抗hCD20單抗所致B細胞減少可以提高CD20特異cTCR+T細胞存活

任振波，侯毅銳,鄭 偉

(1.長春市解放軍第208醫(yī)院,吉林 長春130062;2.長春市中心醫(yī)院 檢驗科)

抗hCD20單抗所致B細胞減少可以提高CD20特異cTCR+T細胞存活

任振波1，侯毅銳2*,鄭 偉1

(1.長春市解放軍第208醫(yī)院,吉林 長春130062;2.長春市中心醫(yī)院 檢驗科)

B細胞淋巴瘤/白血病是一種常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，化療及造血干細胞移植的治療方法存在許多問題。尤其是難治與復發(fā)B細胞淋巴瘤/白血病往往治療的成功率很低。數(shù)年前開展的嵌合抗原受體T細胞(CAR-T)過繼免疫治療B細胞淋巴瘤/白血病技術，成功例數(shù)不斷增加，但有很多方面仍有待完善。本研究意在觀察輸注CAR-T細胞前給予抗CD20抗體進行預處理B淋巴細胞是否減少及對CAR-T細胞活性是否有影響。

1 材料與方法

1.1 動物、細胞系

Thy1.2+野生型(WT)鼠、Thy1.1+和Thy1.2+Bbalb/c鼠及CL4細胞TCR轉(zhuǎn)基因鼠購自美國The Jackson Laboratory。hCD20特異cTCR+T細胞通過BD Bioscience FACS(fluorescence activitied cell sorter)獲得。

1.2 試劑和儀器

CD20-CAR-T細胞購自ATCC(American type culture collection)。流式細胞儀為BD Bioscience的FACS(熒光激活細胞分離儀)；抗mCD20和抗hCD20單抗、ELISA試劑盒均為美國eBioscience公司產(chǎn)品。

1.3 鼠骨髓和脾細胞的制備

用二氧化碳窒息鼠后摘取淋巴結和脾臟，用40 μm濾網(wǎng)過濾生成單細胞懸液；骨髓用RPMI1640沖洗鼠股骨骨髓腔取得。

1.4 體外T細胞分析

用流式細胞儀測定T細胞的數(shù)量。

1.5 生物發(fā)光成像

將熒光素鉀注射鼠腹膜內(nèi)，然后用X線攝像，用軟件分析發(fā)光資料，單位為光子/s/cm2/sr。

1.6 統(tǒng)計學處理

統(tǒng)計學分析軟件應用SPSS 16．0，用t檢驗比較兩樣本均數(shù)，P<0．05為差異有顯著性。

1.7 實驗方法

(1)將抗hCD20單抗200 μg通過鼠尾靜脈注射Thy1.1+和Thy1.2+Bbalb/c鼠及CL4細胞TCR轉(zhuǎn)基因鼠后獲得B細胞減少的白血病鼠，取鼠血、淋巴結、骨髓和脾細胞用低滲液體溶解后用流式細胞儀分析B細胞。用Thy1.2+野生型(WT)鼠做對照。

(2)4天后將2×107熒光素酶+MB20-18+Thy1.1+CD8+T細胞和熒光素酶+MB20-18：CD3ζΔ+T細胞注入B細胞減少的鼠中，將熒光素酶+MB20-18+T細胞注入未經(jīng)抗體處理的(B細胞未減少的)鼠中，檢測cTCR+T細胞的發(fā)光信號數(shù)據(jù)。

2 結果

2.1 用流式細胞儀分析抗hCD20單抗處理hCD20鼠血液、淋巴結、脾及骨髓B細胞。24 h后淋巴結及骨髓成熟B細胞減少90%，脾臟B細胞減少80%，血B細胞減少89%，7天后淋巴結、骨髓及脾臟成熟B細胞減少超過90%。

2.2 MB20-18+T細胞在B細胞減少的白血病鼠中生物發(fā)光信號明顯增加(2倍，P>0.05)，骨髓中的峰值為3天(8倍增加；P<0.01)，頸部淋巴結6倍增加(P<0.01)圖1。T細胞注射后5天MB20-18+Thy1.1+CD8+T細胞的活性在B細胞減少的鼠骨髓、淋巴結和脾臟中比B細胞未減少的鼠中增強。

圖1 注射T細胞后時間與生物發(fā)光信號的關系

3 討論

已證實在過繼T細胞轉(zhuǎn)入之前淋巴細胞減少及造血干細胞移植可以提高抗原特異性T細胞群的存活和功能[1,2-4]。然而，會出現(xiàn)與全淋巴細胞減少及自體干細胞移植有關的明顯的毒性反應[5-8]，單純B細胞減少很少產(chǎn)生毒副作用[9]，卻促進了可能導致抗白血病反應的特異性抗原的增殖。在有微小殘留病灶(MRD)的情況下，將B細胞腫瘤相關抗原特異T細胞注入B細胞減少的病人體內(nèi)可能足以清除抗CD20單抗抵抗的疾病而不需要全淋巴細胞減少。

以前有報道用抗hCD20單抗處理hCD20鼠證明其血液、淋巴結脾及骨髓B細胞減少[10-12]。

為了提高CAR-T細胞療效及減少其副作用，各研究中心進行了大量的實驗，效果不一。我們設計了在輸注CAR-T細胞前給予抗CD20抗體進行預處理以減少B淋巴細胞，結果MB20-18+T細胞在B細胞減少的鼠中生物發(fā)光信號明顯增加。

為確定單克隆抗體介導的B細胞減少對mCD20特異cTCR+T細胞存活及功能的作用，給用CD20單抗處理的WT或hCD20鼠注射2×107MB20-18+熒光素酶+T細胞，給WT鼠注射無關Leu16+T細胞作為對照。hCD20鼠血中hCD20+mCD20+B細胞的減少可以使MB20-18+細胞從肺中排出，此與用無關的Leu16+細胞所觀察到的相一致[14]。

MB20-18+T細胞在B細胞減少的鼠中生物發(fā)光信號增加，其擴增依靠cTCR，因為MB20-18：CD3ζΔ+T細胞在B細胞減少的鼠中未見擴增。T細胞注射后5天Thy1.1+MB20-18+T細胞的活性在B細胞減少的鼠骨髓、淋巴結和脾臟中比B細胞未減少的鼠中增強。

MB20-18+T細胞與MB20-18：CD3ζΔ+T細胞相比在脾和B細胞減少的鼠中顯示CD62L表達減少，但并沒有消失，可能反映了在與少量留存的B細胞反應當中cTCR引發(fā)的有限性[13,14]。在B細胞不缺乏的鼠中，MB20-18+T細胞不能在淋巴結中聚集可能反映了在與多B細胞反應時的多cTCR觸發(fā)事件，導致存活降低，CD62L表達減少，移動改變。這些結果表明在過繼輸入之前的B細胞減少可以促進CD20特異cTCR+T細胞存活并且提高這些細胞移動進入白血病和淋巴瘤聚集的淋巴結和骨髓。

為確定B細胞減少是否能增加MB20-18+T細胞的抗B細胞活性，在注射T細胞5天后計數(shù)鼠脾細胞中的殘存的B細胞。用抗hCD20單抗預處理的鼠，MB20-18+T細胞使85%的脾殘存B細胞減少(P<0.001),與未減少的鼠相比導致95.8%的脾B細胞減少(P<0.001)。既往曾報道邊緣區(qū)B細胞對抗hCD20抗體介導的B細胞減少相對抵抗[10,12]，濾泡區(qū)和邊緣區(qū)B細胞比例在未減少的鼠中從10.5降至抗體致減少鼠的2.5。對比之下，MB20-18+T細胞能有效減少抗體抵抗邊緣區(qū)殘存B細胞，與MB20-18：CD3ζΔ+T/抗hCD20抗體處理的鼠相比邊緣區(qū)B細胞減少200倍。這些結果表明由抗體介導正常B細胞的減少揭示了CD20特異T細胞的抗B細胞活性，CD20特異T細胞可以使抗體抵抗的細胞清除。

注入的T細胞能否在腫瘤患者體內(nèi)持續(xù)存在為腫瘤過繼免疫治療成敗的關鍵。臨床實驗證明過繼輸入的cTCR+T細胞僅能在有大量能產(chǎn)生抗原的患者體內(nèi)短暫存在[15,16]。有臨床研究結果顯示表達CD20的正常B細胞能降低CD20特異cTCR+T細胞的壽命和功能，抗體介導的B細胞減少可能提高CD20特異T細胞治療效果[17]。

我們的研究表明，在實驗鼠體內(nèi)抗CD20單抗誘發(fā)的B細胞減少明顯提高了CAR-T細胞在白血病體內(nèi)的活性，可以預測其抗白血病效果亦會有所提高。下一步可以在人體內(nèi)進行類似實驗，以檢驗在進行CAR-T細胞治療B細胞淋巴瘤/白血病時用此預處理方法對治療效果的影響。

[1]Rosenberg SA,Dudley ME.Adoptive cell therapy for the Treatment of patients with metastatic melanoma[J].Curr Opin Immunol,2009,21(2):233.

[2]Gattinoni L,Finkelstein SE,Klebanoff CA,et al.Removal of homeostatic cytokine sinks by lymphodepletion enhances the efficacy of adoptively transferred tumors-specific CD8+T cells[J].J Exp Med,2005,202(7)：907.

[3]Wrzesinski C,Paulos CM,Gattinoni L,et al.Hematopoietic stem cells promote the expansion and function of adoptively transferred antitumor CD8 T cells[J].J Clin invest,2007,117(2)：492.

[4]Dudley ME,Yang JC,Sherry R,et al.Adoptive cell therapy for patients with metastatic melanoma：evaluation of intensive myeloablative chemoradiation preparative regimens[J].J Clin Oncol,2008,26(32)：5233.

[5]Thomas O,Mahe M,Campion L,et al.Long-term complications of total body irradiation in adults[J].Int J Radiat Oncol Biol Phys,2001,49(1)：125.

[6]Hake CR,Graubert TA,Fenske TS.Does autologous transplantation directly increase the risk of secondary leukemia in lymphoma patients？[J].Bone Marrow Transplant,2007,39(2)：59.

[7]Montoto S,Canals C,Rohatiner AZ,et al.Long-term follow-up of high-dose treatment with autologous haematopoietic progenitor in 693 patients with follicular lymphoma：an EBMT registry study[J].Leukemia,2007,21(11)：2324.

[8]Brown JR,Feng Y,Gribben JG,et al.Long-term survival after autologous bone marrow transplantation for follicular lymphoma in first remission[J].Biol Blood Marrow Transplant,2007,13(9)：1057.

[9]Fleischmann RM.Safety of biologic therapy in rheumatoid arthritis and other autoimmune diseaseas：focus on rituximab[J].Semin Arthritis Rheum,2009,38(4)：265.

[10]Ahuja A,Shupe J,Dunn R,et al.Depletion of B cells in murine lupus：efficacy and resistance[J].J Immunol,2007,197(5):3351.

[11]Beers SA,Chan CH,James S,et al.Type ll(tositumomab) anti-CD20 monoclonal antibody out performs type l (rituximab-like) reagents in B-cell depletion regardless of complement activation[J].Blood,2008,112(10)：4170.

[12]Gong Q,Ou Q,Ye S,et al.Importance of cellular microenvironment and circulatory dynamics in B cell immunotherapy[J].J Immunol,2005,174(2):817.

[13]Jung TM,Gallatin WM,Weissman IL,et al.Down-regulations of homing receptors after T cell activation[J].J Immunol,1998,141(12)：4110.

[14]Gattinoni L,Klebanoff CA,Palmer DC,et al.Acquisition of full effector function in vitro paradoxically impairs the in vivo antitumor efficacy of adoptively transferred CD8+T cells[J].J Clin Invest,2005,115(6)：1616.

[15]Till BG,Jensen MC,Wang J,et al.Adoptive immunotherapy for indolent non-Hodgkin lymphoma and mantle cell lymphoma using genetically modified autologous CD20-specific T cells[J].Blood,2008,112(6):2261.

[16]Park JR,Digiusto DL,Slovak M,et al.Adoptive transfer of chimeric antigen receptor re-directed cytolytic T lymphocyte clones in patients with neuroblastoma[J].Mol Ther,2007,15(4)：825.

[17]任振波，侯毅銳，鄭 偉，等.表達CD20的正常B細胞對CD20特異cTCR+T細胞抗白血病活性的影響[J]．中國實驗診斷學雜志，2017,21(2):326.

吉林省科技廳項目資助(20160101165JC)

*通訊作者

1007-4287(2017)09-1426-03

2016-12-29)