慢性腦缺血大鼠腦組織NogoA、NgR1蛋白表達及山楂葉總黃酮的干預(yù)作用

李蒙蒙 吳曉光 趙星龍 尹美娟 梁 禪 江思瑜 姜俞忻 李素環(huán)

(承德醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所 河北省中醫(yī)藥抗癡呆重點研究室,河北 承德 067000)

慢性腦缺血大鼠腦組織NogoA、NgR1蛋白表達及山楂葉總黃酮的干預(yù)作用

李蒙蒙1吳曉光 趙星龍1尹美娟1梁 禪1江思瑜1姜俞忻 李素環(huán)1

(承德醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所 河北省中醫(yī)藥抗癡呆重點研究室,河北 承德 067000)

目的探討山楂葉總黃酮對慢性腦缺血大鼠腦組織軸突過度再生抑制因子(Nogo)A及其受體NgR1表達的影響。方法健康雄性SD大鼠，隨機分為假手術(shù)組、慢性腦缺血模型組、山楂葉總黃酮組和銀杏葉片組。采用雙側(cè)頸總動脈永久性雙重結(jié)扎法建立慢性腦缺血模型。HE染色法觀察神經(jīng)元密度；Western印跡和免疫組化法檢測缺血腦組織NogoA和NgR1蛋白的表達。結(jié)果與假手術(shù)組海馬神經(jīng)細胞比較，模型組大鼠CA1區(qū)神經(jīng)細胞排列混亂，神經(jīng)元細胞間隙增大，部分細胞溶解消失，細胞核固縮、濃染，正常神經(jīng)元數(shù)量較假手術(shù)組減少(P<0.01)，腦組織內(nèi)Nogo A(P<0.01)和NgR1(P<0.05)蛋白表達升高；與模型組比較，山楂葉總黃酮組病變明顯減輕，正常的神經(jīng)細胞排列規(guī)則，結(jié)構(gòu)較完整，神經(jīng)元密度增加(P<0.05)， Nogo A(P<0.01)和NgR1(P<0.05)蛋白表達降低。結(jié)論山楂葉總黃酮具有下調(diào)Nogo A和NgR1蛋白表達，促進腦神經(jīng)元軸突再生，保護慢性腦缺血大鼠神經(jīng)的功能。

山楂葉總黃酮；慢性腦缺血；NogoA；NgR1

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，神經(jīng)元的生長和抑制處于相對平衡的狀態(tài)，故其損傷后該平衡被破壞，即可導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙〔1〕。腦缺血損傷后神經(jīng)元再生能力很弱，主要是由于微環(huán)境中生長支持因子的缺乏和多種抑制因子的存在，阻礙了中樞神經(jīng)軸突的再生過程。軸突過度再生抑制因子(Nogo)A及其受體NgR1的存在是中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突再生的主要障礙之一〔2〕。本課題組研究表明，山楂葉總黃酮具有抗氧化〔3〕，減輕炎癥反應(yīng)〔4〕，抑制膽堿酯酶活性〔5〕等腦保護作用，但對NogoA及其受體NgR1表達的影響未見報道。本實驗觀察大鼠缺血腦組織中NogoA及其受體NgR1表達的變化，探討山楂葉總黃酮對慢性缺血腦組織神經(jīng)再生的影響。

1 材料與方法

1.1動物與分組 清潔級雄性SD大鼠48只，體質(zhì)量230～250 g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物合格證：scxk(京)2014-0004。適應(yīng)飼養(yǎng)1 w后隨機分為假手術(shù)組、模型組、山楂葉總黃酮組和銀杏葉片組，每組12只。

1.2藥物與試劑 山楂葉總黃酮購于承德復(fù)康藥業(yè)有限公司，純度58%，用0.5%碳酸氫鈉溶液稀釋為140 mg/ml。Nogo-A多克隆抗體由北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供；NgR1由Santa Cruz公司提供；SABC二抗試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒由武漢博士德生物科技有限公司提供。

1.3動物模型制備及給藥 采用永久性雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎法對模型組、山楂葉總黃酮組和銀杏葉片組的大鼠制備慢性腦缺血模型：3.5%水合氯醛腹腔麻醉，頸正中切口，無創(chuàng)傷鑷子鈍性分離皮下組織及下頜下腺，玻璃分針分離雙側(cè)頸總動脈，雙線結(jié)扎并用電刀切斷頸總動脈防止復(fù)流，碘伏消毒后，縫合切口，每只大鼠腹腔注射10萬U青霉素1次，預(yù)防感染。術(shù)后24 h內(nèi)未蘇醒者剔除，并及時補遺。假手術(shù)組的大鼠僅用玻璃分針游離雙側(cè)頸總動脈，不做結(jié)扎處理。術(shù)后第30天開始，山楂葉總黃酮組給予山楂葉黃酮140 mg·kg-1·d-1灌胃，銀杏葉片組給予銀杏葉提取物6.5 mg·kg-1·d-1灌胃，連續(xù)30 d。假手術(shù)組及模型組大鼠給予等量生理鹽水灌胃。

1.4取材及指標檢測 末次給藥1 h，每組隨機取6只大鼠，3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛心室灌注固定，取視交叉后段腦組織，10%甲醛后固定24 h，梯度酒精脫水，石蠟包埋，萊卡石蠟切片機連續(xù)5 μm冠狀切片備用。

1.4.1HE染色法觀察神經(jīng)元密度 5 μm石蠟切片，常規(guī)二甲苯脫蠟10 min，下行梯度酒精浸水各5 min，蘇木精染色3 min，鹽酸酒精分色15 s，伊紅染色1 min，上行梯度酒精脫水各5 min，二甲苯透明10 min，中性樹膠封片，光鏡觀察海馬神經(jīng)元形態(tài)及密度的變化。

1.4.2Western印跡法檢測NogoA蛋白的表達 末次給藥后1 h，每組余下的6只，斷頭取腦，剝離軟腦膜和血管，取視交叉后2～8 mm之間的腦組織，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)洗凈血液，加入裂解液和10 μl苯甲基磺酰氟(PMSF)(10 mg/ml)，4 ℃勻漿，10 000 r/min，離心30 min,取上清液，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。再經(jīng)過SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、10% 脫脂奶粉封閉，加NogoA一抗(1∶150)4℃過夜，HRP標記的二抗(1∶1 000)室溫孵育2.5 h，Super ECL Plus 超敏發(fā)光液發(fā)光，X線片暗盒內(nèi)曝光，D72顯影液顯影，利用Quantity One軟件分析X線膠片的灰度值。

1.4.3免疫組化法檢測NgR1蛋白表達 各組大鼠腦組織石蠟切片中每隔5片取1片，每個組織選3片，二甲苯脫蠟，梯度酒精浸水，3%H2O2孵育10 min，枸櫞酸緩沖液微波抗原修復(fù)；滴加NgR1單克隆抗體(1∶200稀釋)，4℃冰箱孵育過夜；加二抗工作液，室溫孵育30 min；滴加SABC酶標液孵育30 min；DAB顯色10 min；蘇木精復(fù)染5 min；鹽酸酒精分色15 s，梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。奧林巴斯顯微鏡400倍鏡下攝片，每張切片隨機選5個視野，采用MiVnt圖像分析儀分析陽性表達的吸光度值。

1.5統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0軟件行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)及密度的變化 HE染色顯示，假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細胞排列較整齊，細胞核呈圓形，染色較淺，核仁清晰可見；模型組大鼠海馬CA1區(qū)細胞排列不規(guī)則，神經(jīng)元細胞間隙增大，部分細胞溶解消失，細胞核固縮、濃染，正常神經(jīng)元數(shù)量較假手術(shù)組顯著減少(P<0.01)；與模型組比較，山楂葉總黃酮組及銀杏葉片組病變明顯減輕，正常神經(jīng)元數(shù)量明顯增多，排列稍規(guī)則，結(jié)構(gòu)較清晰，神經(jīng)元密度顯著增加(P<0.05)，山楂葉總黃酮組與銀杏葉片組之間無顯著差異(P>0.05)。見圖1，表1。

圖1 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元密度的變化(HE，×400)

組別神經(jīng)元密度(mm2)神經(jīng)元脫失率(%)假手術(shù)組66.46±9.230模型組13.51±6.341)79.67±33.201)山楂葉總黃酮組34.93±7.622)47.44±12.813)銀杏葉片組36.56±5.732)44.98±13.563)

與假手術(shù)組比較:1)P<0.01;與模型組比較:2)P<0.05,3)P<0.01，下表同

2.2各組大鼠NogoA蛋白表達的變化 與假手術(shù)組比較，模型組NogoA蛋白的表達顯著升高〔(364.89±5.19)%，P<0.01〕；與模型組比較，山楂葉總黃酮組和銀杏葉片組的NogoA蛋白的表達分別降低了(60.47±5.93)%和(62.63±6.39)%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；銀杏葉片組優(yōu)于山楂葉總黃酮組，但兩組間比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見圖2，表2。

2.3各組大鼠NgR1蛋白表達的變化 神經(jīng)元的細胞膜及胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為NgR1陽性表達。假手術(shù)組大鼠神經(jīng)元NgR1出現(xiàn)弱陽性表達；與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)元NgR1陽性表達的數(shù)量顯著增加；與模型組比較，山楂葉總黃酮組大鼠NgR1陽性表達的神經(jīng)元數(shù)量明顯減少。模型組大鼠NgR1的吸光度值高于假手術(shù)組(P<0.01)；與模型組比較，山楂葉總黃酮組大鼠NgR1的吸光度值顯著降低(P<0.05)，提示山楂葉總黃酮具有抑制NgR1蛋白表達的作用。見表2。

圖2 各組大鼠腦組織NogoA蛋白表達的變化

組別NogoANgR1(OD值)假手術(shù)組0.0109±0.000340.82±0.15模型組0.0463±0.005811)0.31±0.041)山楂葉總黃酮組0.0183±0.000543)0.68±0.082)銀杏葉片組0.0173±0.000513)0.67±0.072)

3 討 論

中樞神經(jīng)元壞死及軸突脫髓鞘壞死是導(dǎo)致患者喪失原有神經(jīng)功能的主要原因。腦缺血激活了級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致缺血半暗帶逐漸消失，壞死的腦組織區(qū)域增大，如何在腦部缺血性損傷后采取積極有效的治療措施搶救缺血半暗帶并減少腦組織的死亡區(qū)域，是提高腦梗死后患者生命質(zhì)量的關(guān)鍵〔6〕。中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后修復(fù)是目前神經(jīng)醫(yī)學研究的重點和難點，迄今仍然缺乏有效的治療方法和手段。其中一個重要原因是存在髓鞘源性軸突生長抑制因子，通過與分布在軸突生長錐表面的NgR受體復(fù)合物結(jié)合抑制軸突再生〔2〕。因此，能否有效解除抑制中樞神經(jīng)再生的因素，是腦梗死后神經(jīng)功能恢復(fù)的重要環(huán)節(jié)。近年研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)發(fā)育階段，Nogo-A-NgR系統(tǒng)存在幫助建立穩(wěn)定的髓鞘通道，引導(dǎo)軸突向著正確的方向延伸以及介導(dǎo)神經(jīng)元之間建立聯(lián)系而形成突觸等作用〔7〕。

NogoA是一個含有1 163個氨基酸的膜蛋白(分子量接近200 kD)，主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的少突膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元髓鞘內(nèi)外環(huán)中表達，身體發(fā)育期間神經(jīng)元中亦有一定程度的表達，但成年后就幾乎不在神經(jīng)元中表達〔8〕。NogoA的受體包括 NgR1、NgR2 和 NgR3，其中NgR1與NogoA的結(jié)合力最強〔9〕。有研究認為，NogoA抑制神經(jīng)再生的作用主要是通過與其受體NgR-p75NTR復(fù)合物結(jié)合，從而激活細胞內(nèi)RhoA信號通路，使生長錐崩解并抑制軸突延伸〔10〕。再通過第二信使作用于Rho進而激活 ROCK，調(diào)節(jié)生長錐中的微絲，使生長錐崩潰，抑制軸突再生〔11〕。本實驗結(jié)果顯示，慢性腦缺血可引起膠質(zhì)細胞過度活化，釋放NogoA蛋白，繼而與其受體NgR1結(jié)合，抑制神經(jīng)再生，損傷腦的神經(jīng)功能，與文獻報道的結(jié)果一致〔12〕。本課題組前期研究結(jié)果也顯示山楂葉總黃酮能夠抑制腦缺血后膠質(zhì)細胞過度表達，減少膠質(zhì)瘢痕形成的作用〔13〕。山楂葉總黃酮藥物干預(yù)后，NogoA及其受體NgR1表達顯著減少，提示山楂葉總黃酮能抑制腦缺血誘發(fā)的NogoA及其受體NgR1過度表達，這可能是其對腦保護作用的機制之一。

1Gu H,Yu SP,Gutekunst CA,etal.Inhibition of the Rho signaling pathway improves neurite outgrowth and neuronal differentiation of mouse neural stem cells〔J〕.Int J Physiol Pathophysiol Pharmacol,2013；5(1):11-20.

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〔2016-04-13修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

R749

A

1005-9202(2017)18-4478-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.18.020

河北省科技廳指令課題(No.15277789D)；河北省教育廳青年基金指令課題(No.QN2014103)；河北省高校省級重點學科項目(No.2013-2016);河北省中醫(yī)藥抗癡呆重點研究室項目(No.2014-2017);承德醫(yī)學院大學生科研重點課題(No.201505)

1 承德醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學院2012級麻醉本科

吳曉光(1975-)，男，副研究員，碩士，碩士生導(dǎo)師，主要從事中醫(yī)藥抗癡呆機制研究。

李蒙蒙(1991-)，女，主要從事神經(jīng)損傷與修復(fù)研究。