糖尿病患者尿中nephrin蛋白的表達(dá)及臨床意義

張 洋,肖慶飛,趙永利,陳 燕,屈智慧

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院二部 腎病科,吉林 長春130031)

糖尿病患者尿中nephrin蛋白的表達(dá)及臨床意義

張 洋,肖慶飛,趙永利,陳 燕,屈智慧*

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院二部 腎病科,吉林 長春130031)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病最嚴(yán)重的微血管合并癥，其早期臨床標(biāo)志物是微量白蛋白尿，而蛋白尿的產(chǎn)生與足突裂孔蛋白nephrin表達(dá)異常有關(guān)，足細(xì)胞功能障礙是糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展的重要因素[1]。有研究表明：Nephrin是由腎小球足細(xì)胞表達(dá)，定位于腎小球裂孔膜上的跨膜蛋白，其參與維持腎小球濾過膜的完整性[2]。DN早期出現(xiàn)足細(xì)胞損傷，其表面nephrin蛋白與骨架蛋白結(jié)合減弱，nephrin從足細(xì)胞脫落，隨尿液排出體外[3]。本文探討nephrin蛋白對早期糖尿病腎病的預(yù)測價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

病例來源于2010年至2016年于我院內(nèi)分泌科及腎病科住院診斷為2型糖尿病的患者88例，所有病例病程10年以上，男性40例，女性48例，2型糖尿病診斷符合1999年WHO糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)，年齡在18歲以下，80歲以上的予以排除,所有患者均排除心臟、肝臟、其他腎臟疾病以及感染性疾病，排除腫瘤、外傷、風(fēng)濕性疾病,且近期未發(fā)生糖尿病酮癥酸中毒或高滲性昏迷，同時近2個月未使用過ACEI或ARB類降壓藥物。為減少尿液濃度對檢測結(jié)果的影響，尿白蛋白及尿nephrin蛋白均除以尿肌酐校正。借鑒Mogensen分型標(biāo)準(zhǔn)分為糖尿病組(DM)：UAER<20 μg/min[相當(dāng)尿白蛋白的排泄率(ACR)<30 μg/mg];早期糖尿病腎病組(DN1)：20 μg/min≤UAER<200 μg/min(相當(dāng)于ACR30-300 μg/mg);臨床糖尿病腎病組(DN2):UAER≥200 μg/min(相當(dāng)ACR>300 μg/mg);正常對照(N)組40例，男性18例，女性22例，均為我院健康體檢者，平均年齡48.55±18.54歲。

1.2 標(biāo)本收集

所有患者留取晨尿10 ml，2 000 r/min離心5分鐘，收集上清液，-20℃保存?zhèn)溆?，用于尿nephrin蛋白的測定。

1.3 主要試劑與儀器

人nephrin蛋白酶聯(lián)免疫分析試劑盒(美國R&D System公司產(chǎn)品)，酶標(biāo)儀，全自動生化分析儀，-70℃冰箱，離心機(jī)。

1.4 方法

1.4.1 血指標(biāo)的檢測 各組患者均在晨起空腹情況下檢測，用全自動生化分析儀檢測血清空腹血糖、總膽固醇、甘油三酯。采用免疫分析法測定糖化血紅蛋白。同時測量患者的血壓，計算其體重指數(shù)。

1.4.2 尿液白蛋白的檢測 各組患者均用免疫透射比濁法檢測尿蛋白，每個月1次，共2次，取平均值。用全自動生化分析儀檢測尿肌酐。

1.4.3 尿液nephrin蛋白的檢測 采用酶聯(lián)免疫分析法(具體步驟見操作說明書)檢測尿中的nephrin,為減少受試者尿液濃度變化對測試結(jié)果的影響，結(jié)果均除以尿肌酐的結(jié)果表示，即尿nephrin/尿肌酐(μg/mg)表示，每個樣本檢測兩次，取平均值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組一般臨床資料比較 見表1。DM組、DN1組、DN2組與NC組相比，在年齡、性別，體重指數(shù)方面差異無顯著意義。但收縮壓、舒張壓明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 各組生化指標(biāo)的比較 見表2。DM組、DN1組、DN2組與NC組相比，在空腹血糖、糖化血紅蛋白、膽固醇及甘油三酯方面明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。各組相比，僅DN2組的血尿素氮與血肌酐高于其他各組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各組臨床指標(biāo)比較

*與NC組相比P<0.05

表2 各組生化指標(biāo)比較

*與NC組相比P<0.05

2.3 各組Unephrin/UCR與ACR 的比較 見表3。NC組患者尿中檢測到少量nephrin蛋白，與DM組相似，但DN1組尿nephrin蛋白的排泄量(Unephrin/UCR)較NC組與DM組進(jìn)一步升高，差異有顯著意義(P<0.01)。DN2組Unephrin/UCR較DN1組有顯著升高，差異顯著(P<0.01)。 DM組尿白蛋白的排泄率與NC組相似，DN1組ACR較DM組與NC組明顯增高，差異有顯著意義(P<0.01)。DN2組ACR較DN1組進(jìn)一步升高，差異有顯著意義(P<0.01)。Unephrin/UCR與ACR有相關(guān)性，r=0.539(P<0.05)。

表3 各組Unephrin/UCR與ACR 的比較

*與NC組相比P<0.01，▲與DN1相比P<0.01

3 討論

Nephrin蛋白是1998年瑞典著名教授Karl Tryggvason在研究先天性腎病綜合征芬蘭型時發(fā)現(xiàn)的,它是腎小球濾過屏障上皮細(xì)胞足突之間裂孔隔膜上第一個被確定的蛋白[4]。其在足突裂孔膜處形成“拉鏈樣結(jié)構(gòu)”，它的缺失或氨基酸序列的改變，會導(dǎo)致裂孔膜的破壞，進(jìn)而產(chǎn)生大量尿蛋白[5]。

Doublier等[6]證實糖尿病早期腎小球nephrin蛋白代償性增加，足細(xì)胞骨架蛋白重新分布導(dǎo)致其與nephrin蛋白的解離，從而nephrin蛋白從尿液排出，說明nephrin是糖尿病早期腎臟損傷的標(biāo)志物。Patari[7]用Western印記法檢測了1型糖尿病患者尿中的nephrin蛋白，表明nephrin 是可作為預(yù)測糖尿病腎臟并發(fā)癥的有用指標(biāo)。Wada Y[8]利用各種腎病動物模型證實，nephrin可以作為預(yù)測足細(xì)胞損傷的生物標(biāo)志物。綜上說明nephrin可能與DN早期改變有關(guān)，并促進(jìn)腎小球濾過功能的喪失。

我們的前期工作發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠早期出現(xiàn)白蛋白尿,并且早于腎功能的改變，說明白蛋白尿是糖尿病早期腎損害的標(biāo)志。隨著尿蛋白的增多，病理改變的加重，大鼠腎臟nephrin蛋白表達(dá)降低，提示nephrin蛋白參與蛋白尿的產(chǎn)生與發(fā)展[9]。這也為nephrin蛋白從足細(xì)胞脫落，從尿中排出提供了佐證。

本研究發(fā)現(xiàn)，DM組、DN1組、DN2組三組之間，具有顯著差異的是ACR與Unephrin/UCR兩項指標(biāo)。在正常的健康人群的尿液中，我們可以檢測到少量的nephrin蛋白，排出量與糖尿病組患者相近，這與有些學(xué)者的研究結(jié)果有所不同。比如程亮[10]研究表明nephrin蛋白在正常健康人群的尿液中不出現(xiàn)。解釋這種差異的原因是nephrin蛋白可能在其他組織有一些微弱表達(dá)。比如Ahola[11]等發(fā)現(xiàn)nephrin mRNA不但在大鼠腎小球有強(qiáng)表達(dá)，在其脾臟也有微弱表達(dá)。Liu[12]等首次報道了出生后1-6周的小鼠睪丸組織內(nèi)有高水平nephrin mRNA表達(dá)。所以，在正常人的尿液中可能存在nephrin蛋白。

本研究發(fā)現(xiàn)，在早期糖尿病腎病患者(DN1)，尿nephrin蛋白排出比DM組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而臨床糖尿病腎病的患者(DN2)，尿nephrin蛋白排出比DN1組進(jìn)一步升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。隨著DN病情的進(jìn)展，尿nephrin的排泄有逐漸增多的趨勢。這與糖尿病腎病患者尿白蛋白(ACR)的排泄趨勢相同。研究發(fā)現(xiàn)，尿nephrin蛋白排出與ACR呈正相關(guān)，ACR目前是糖尿病腎病分期的主要指標(biāo)，綜上所述，nephrin蛋白在早期預(yù)測DN中具有非常重要的作用。

[1]Wolf G,Ziyadeh FN.Cellular and molecular mechanisms of proteinuria in diabetic nephropathy[J].Nephron Physiol,2007,106(2):26.

[2]WolfG，Chen s，Ziyadeh FN，et al．From the periphery of glomerular capillary wall toward the center of disease：podocyte injury comes of age in diabetic nephropathy[J]．Diabetes，2005，54(6)：1626.

[3]Zelmanovitz T,Gerchman F,Balthazar AP,et al.Diabetic nephropathy [J].Diabetol Metab Syndr,2009,(1):1186.

[4]Tryggvason K.Unraveling the mechanisms of glomerular Ultrafiltration:nephrin,a key component of the slit diaphragm[J].J Am Soc Nephrol ,1999,10:2440.

[5]Welsh GI,Saleem MA.Nephrin-signature molecule of the glomerular podocyte? [J].J Pathol,2010,220:328.

[6]Doublier S,Salvidio G,Lupia E,et al.Nephrin expression is reduced in human diabetic nephropathy:evidence for a distinct role for glycated albumin and angiotensin II[J].Diabete,2003,52:1023.

[7]Patari A,Forsblom C,Havana M,et al .Nephrinuria in diabetic nephropathy of type 1 diabetes[J].Diabetes,2003，52(12):2969.

[8]Wada Y,Abe M,Moritani H,et al.Potential of urinary?nephrin?as a biomarker reflecting podocyte dysfunction in various kidney disease models[J].Exp Biol Med,2016,241(16):1865.

[9]屈智慧，楊立志，趙 穎,等.糖尿病大鼠蛋白尿與腎臟病理及nephrin的相關(guān)性研究[J].中國實驗診斷學(xué),2011,15(9):1441.

[10]程 亮，俞偉男，胡 文,等.糖尿病腎病患者尿足細(xì)胞相關(guān)蛋白nephrin的表達(dá)及意義[J].轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)雜志，2013,2(1)：15.

[11]Ahola H,Wang SX,Luimula P,et al..Cloning and expression of the rat nephrin homolog[J].Am J Pathol,1999,155(3):907.

[12]Liu L,Aya K,Tanaka K,et al.Nephrin is an important component of the barrier system in the testis[J].Acta Med Okayama,2001,55(3):161.

吉林大學(xué)第一醫(yī)院二部科研專項基金(B04)

*通訊作者

1007-4287(2017)09-1376-03

2017-03-15)