深圳市H5N6、H7N9流感病毒HA-UTR基因分子特征分析

陳燕慈 王昕 彭博 武偉華 劉慧 耿藝介 鄭青 房師松

510632 廣州，暨南大學(xué)藥學(xué)院(陳燕慈、鄭青)； 518055 深圳市疾病預(yù)防控制中心(王昕、彭博、武偉華、劉慧、耿藝介、房師松)

·論著·

深圳市H5N6、H7N9流感病毒HA-UTR基因分子特征分析

陳燕慈 王昕 彭博 武偉華 劉慧 耿藝介 鄭青 房師松

510632 廣州，暨南大學(xué)藥學(xué)院(陳燕慈、鄭青)； 518055 深圳市疾病預(yù)防控制中心(王昕、彭博、武偉華、劉慧、耿藝介、房師松)

目的了解深圳市H5N6、H7N9流感病毒HA基因非翻譯區(qū)(Untranslated region, UTR)的分子特征。方法使用MEGA7.0、DNAStar7.1.0等生物信息學(xué)分析軟件對(duì)全球及深圳H5N6、H7N9流感病毒HA基因的UTR進(jìn)行核苷酸序列同源性分析及基因多態(tài)性分析。結(jié)果3株2014—2015年深圳市H5N6病毒與其他H5NX病毒株比較， HA-3’UTR核苷酸同源性為77.4%～100%，H5N6-HA-3’UTR未見(jiàn)明顯突變位點(diǎn)；HA-5’UTR核苷酸同源性為91.7%～100%，H5N6-HA-5’UTR第24、31位發(fā)生突變。11株2013—2014年深圳市H7N9病毒與其他H7NX病毒株比較，HA-5’UTR核苷酸同源性為81.2%～100%，H7N9-HA-5’UTR在第2～6、9、10、12及15～17位發(fā)生多位點(diǎn)突變。結(jié)論深圳市人感染H5N6及H7N9病毒HA的UTR保守區(qū)高度同源性及其可變區(qū)具有基因多態(tài)性。

Fundprogram: Shenzhen Health Care System Research Project(201602002)

禽類(lèi)被認(rèn)為是H5N6、H7N9等禽甲型流感病毒(Avian influenza A viruses)的天然宿主。2013年2月，我國(guó)上海市出現(xiàn)首例人感染H7N9病例[1]；2014年5月，我國(guó)四川出現(xiàn)首例人感染H5N6病毒案例[2]，禽流感病毒的跨物種傳播引起全球的關(guān)注，越來(lái)越多的研究表明禽流感病毒的跨物種傳播與病毒基因突變有密切關(guān)系。

禽流感病毒的血凝素(Hemagglutinin, HA)在病毒與宿主細(xì)胞受體結(jié)合、啟動(dòng)病毒感染過(guò)程中起重要作用。HA全基因長(zhǎng)約1 778 nt，其包含翻譯區(qū)及19～58 nt的非翻譯區(qū)(Untranslated region, UTR)，UTR可根據(jù)其突變率的不同分為保守區(qū)與可變區(qū)[3]。已有研究表明[4]，HA基因的3’、5’UTR可變區(qū)和相鄰的部分ORF區(qū)共同構(gòu)成流感病毒片段特異性的核酸序列，影響子代病毒的包裝。本文研究禽流感病毒的HA-UTR的基因特征，通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，了解近年來(lái)深圳市人感染H5N6及H7N9病毒與其他同分支病毒的同源性，對(duì)其進(jìn)化過(guò)程有更直觀的了解；通過(guò)核苷酸突變位點(diǎn)比較，試圖分析近年來(lái)深圳地區(qū)人感染H5N6、H7N9禽流感病毒的可變區(qū)的分子特征，為進(jìn)一步探討流感病毒在持續(xù)進(jìn)化過(guò)程中，UTR可變區(qū)分子特異性與流感病毒轉(zhuǎn)錄、包裝之間的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1序列來(lái)源3株人源性H5N6甲型流感病毒[A/ShenZhen/1/2014(H5N6)、A/ShenZhen/ 2/2014(H5N6)、A/ShenZhen/1/2015(H5N6)]及11株人源性H7N9甲型流感病毒[A/ShenZhen/ 1/2013(H7N9)至A/ShenZhen/ 6/2013(H7N9)、A/ShenZhen/ 16/2013(H7N9)、A/ShenZhen/ 17/2013(H7N9)和A/ShenZhen/ 1/2014(H7N9)至A/ShenZhen/ 3/2014(H7N9)]數(shù)據(jù)由深圳市疾病預(yù)防控制中心提供。深圳市流感毒株均為深圳市疾病預(yù)防控制中心日常監(jiān)測(cè)所得，流感毒株提取病毒RNA后，送由華大基因公司進(jìn)行二代全基因測(cè)序(RT-PCR使用通用引物：上游引物Uni12和下游引物Uni13[5])。其中，H7N9流感病毒HA-3’UTR未能按預(yù)期測(cè)出。81株全球范圍H5NX甲型流感病毒的HA-3’UTR序列；63株全球范圍H5NX甲型流感病毒的HA-5’UTR序列；34株全球范圍H7NX甲型流感病毒的HA-5’UTR序列從NCBI-Influenza virus database中獲取，在數(shù)據(jù)庫(kù)中根據(jù)流感病毒序列完整性(是否含UTR區(qū)域)、宿主、地域及年份等特征篩選出具有代表性序列。NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)上傳的甲型流感病毒序列大都采用通用引物Uni12及Uni13以雙向測(cè)序法對(duì)序列進(jìn)行通測(cè)，確保序列UTR的完整性及真實(shí)性。由于測(cè)序技術(shù)不斷發(fā)展，數(shù)據(jù)庫(kù)中不同年份及地域的UTR序列的準(zhǔn)確性會(huì)受到一定的影響。

1.2系統(tǒng)進(jìn)化分析使用生物信息分析軟件MEGA7.0 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) 中的最大似然法(Maximum likehood, ML)對(duì)上述的H5N6及H7N9病毒株HA基因的3’ UTR基因序列、5’UTR基因序列分別構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(1 000 Bootstrap Replications)。

1.3變異分析使用DNAStar7.1.0的MegAlign分別對(duì)構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)的基因序列進(jìn)行核苷酸同源性分析。并對(duì)親緣性較近的序列進(jìn)一步進(jìn)行核苷酸位點(diǎn)多態(tài)性分析，構(gòu)建核苷酸突變位點(diǎn)表。

2 結(jié)果

2.1H5N6及H7N9HA-UTR系統(tǒng)進(jìn)化分析甲型流感病毒H5NX及H7NX-HA-UTR序列長(zhǎng)度在30～50 nt之間；各H5及H7亞型中HA-UTR序列同源性較高，其同源性達(dá)70%～100%。深圳市人感染H5N6及H7N9流感病毒株HA-UTR核苷酸序列進(jìn)化分析見(jiàn)圖1～3。深圳市H5N6病毒HA-3’UTR核苷酸序列位于H5N1及H5N6亞型中，深圳H5N6病毒HA-5’UTR核苷酸序列位于H5N6及H5NX亞型中。深圳H7N9病毒HA-5’UTR核苷酸序列位于H7N9亞型中。甲型流感病毒H5NX及H7NX-HA-UTR序列基本特征見(jiàn)表1。

表1 H5及H7亞型流感病毒HA-UTR基本特征

注：—：無(wú)序列信息

Note:—: No sequence information

2.2H5N6及H7N9HA-UTR核苷酸變異分析選取H5及H7亞型HA-UTR進(jìn)化距離相同的亞型序列進(jìn)行核苷酸變異位點(diǎn)分析，各序列突變位點(diǎn)、突變對(duì)比及突變率可見(jiàn)表2。

?表示深圳H5N6病毒圖1 H5NX病毒HA-3’ UTR核苷酸序列進(jìn)化分析? indicates H5N6 viruses in ShenzhenFig.1 Phylogenetic analysis of HA -3’ UTR from H5NX influenza viruses

?表示深圳H5N6病毒圖2 H5NX病毒HA-5’ UTR核苷酸序列進(jìn)化分析? indicates H5N6 viruses in ShenzhenFig.2 Phylogenetic analysis of HA -5’ UTR from H5NX influenza viruses

3 討論

近年來(lái)我國(guó)出現(xiàn)的人感染H5N6、H7N9新型流感病毒大都以H9N2病毒內(nèi)部基因?yàn)楣羌?，HA基因通過(guò)不斷地變異發(fā)展成不同亞型的重組病毒，造成新型流感病毒在人類(lèi)和禽類(lèi)中廣泛的流行和暴發(fā)[1，6]。研究表明[7]，甲型流感病毒UTR 3’端的12個(gè)核苷酸和5’端的13個(gè)核苷酸高度保守，共同形成了流感病毒的vRNA啟動(dòng)子。此外，3’端和5’端UTR核苷酸部分互補(bǔ)，形成首尾相連的莖-環(huán)狀結(jié)構(gòu)，起結(jié)合及固定RNA聚合酶復(fù)合體(RdRp)的作用[8]。流感病毒的啟動(dòng)子通過(guò)與病毒RdRp協(xié)同作用完成病毒RNA的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制。片段特異性的UTR可變區(qū)和部分ORF區(qū)域，共同構(gòu)成流感病毒子代病毒的包裝信號(hào)區(qū)域[4]。目前，已有研究發(fā)現(xiàn)將高致病性禽流感病毒A/Vietnam/1194/2004(H5N1)病毒PB1基因3’UTR第4位核苷酸由C4突變?yōu)閁4的重組病毒能增強(qiáng)RdRp的轉(zhuǎn)錄活性[9]；NA-3’UTR-U4流感突變株能顯著提高NA-mRNA的合成水平，提示其能增強(qiáng)對(duì)RdRp進(jìn)行識(shí)別與定位作用，促進(jìn)病毒蛋白的轉(zhuǎn)錄[10]。然而，流感病毒HA-UTR區(qū)域具有堿基多態(tài)性的核苷酸位點(diǎn)的功能性研究尚未多見(jiàn)。

2014—2015年間深圳市人感染H5N6病毒中，僅A/Shenzhen/1/2015(H5N6)的HA-3’UTR序列第10～12位由3’-CGU-5’突變?yōu)?’-UCG-5’；所有深圳市人感染H5N6的HA-5’UTR序列第24位均由C突變?yōu)閁。2013—2014年深圳市人感染H7N9病毒HA-5’UTR序列的主要突變?yōu)辄c(diǎn)位第2～6、9、10、12及15～17位，上述突變位點(diǎn)的突變率明顯高于同期監(jiān)測(cè)的HA-UTR序列均達(dá)到47.2%。深圳市H7N9病毒HA-5’UTR核苷酸序列間差異小，同源性高，提示在2013—2014年間監(jiān)測(cè)的市內(nèi)H7N9病毒HA-UTR尚未發(fā)生基因重組及變異。本研究系統(tǒng)地分析2013—2015年間深圳市人感染H5N6及H7N9流感病毒HA-UTR序列堿基多態(tài)性，根據(jù)前述流感病毒片段特異性的UTR可變區(qū)與流感子代病毒的復(fù)制包裝關(guān)系，本文為進(jìn)一步研究人感染H5N6及H7N9病毒HA-UTR的基因型-表型關(guān)系，闡明子代病毒轉(zhuǎn)錄復(fù)制、包裝的機(jī)制及UTR可變區(qū)核苷酸位點(diǎn)突變對(duì)病毒進(jìn)化的影響提供了一定的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

表2 H5及H7亞型流感病毒HA-UTR突變位點(diǎn)特征

注：—：無(wú)序列信息

Note:—: No sequence information

▲表示深圳H7N9病毒圖3 H7NX病毒HA-5’ UTR核苷酸序列進(jìn)化分析▲ indicates H7N9 viruses in ShenzhenFig.3 Phylogenetic analysis of HA -5’ UTR from H7NX influenza viruses

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Molecularcharacteristicsoftheuntranslatedsegment-specificregionofthehemagglutininsegmentsinH5N6andH7N9influenzavirusesinShenzhen

ChenYanci,WangXin,PengBo,WuWeihua,LiuHui,GengYijie,ZhengQing,FangShisong

CollegeofPharmacy,JinanUniversity,Guangzhou510632,China(ChenYC,ZhengQ);ShenzhenCenterforDiseaseControlandPrevention,Shenzhen518055,China(WangX,PengB,WuWH,LiuH,GengYJ,FangSS)

s:ZhengQing,Email:tzhengq@jun.edu.cn;FangShisong,Email:szcdcssf@aliyun.com

ObjectiveExploring the molecular characteristic of global and Shenzhen district H5N6 and H7N9 influenza viruses HA untranslated regions(UTRs).MethodsMega7.0 and DNAStar 7.1.0 were used to construct phylogenetic tree and nucleotide analysis.ResultsFrom 2014 to 2015, 3 strains of H5N6 influenza virus from Shenzhen were compared with the other H5NX influenza viruses, the nucleotide homology of HA-3’UTR was 77.4%-100%, which did not have obvious mutated sites. The nucleotide homology of H5N6-HA-5’UTR was 91.7%-100%, and the sites of 24 and 31 sites were mutated. From 2013 to 2014, 11 strains of H7N9 influenza virus from Shenzhen were compared with the other H7NX influenza viruses, the nucleotide homology of H7N9-HA-5’UTR was 76.8%-100%, which had multi-mutated sites on 2-6, 9, 10, 12 and 15-17 positions.ConclusionsHA-UTR from human-infected H5N6 and H7N9 influenza viruses isolated in Shenzhen district has unique molecular characteristics, its conserved region has relatively high homology and the segment-specific region has genetic polymorphism.

H5N6 influenza virus; H7N9 influenza virus; Hemagglutinin(HA); Untranslated region; Homology; Polymorphism

H5N6流感病毒；H7N9流感病毒；血凝素； 非翻譯區(qū)；同源性；多態(tài)性

2016-12-26)

(本文編輯：呂新軍)

鄭青，Email: tzhengq@jun.edu.cn；房師松，Email: szcdcssf@aliyun.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.04.003

深圳市衛(wèi)生計(jì)生系統(tǒng)科研項(xiàng)目(201602002)