ALK在肺腺癌中表達(dá)情況的分析及靶向治療

劉麗波，苗 帥，韓志峰，薛錦儒，辛 華，楊 斌*

(1.吉林大學(xué)第四醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，吉林 長(zhǎng)春130011；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 a.老年病科；b.胸外科)

ALK在肺腺癌中表達(dá)情況的分析及靶向治療

劉麗波1，苗 帥2a，韓志峰2b，薛錦儒2b，辛 華2b，楊 斌2b*

(1.吉林大學(xué)第四醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，吉林 長(zhǎng)春130011；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 a.老年病科；b.胸外科)

表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)突變檢測(cè)及其EGFR-TKI的使用是非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)治療史上里程碑式的進(jìn)展[1]。繼EGFR之后，間變性淋巴瘤激酶(ALK)重排也己成為NSCLC尤其是肺腺癌中一個(gè)非常重要的分子亞型[2]。2007年Soda 等[3]首次在1 例肺腺癌組織標(biāo)本中擴(kuò)增出一種致瘤的變異融合基因—棘皮動(dòng)物微管相關(guān)類蛋白4-間變性淋巴瘤激酶(EML4-ALK)。隨后國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)該融合基因是除EGFR 突變及K-Ras 突變外的另一個(gè)重要的酪氨酸激酶抑制劑的作用靶點(diǎn)[4，5]。但鑒于ALK重排發(fā)生的陽(yáng)性率較低，采用FISH方法作為篩選手段價(jià)格昂貴。本研究采用特定的檢測(cè)流程，從特定的腺癌人群中篩選出EML4-ALK融合基因陽(yáng)性的患者，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院及吉林大學(xué)第四醫(yī)院2013-2015年手術(shù)切除和經(jīng)皮肺穿刺活檢病理確診的不吸煙或輕度吸煙96例肺腺癌患者石蠟包埋組織。年齡32-77歲，平均年齡59歲；男性23例(24.0%)，女性73例(76.0%)。所有病例術(shù)前均未行化療、放療或靶向治療。一生中吸煙< 100支定義為不吸煙。按2009 國(guó)際肺癌研究學(xué)會(huì)( IASLC) 公布的第7 版肺癌TNM 分期標(biāo)準(zhǔn):Ⅰ期6例，Ⅱ期12 例，Ⅲ期65 例，Ⅳ期13例。

采用實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)療效(RECIST，1.0 版)，療效判定包括完全緩解(CR)，部分緩解(PR)，疾病穩(wěn)定(SD)及疾病進(jìn)展(PD)。總緩解率(ORR)包括 CR 和PR。疾病控制率(DCR)包括 CR、PR和SD。本研究經(jīng)吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院倫理委員會(huì)及吉林大學(xué)第四醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取及定量 石蠟包埋組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟及無(wú)水乙醇脫水后，采用FFPE gDNA Miniprep Kit(BIOMIGA公司) 提取基因組DNA，所有步驟按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。DNA 提取后，用Nano-Drop fluorospectrometer(ND-1000，Thermal Fisher 公司) 檢測(cè)濃度，并且評(píng)估DNA質(zhì)量。選取260/280比值在1.8-2.0之間的DNA樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 用PCR-熒光探針?lè)?ARMS)檢測(cè)肺癌組織中EGFR、KRAS基因突變，按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

1.2.3 熒光原位雜交技術(shù)(FISH)檢測(cè)EML4-ALK融合基因 (1) FISH 檢測(cè)：采用直接法，Vysis LSI ALK 雙色分離重排探針試劑購(gòu)自美國(guó)雅培公司。切片行常規(guī)二甲苯脫蠟，100%、85%和70%乙醇依次梯度水化，蛋白酶K(80 mg/ml，pH 2.0) 消化處理;4%中性甲醛固定后，再行70%、85%和100%乙醇梯度脫水，加入5 μl探針于組織切片上;置于原位雜交儀( DAKO公司)中，75℃變性10 min，37℃雜交16 h;然后將切片置洗滌液Ⅰ(0.4×SSC，0.3%NP-40)1min，洗滌液Ⅱ(2×SSC，0.1% NP-40)1 min去除多余探針，室溫暗處干燥加DAPI染色，封固，暗處放置20 min后在熒光顯微鏡(Olympus公司)100倍油鏡下觀察，分別在DAPI、FITC、RHOD 通道下觀察細(xì)胞內(nèi)熒光信號(hào)并拍照記錄。

(2)結(jié)果判定方法:至少觀察50個(gè)腫瘤細(xì)胞，如果50個(gè)腫瘤細(xì)胞中至少有25個(gè)存在分離信號(hào)(>50%)則直接判斷為ALK FISH陽(yáng)性;如果這50個(gè)細(xì)胞中分離信號(hào)細(xì)胞為5-25個(gè)(10%-50%)，則再重復(fù)計(jì)數(shù)50個(gè)細(xì)胞，若這100個(gè)腫瘤細(xì)胞中，超過(guò)15個(gè)腫瘤細(xì)胞存在分離信號(hào)(15%)，則判定為ALK FISH陽(yáng)性。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19．0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，EML4-ALK 各組間表達(dá)水平與各臨床病理參數(shù)之間的比較采用χ2檢驗(yàn)、連續(xù)校正χ2檢驗(yàn)或Fisher 精確概率。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.5 克里唑替尼靶向治療 (1)靶向治療對(duì)象：選取熒光原位雜交(FISH)檢測(cè)ALK融合基因陽(yáng)性患者行克里唑替尼靶向治療。(2)藥物及劑量：克里唑替尼由美國(guó)輝瑞公司提供，250毫克，每日兩次口服。(3)靶向治療療效分析：①.選取靶向治療開(kāi)始后8周考察患者對(duì)克里唑替尼靶向治療的反應(yīng)率。②.選取8周、6個(gè)月及1年為時(shí)間點(diǎn)考察客觀緩解率(ORR)和疾病控制率(DCR)，其中療效判定按標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)體瘤反應(yīng)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)分類(RECIST)。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)96例不吸煙或輕度吸煙肺腺癌患者進(jìn)行了EML4-ALK、EGFR、KRAS的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在中國(guó)肺腺癌患者中各種基因所占比例:EGFR(39/96,43.3%)、KRAS (20/96,20.8%)、EML4-ALK (8/96,8.3%)。

2.2 37例EGFR突變及KRAS突變雙野生型患者8例ALK陽(yáng)性(21.6%，8/37)。統(tǒng)計(jì)分析顯示，ALK陽(yáng)性患者與ALK陰性患者年齡無(wú)差異(52.5歲vs.58歲，P=0.083)。男性和女性患者中ALK陽(yáng)性率無(wú)差異(2/10,20.0%;6/27,22.2%,P=1.000 )。不同分期患者ALK陽(yáng)性率也未見(jiàn)差異(P=1.000)。8例ALK陽(yáng)性腫瘤中，6例(75.0%)為紅綠分離信號(hào)，2例(25.0%)為單紅信號(hào)。見(jiàn)表1。

表1 EML4-ALK融合基因陽(yáng)性患者的臨床特征與陽(yáng)性率的關(guān)系

2.3 靶向治療結(jié)果，因病例數(shù)較少無(wú)法進(jìn)行克里唑替尼的客觀緩解率(ORR)和疾病控制率(DCR)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，單純進(jìn)行臨床療效觀察，每6-8周隨訪一次，截止隨訪時(shí)間1年，其中CR 1例，PR 3例，SD 2例，PD 2例?？陀^緩解率(ORR)和疾病控制率(DCR)分別為50%和75%。患者耐受性良好，生存質(zhì)量明顯提高。

3 討論

間變性淋巴瘤激酶是目前非小細(xì)胞肺癌中研究較多的驅(qū)動(dòng)基因[6]。ALK基因位于人類2號(hào)染色體短臂2p23區(qū)，它可與5號(hào)染色體上的啟動(dòng)子序列NPM(nucleophosmin)轉(zhuǎn)位進(jìn)行融合，導(dǎo)致ALK激酶的組成性激活。目前，ALK基因的異常激活驅(qū)動(dòng)著多種腫瘤的形成，其活化形式包括基因重排，突變和基因擴(kuò)增等。依賴ALK基因異常來(lái)驅(qū)動(dòng)其生長(zhǎng)被稱為“ALKOMA”，這一類腫瘤擁有共同的驅(qū)動(dòng)靶點(diǎn)，并能從ALK靶向治療中獲益。EML4基因斷裂后與ALK基因的24號(hào)外顯子融合，形成EML4-ALK融合基因;EML4斷裂位點(diǎn)不同可以與ALK形成不同的EML4-ALK融合基因變體。

ALK融合基因檢測(cè)目前有FISH、RT-PCR和IHC等三種主要檢測(cè)手段，各種方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)。本研究采用原位免疫熒光法進(jìn)行檢測(cè)以期達(dá)到最準(zhǔn)確的結(jié)果。

既往研究顯示，EML4-ALK 融合基因在東亞地區(qū)肺癌患者中的發(fā)生率約為3%-7%，且更易表達(dá)于肺腺癌這一組織學(xué)亞型中[7]。林小梅等[8]報(bào)道在102 例國(guó)人NSCLC 患者中發(fā)現(xiàn)EML4-ALK融合基因的陽(yáng)性表達(dá)率為7.8% (8/102)，且EML4-ALK 陽(yáng)性患者中腺癌占62.5%。Shaw等[9]通過(guò)大樣本臨床研究發(fā)現(xiàn)歐美人群EML4-ALK 的陽(yáng)性表達(dá)率為13.5%(19/141)，EML4-ALK 融合基因型者多為年輕男性、不吸煙或輕度吸煙的腺癌患者。而在本研究中EML4-ALK融合基因陽(yáng)性表達(dá)率為8.3%，由于本研究中EML4-ALK 融合基因陽(yáng)性患者樣本量較小，表現(xiàn)出其在年輕女性患者中多見(jiàn)，與既往研究結(jié)果不相符[10]，因此仍需大樣本資料作進(jìn)一步研究。許多臨床前研究都證實(shí)ALK抑制劑能顯著抑制具有EML4-ALK融合基因的腫瘤生長(zhǎng)[11]。多個(gè)臨床試驗(yàn)也已證實(shí)克里唑替尼可以給具有ALK重排的患者帶來(lái)非常明顯的獲益[12，13]，然而并不是所有的ALK重排患者都能從克里唑替尼治療中獲益。

本研究中96例肺腺癌不吸煙或輕度吸煙患者進(jìn)行了EML4-ALK、EGFR、KRAS的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在中國(guó)北方肺腺癌患者中各種基因所占比例:EGFR (39/96,43.3%)、KRAS (20/96,20.8%)、EML4-ALK(8/96,8.3%)。37例EGFR突變及KRAS突變雙野生型患者8例ALK陽(yáng)性(21.6%，8/37)。ALK陽(yáng)性患者與ALK陰性患者年齡無(wú)差異，與文獻(xiàn)報(bào)道不一致[14]，可能與病例數(shù)較少有關(guān)。男性和女性患者中ALK陽(yáng)性率無(wú)差異，但從數(shù)量上看女性患者多于男性患者。不同分期患者ALK陽(yáng)性率未見(jiàn)差異，但從表中所見(jiàn)ALK陽(yáng)性患者多分期較晚。

因本組病例數(shù)較少，無(wú)法進(jìn)行克里唑替尼的總緩解率(ORR)和疾病控制率(DCR)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，單純進(jìn)行臨床療效觀察，每6-8周隨訪一次，截止隨訪時(shí)間1年，其中CR1例，PR3例，SD2例，PD2例?？陀^緩解率(ORR)和疾病控制率(DCR)分別為50%和75%。尤其其中一例完全緩解的患者，為一中年女性，右下肺腺癌，雙側(cè)胸膜轉(zhuǎn)移伴大量胸腔積液，給予克里唑替尼治療8周后，胸腔積液完全消失，6個(gè)月后右肺腫物減小50%以上，且伴有中心壞死，表現(xiàn)出非常好的治療效果。

包括激酶抑制劑在內(nèi)的抗腫瘤藥物的一個(gè)主要問(wèn)題是毒性作用，最常見(jiàn)的不良反應(yīng)為惡心、嘔吐、乏力、腹瀉。本組患者未見(jiàn)嚴(yán)重毒性反應(yīng)，總體耐受性良好。

通過(guò)本研究我們獲得了在我國(guó)北方特定的人群中(肺腺癌不吸煙或輕度吸煙，EGFR、KRAS雙野生型)EML4-ALK的表達(dá)情況，同時(shí)通過(guò)對(duì)ALK陽(yáng)性患者的靶向治療，觀察了克里唑替尼靶向治療的療效和毒性反應(yīng)，為我國(guó)北方ALK陽(yáng)性患者的靶向治療積累了一定的經(jīng)驗(yàn)，未來(lái)的研究需要提高樣本量或開(kāi)展多中心合作，并需要大量的隨訪研究，為EML4-ALK融合基因的研究提供更充分的依據(jù)。隨著EML4-ALK 抑制劑克里唑替尼靶向治療的逐漸開(kāi)展，將給這類亞型的肺癌患者帶來(lái)新的個(gè)體化靶向治療機(jī)會(huì)[15，16]。

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吉林省衛(wèi)生計(jì)生委(2014ZC045)；吉林省科技廳國(guó)際合作處(3D513N203430)

*通訊作者

1007-4287(2017)09-1343-03

2016-04-11)