腺病毒等溫?cái)U(kuò)增檢測方法的檢測時(shí)間為45～60 min[9-11]。與之相比，RPA-LFD方法的檢測時(shí)間更短，從反應(yīng)開始到完成結(jié)果判讀僅需25 min(20 min RPA反應(yīng)，5 min LFD結(jié)果判讀)。LAMP法需要6條引物而RPA-LFD法僅僅只需要3條引物。以往的研究表明，RPA方法的敏感性與LAMP方法相同，但特異性較高[16]。本研究建立的RPA-LFD方法檢測人腺病毒與Real-time PCR方法具有相同的敏感性。且RPA-LFD方法能夠準(zhǔn)確的檢測出16株腺病毒毒株和35份拭子標(biāo)本也表明該方法具有較高的特異性。值得一提的是，ADV的血清型多達(dá)50種，現(xiàn)階段很難設(shè)計(jì)出針對(duì)所有血清型的引物。雖然，我們成功地檢測出所有經(jīng)Real-time PCR方法鑒定的陽性標(biāo)本，但將RPA-LFD方法作為檢測ADV的常規(guī)檢測手段之前，仍需測試更多不同血清型的臨床標(biāo)本。

當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過30 min時(shí)會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，這可能是由于反應(yīng)時(shí)間超過30 min后RPA反應(yīng)體系中的結(jié)合蛋白與引物形成復(fù)合物所致。盡管如此，我們將反應(yīng)時(shí)間設(shè)定在20 min內(nèi)可準(zhǔn)確的檢測出所有陽性臨床樣本。

綜上所述，本研究結(jié)合重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)與流體試紙條建立了一種快速、敏感的人腺病毒感染檢測方法，為人腺病毒現(xiàn)場快速檢測提供了新工具。

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Rapiddetectionofhumanadenovirusbyrecombinasepolymeraseamplificationassayandlateralflowdipstick

ZhaoKangchen,GeYiyue,CuiLunbiao,ChengYin,ShiZhiyang,ZhuFengcai,ZhouMinghao

KeyLaboratoriesofEntericPathogenicMicrobiologyofNationalHealthandFamilyPlanningCommission,JiangsuProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Nanjing210009,China

CuiLunbiao,Email:lbcui@jscdc.cn

ObjectiveTo establish a rapid and sensitive isothermal amplification assay for the detection of human Adenovirus.MethodsPrimers and probe used for recombinase polymerase amplification(RPA)were designed based on the conserved region of the adenoviruses hexon gene. After optimizing the reaction temperature and times, the products of RPA were detected by capillary electrophoresis and lateral flow dipstick(LFD). Sensitivity and specicity of the assay were evaluated. The diagnostic value of the RPA-LFD assay was verified using clinical samples which were simultaneously tested by real time PCR assay.ResultsThe analytical sensitivity of RPA-LFD assay was 2 copies DNA molecules per reaction and no cross reaction with other pathogens was observed. Compared with real-time PCR assay, the sensitivity, and specificity of the present assay were all 100%.ConclusionsThe RPA-LFD assay developed in this study has the characteristics of high specificity, sensitivity, rapid and no requirement of expensive equipment which provided a new tool for rapid detection of human adenovirus.

Adenovirus; Rapid detection; Recombinase polymerase amplification; Lateral flow dipstick

腺病毒；快速檢測；重組酶聚合酶擴(kuò)增；橫向流體試紙條

2017-05-18)

(本文編輯：唐瀏英)

崔侖標(biāo)，Email: lbcui@jscdc.cn

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.04.018

江蘇省重大新發(fā)傳染病綜合防控科技示范工程(BE2015714)；江蘇省科技強(qiáng)衛(wèi)重點(diǎn)學(xué)科(ZDXKA2016008)

Fundprograms: Jiangsu Province Science & Technology Demonstration Project for Emerging Infectious Diseases Control and Prevention (BE2015714);Jiangsu Provincial Key Medical Discipline (ZDXKA2016008)