外周血CPNE3表達(dá)異常可能作為評(píng)估穩(wěn)定冠心病發(fā)展為急性心肌梗死的遺傳標(biāo)志

王 孟，譚卜川，楊玉雙，劉 龍，劉雪巖，孟繁波

(1.吉林大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 2013級(jí)臨床五班，吉林 長(zhǎng)春130021；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 心血管內(nèi)科，吉林 長(zhǎng)春130033)

外周血CPNE3表達(dá)異?？赡茏鳛樵u(píng)估穩(wěn)定冠心病發(fā)展為急性心肌梗死的遺傳標(biāo)志

王 孟1，譚卜川2*，楊玉雙2，劉 龍2，劉雪巖2，孟繁波2*

(1.吉林大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 2013級(jí)臨床五班，吉林 長(zhǎng)春130021；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 心血管內(nèi)科，吉林 長(zhǎng)春130033)

基因COPINE III可能和一種具有內(nèi)在激酶活性的磷蛋白有關(guān)，屬于一類非傳統(tǒng)的激酶家族[1]。CPNE3基因相較在穩(wěn)定冠心病(SCAD)患者中比在急性心肌梗死(AMI)患者中差異性低表達(dá)，表達(dá)倍數(shù)為0.484倍[2]。本研究欲通過(guò)擴(kuò)大臨床資料樣本量的方法，來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證CPNE3基因是否能預(yù)測(cè)AMI發(fā)生，并評(píng)估CPNE3基因外周血表達(dá)量對(duì)于AMI的診斷價(jià)值以及外周血CPNE3基因表達(dá)產(chǎn)物是否可作為急性心梗風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的生物標(biāo)志物。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2016年4月-2016年11月于吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院心血管內(nèi)科住院治療并行冠脈造影術(shù)的患者，依據(jù)2012年公布的心肌梗死全球統(tǒng)一定義[3]明確診斷為AMI的病人 91 例為AMI組，SCAD[4]患者87例為對(duì)照組。排除標(biāo)準(zhǔn)：①和經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(PCI)或冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)(CABG)相關(guān)的心肌梗死。②MI type II。繼發(fā)于供血失衡相關(guān)的心梗：如兒茶酚胺水平升高或冠脈痙攣導(dǎo)致的心梗。③伴有心臟手術(shù)或非心臟手術(shù)的心梗。④合并多因素或不確定疾病的心肌損傷。⑤患有免疫系統(tǒng)疾病和(或)正在服用激素。⑥(活動(dòng)性或潛伏性)結(jié)核感染史或證據(jù)。⑦正在患有的、慢性的或復(fù)發(fā)性的傳染性疾病史。⑧合并有嚴(yán)重感染性疾病、惡性腫瘤。懷疑或證實(shí)處于免疫缺陷狀態(tài)的患者。⑨臨床資料或者冠脈造影資料不全者。詳細(xì)記錄臨床資料，包括：血脂水平、空腹血糖水平、靜息血壓、體質(zhì)指數(shù)(BMI)、冠心病家族史、吸煙史、冠狀動(dòng)脈造影資料，以及合并其它臨床疾病情況(如高血壓、糖尿病)等。

1.2 研究方法

1.2.1 外周血采集、總RNA提取及cDNA合成 留取各研究對(duì)象晨起空腹外周靜脈血4 ml，利用血液總 RNA 提取試劑盒(RNAsimple TotalRNA Kit,天根生化科技有限公司，北京)，依據(jù)試劑盒說(shuō)明書對(duì)已獲取的外周血進(jìn)行總 RNA提取，并利用 1.5%瓊脂糖電泳及紫外分光光度計(jì)(Nanodrop 2000)對(duì)RNA的質(zhì)量及濃度進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 利用SYBR熒光定量試劑盒(SYBR Premix Ex Taq TM，TaKaRa,大連)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。依據(jù)試劑盒說(shuō)明書應(yīng)用 Mx3005P 實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)(Strata Gene)擴(kuò)增。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性1 min；95℃變性5 s，60℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束之后， 記錄60℃-95℃溫度范圍內(nèi)的熔解曲線及擴(kuò)增曲線，產(chǎn)物4℃保存 備用。每個(gè)樣本所得循環(huán)閾值(Ct)以相對(duì)表達(dá)量 2-△Ct表示(△Ct=目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值)，并進(jìn)行比較。急性心肌梗死組對(duì)于對(duì)照組的相對(duì)表達(dá)量以 2-△△Ct法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[5]，△△Ct=急性心肌梗死組△Ct-穩(wěn)定冠心病組△Ct。所用 PCR 引物根據(jù) NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)提供的CPNE3基因序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，并由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，引物序列見表1。

表1 RT-PCR 引物序列

Fa,sequence from sense strands.Rb,sequence from anti-sense strands.

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

1.4 倫理聲明

本研究由吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有受試者的樣本及信息采集均通過(guò)受試者同意，并簽署知情同意書。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料分析

研究對(duì)象的臨床資料分析結(jié)果表明：在性別、 BMI、高血壓病史、冠心病家族史、收縮壓、舒張壓及血清甘油三酯水平(TG)、血清總膽固醇水平(TC)、低密度脂蛋白膽固醇水平(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)等方面，兩組未見明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。AMI組患者年齡明顯高于SCAD組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，詳見表 2。

表2 AMI組與SCAD組臨床資料比較

2.2 CPNE3基因?qū)崟r(shí)熒光定量 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定

外周血 RNA 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示：CPNE3基因擴(kuò)增曲線為顯著平滑的“S 型”。溶解曲線呈現(xiàn)單一的溶解峰，擴(kuò)增產(chǎn)物特異性較高。

2.3 CPNE3 基因 mRNA水平相對(duì)表達(dá)量在AMI組和SCAD組間比較分析

RT-PCR 所得每個(gè)樣本的ΔCt 值均為單個(gè)樣本重復(fù)3次測(cè)量所得均值。結(jié)果顯示，AMI組 2-△Ct為 0.020(0.016-0.032)，SCAD組2-△Ct為0.029(0.021-0.067)，兩組差別有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Z=-4.231，P=0.000)。AMI患者外周血中CPNE3基因mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯低于SCAD患者，且其相對(duì)表達(dá)量為SCAD組的0.69倍。詳見圖1。

2.4 外周血CPNE3基因蛋白水平表達(dá)結(jié)果分析

本研究中以β-actin 為內(nèi)參基因，對(duì)患者外周血進(jìn)行蛋白水平的檢測(cè)。Western Blot 結(jié)果顯示：AMI組與SCAD組在β -actin 基因蛋白水平表達(dá)上無(wú)明顯差異，而在CPNE3基因蛋白水平表達(dá)上差異顯著，與SCAD患者相比，AMI患者在蛋白水平為低表達(dá)，AMI組CPNE3蛋白表達(dá)為SCAD組的 0.356倍，詳見圖2。

2.5 CPNE3基因相對(duì)表達(dá)量與年齡、血清血脂、血糖等的相關(guān)性分析

本組資料表明，CPNE3基因的mRNA水平表達(dá)量、患者年齡在AMI和SCAD兩組比較均存在差異性。進(jìn)一步分析CPNE3基因mRNA表達(dá)量與患者年齡、空腹血糖、血清血脂水平是否有關(guān)。將所有納入的研究對(duì)象依據(jù)血脂水平分層標(biāo)準(zhǔn)[6]分為：TC 正常組(<5.18 mmol/L)和TC 升高組(≧5.18 mmol/L)、TG正常組(<1.76 mmol/L)、TG升高組(≧1.76)、LDL-C正常組(<3.37 mmol/L)和LDL-C 升高組(≧3.37 mmol/L)、HDL-C正常組(≧0.907)、HDL-C降低組(<0.907)。依據(jù)空腹血糖標(biāo)準(zhǔn)水平[7]將所有研究對(duì)象分為：血糖正常組(≤6.0)、血糖升高組(>6)。依據(jù)所有研究對(duì)象以年齡做AMI的ROC曲線的cut off值將所有納入的研究對(duì)象分為：高齡組(>66.5歲)和 低齡組(≤66.5歲)。每個(gè)研究對(duì)象CPNE3基因mRNA水平的相對(duì)表達(dá)量以2-△Ct表示，分別比較各組間 與CPNE3基因表達(dá)量的相關(guān)性。結(jié)果顯示：CPNE3基因mRNA表達(dá)量在高齡組與低齡組之間有差異(P=0.008)；CPNE3基因mRNA表達(dá)量與血清血脂、血糖均無(wú)關(guān)。結(jié)果詳見表3。

2.6 采用 Logistic 回歸分析 CPNE3基因mRNA水平表達(dá)量及患者年齡與急性心肌梗死的關(guān)系

按CPNE3 基因的相對(duì)表達(dá)量cut off值將所有研究對(duì)象分為高表達(dá)組(2-△Ct>0.013)和低表達(dá)組(2-△Ct≤0.013)，進(jìn)一步采用逐步二元 Logistic 回歸分析CPNE3基因mRNA水平表達(dá)量、患者年齡與AMI的相關(guān)性。結(jié)果表明：CPNE3基因低表達(dá)、患者高齡是AMI的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與CPNE3高表達(dá)相比，CPNE3基因低表達(dá)組AMI的風(fēng)險(xiǎn)增加2.845倍，高齡使AMI風(fēng)險(xiǎn)增加了1.605倍。詳見表4。

表3 CPNE3基因mRNA表達(dá)量與患者年齡相關(guān)性分析

表4 急性心肌梗死獨(dú)立危險(xiǎn)因素logistic回歸分析結(jié)果

2.7 CPNE3基因相對(duì)表達(dá)量在急性心肌梗死診斷中的ROC曲線和cut off值

根據(jù)急性心肌梗死組和對(duì)照組各樣本實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 所得CPNE3相對(duì)表達(dá)量 2-△CT值繪制 ROC 曲線，見圖3。從圖3可知 CPNE3基因的相對(duì)表達(dá)量對(duì)急性心肌梗死的診斷具有一定的參考價(jià)值，曲線下面積(AUC)為0.684±0.040。以約登指數(shù)最大值確定的 CPNE3基因相對(duì)表達(dá)量cut off值0.024，診斷AMI的敏感度為0.690，特異性為0.648，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值68.6%，陰性預(yù)測(cè)值65.2%。

2.8CPNE3基因相對(duì)表達(dá)量與冠狀動(dòng)脈病變嚴(yán)重程度的相關(guān)性分析

根據(jù)冠狀動(dòng)脈造影結(jié)果，按照Gensini評(píng)分系統(tǒng)對(duì)所有研究對(duì)象冠狀動(dòng)脈病變嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)分[8]。分值越高代表冠狀動(dòng)脈狹窄越重。所有研究對(duì)象Gensini評(píng)分結(jié)果為25(9.5-52)，對(duì)CPNE3基因和Gensini分值進(jìn)行雙變量相關(guān)分析，結(jié)果顯示：CPNE3基因mRNA表達(dá)量與Gensini分值呈顯著負(fù)相關(guān)(rs=-0.200，P=0.018)，即CPNE3基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量越低，Gensini分值越高，冠狀動(dòng)脈病變則越重。

2.9CPNE3基因的相對(duì)表達(dá)量與心肌肌鈣蛋白I(TnI)的相關(guān)性

急性心肌梗死組心肌肌鈣蛋白檢測(cè)結(jié)果為0.790(0.138-8.760)ng/ml。血清肌鈣蛋白I(TnI)濃度的高低反應(yīng)了急性心肌梗死范圍的大小。血清TnI和CPNE3基因相對(duì)表達(dá)量的雙變量相關(guān)分析結(jié)果顯示：外周血中CPNE3基因表達(dá)量與血清TnI濃度無(wú)關(guān)(rs=-0.144，P=0.364)。即CPNE3基因mRNA水平表達(dá)量與心肌梗死的范圍無(wú)關(guān)。

2.10CPNE3基因相對(duì)表達(dá)量與急性心梗患者發(fā)病距采血時(shí)間的相關(guān)性

以急性心肌梗死患者過(guò)去一周內(nèi)初發(fā)的長(zhǎng)時(shí)間(≥20min)靜息痛作為發(fā)病時(shí)間點(diǎn)，急性心肌梗死組患者發(fā)病距采血的時(shí)間即為發(fā)病時(shí)間，結(jié)果為24(11-72)h。CPNE3基因相對(duì)表達(dá)量和急性心肌梗死發(fā)病時(shí)間相關(guān)分析結(jié)果顯示：外周血中CPNE3基因表達(dá)量與急性心肌梗死發(fā)病時(shí)間長(zhǎng)短無(wú)關(guān)(rs=-0.098，P=0.533)

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，與SCAD患者相比，AMI患者外周血CPNE3基因表達(dá)量無(wú)論在mRNA水平還是在蛋白表達(dá)水平均為低表達(dá)。Copine家族在細(xì)胞中的具體作用尚不明確，也有些證據(jù)顯示其可能參與了膜蛋白、脂質(zhì)以及其他活動(dòng)[9]。近來(lái)，多有報(bào)道關(guān)于CPNE3在癌癥中的作用，尤其是促使癌細(xì)胞遷移[10]。CPNE3與ErbB2相互作用促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，其在非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢腫瘤中均發(fā)揮作用[10-12]。CPNE3還被證實(shí)和精神分裂癥有關(guān)[13]。但是并沒(méi)有關(guān)于CPNE3在心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展中作用的研究。本研究在前期工作基礎(chǔ)之上，進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證了CPNE3基因在急性心肌梗死患者外周血中無(wú)論mRNA水平還是蛋白質(zhì)水平均為低表達(dá)。

雖然通路分析顯示，CPNE3基因廣泛參與著免疫調(diào)節(jié)，中性粒細(xì)胞脫顆粒，包括脂肪酸、甘油三酯、膽固醇等脂質(zhì)、脂蛋白和酮體等的代謝(fromREACTOME)。但是根據(jù)本組資料顯示，CPNE3基因的低表達(dá)和血糖、血清總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇并無(wú)相關(guān)性。故其促進(jìn)AMI的機(jī)制可能并非是通過(guò)影響血脂、血糖代謝。

盡管不明確CPNE3基因促使AMI發(fā)生的發(fā)病機(jī)制。但本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步通過(guò)二元Logistic回歸分析結(jié)果表明，CPNE3基因低表達(dá)是AMI的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，CPNE3基因低表達(dá)使SCAD患者患AMI的風(fēng)險(xiǎn)增加2.845倍，患者高齡是AMI獨(dú)立危險(xiǎn)因素，使AMI風(fēng)險(xiǎn)增加了1.605倍。

用CPNE3基因mRNA表達(dá)量來(lái)做ROC曲線結(jié)果表明：外周血CPNE3基因mRNA表達(dá)量可以用于診斷穩(wěn)定冠心病發(fā)展為急性心梗的遺傳標(biāo)志物，診斷AMI的敏感度為0.690， 特異性為0.648，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值68.6%，陰性預(yù)測(cè)值65.2%。因此CPNE3基因做為診斷AMI的生物標(biāo)記有一定的價(jià)值。

本研究結(jié)果還表明，CPNE3基因相對(duì)表達(dá)量與冠狀動(dòng)脈病變嚴(yán)重程度Gensini評(píng)分有關(guān)。Gensini評(píng)分應(yīng)用定量冠狀動(dòng)脈造影的方法，測(cè)定病變嚴(yán)重程度，對(duì)于不同病變程度采用不同的權(quán)重，評(píng)分的高低主要與冠狀動(dòng)脈狹窄程度及供血范圍相關(guān)[16]。即CPNE3基因的相對(duì)表達(dá)量越低，Gensini分值越高，則冠狀動(dòng)脈病變?cè)街?。因此，依?jù)本研究可以推測(cè)，CPNE3基因表達(dá)量與冠狀動(dòng)脈病變嚴(yán)重程度有關(guān)。

CPNE3基因表達(dá)量與心肌肌鈣蛋白I(TnI)的相關(guān)性分析證實(shí)CPNE3基因的表達(dá)量與心肌肌鈣蛋白的量無(wú)關(guān)，而心肌肌鈣蛋白的量反映心肌梗死的范圍，所以CPNE3基因的表達(dá)量可能與心肌梗死面積大小無(wú)關(guān)。同時(shí)本研究還表明CPNE3基因表達(dá)量與急性心肌梗死發(fā)病時(shí)間無(wú)關(guān)。發(fā)病時(shí)間即患者急性心肌梗死發(fā)病距采血的時(shí)間。一般認(rèn)為：如果CPNE3基因的低表達(dá)是伴隨急性心肌梗死發(fā)生的，那么CPNE3基因的表達(dá)量會(huì)與心肌肌鈣蛋白I(TnI)濃度及AMI發(fā)病時(shí)間均有相關(guān)性。如果CPNE3基因低表達(dá)是導(dǎo)致急性心肌梗死的病因之一，那么CPNE3基因的表達(dá)量會(huì)與心肌肌鈣蛋白I(TnI)濃度及AMI發(fā)病時(shí)間均無(wú)相關(guān)性。

故通過(guò)本研究結(jié)果，我們可以合理推測(cè)，CPNE3基因低表達(dá)可能通過(guò)影響冠狀動(dòng)脈病變，促進(jìn)了急性心肌梗死的發(fā)生。如果想要完全明確CPNE3基因低表達(dá)是否為急性心肌梗死的病因之一，尚需設(shè)計(jì)前瞻性研究來(lái)回答這一問(wèn)題。至少通過(guò)本研究證明，CPNE3并非通過(guò)影響空腹血糖、血清TC、TG、LDL-C水平促進(jìn)AMI發(fā)生。為明確CPNE3基因與糖代謝和脂類代謝以及進(jìn)一步的急性心肌梗死關(guān)系，有待對(duì)CPNE3基因的生物學(xué)功能進(jìn)一步明確。

結(jié)論：與SCAD患者相比，AMI患者外周血CPNE3基因低表達(dá)。CPNE3基因低表達(dá)是穩(wěn)定型冠心病向急性心肌梗死進(jìn)展中的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，CPNE3基因的低表達(dá)使AMI的風(fēng)險(xiǎn)增加了2.845倍。外周血CPNE3基因mRNA表達(dá)量可以用于診斷為急性心梗的遺傳標(biāo)記。CPNE3基因可能是通過(guò)影響冠狀動(dòng)脈血管，促進(jìn)了急性心肌梗死的發(fā)生，CPNE3基因是促進(jìn)穩(wěn)定冠心病患者發(fā)生急性心肌梗死的重要遺傳因素之一。

致謝：感謝吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院趙志輝教授及其團(tuán)隊(duì)對(duì)本研究提供的技術(shù)指導(dǎo)。

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新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃(2008)；吉林省科技廳資助(20090734)；吉林省財(cái)政廳資助(2012009)

*通訊作者

1007-4287(2017)09-1366-06

2017-02-26)