通遼地區(qū)大腸埃希菌耐藥性與Ⅰ類整合子關(guān)系研究

于 新,何成彥，魏學(xué)峰,郭鐘賀,黃紅蘭*

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 檢驗(yàn)科，吉林 長春130033；2.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病原生物學(xué)系，吉林 長春130021)

通遼地區(qū)大腸埃希菌耐藥性與Ⅰ類整合子關(guān)系研究

于 新1,何成彥1，魏學(xué)峰2,郭鐘賀2,黃紅蘭2*

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 檢驗(yàn)科，吉林 長春130033；2.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病原生物學(xué)系，吉林 長春130021)

目的了解通遼地區(qū)大腸埃希菌臨床分離株中I類整合子分布情況及基因盒類型，初步探討耐藥與整合子之間的關(guān)系。方法收集2013年10月-2014年3月通遼市某醫(yī)院的非重復(fù)菌株作為試驗(yàn)菌株，采用Kirby-Bauer紙片法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)；采用PCR方法擴(kuò)增Ⅰ類整合酶基因，在此基礎(chǔ)上擴(kuò)增Ⅰ類整合子可變區(qū)，對部分基因盒陽性菌株測序并分析。結(jié)果99株大腸埃希菌臨床分離株對所試23種抗生素中的13種耐藥率高于50%，主要為對青霉素、磺胺類藥物、頭孢菌素等；Ⅰ類整合酶檢出55株，檢出率為55.56%；基因盒攜帶有36株，攜帶率為65.46%；共檢出4種基因盒，共兩種組合形式arr-3-dfrA27和dfrA17-AadA5。結(jié)論大腸埃希菌的耐藥性與Ⅰ類整合子的存在有很大關(guān)系，dfrA17-AadA5是常見的基因盒組合形式。

大腸埃希菌；耐藥性；整合子

(ChinJLabDiagn,2017,21:1316)

大腸埃希菌廣泛存在于自然界中，可引起兒童的腦膜炎、敗血癥、泌尿道感染等多種感染性疾病[1-3]，嚴(yán)重威脅了人類的健康和日常生活。中國作為人均使用抗生素的大國，由于抗生素的大量、不規(guī)范使用，使得大腸埃希菌這類菌群的耐藥機(jī)率，呈現(xiàn)逐年升高現(xiàn)象。整合子是一類可移動的基因元件，在耐藥基因的水平傳播中肩負(fù)著至關(guān)重要的任務(wù)[4]。本研究通過認(rèn)識通遼相關(guān)區(qū)域臨床大腸埃希菌株Ⅰ類整合子的分布情況及耐藥基因盒的類型，來初步探究Ⅰ類整合子與這些菌株耐藥性之間存在的關(guān)系和相互影響，從而為臨床耐藥研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 2013年10月-2014年3月收集于通遼市某醫(yī)院(已排除同一患者同一病患處重復(fù)菌株)，應(yīng)用常規(guī)方法分離鑒定并保存，經(jīng)梅里埃VITEK-2 COMPACT 全自動細(xì)菌鑒定/藥敏分析系統(tǒng)鑒定。臨床藥物敏感性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株ATCC25922采購自吉林省臨床檢驗(yàn)中心。

1.1.2 主要試劑與儀器 頭孢唑啉(CFZ)、頭孢噻肟(CTX)、頭孢吡肟(FEP)、慶大霉素(GEN)、氨曲南(ATM)、氨芐西林(AMP)、左氧氟沙星(LEV)、頭孢克洛(CEC)、復(fù)方新諾明(STX)、環(huán)丙沙星(CIP)、亞胺培南(IMP)、頭孢哌酮/舒巴坦(CSF)、頭孢西丁(FOX)、美羅培南(MEM)、頭孢曲松(CRO)、哌拉西林(PIP)、阿莫西林/棒酸(AMC)、氨芐西林/舒巴坦(AMS)、頭孢呋辛酯(CFX)、阿米卡星(AMK)、哌拉西林/他唑巴坦(TZP)、頭孢他啶(CAZ)、四環(huán)素(TCY)(購自英國Oxoid公司)。使用儀器主要有PCR儀(美國賽默飛公司)，凝膠成像儀(上海天能公司)，VITEK-II全自動微生物鑒定藥敏分析儀(法國生物梅里埃公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離鑒定與藥敏試驗(yàn) 采用 Kirby-Bauer紙片擴(kuò)散法對分離鑒定的實(shí)驗(yàn)菌株行抗菌藥物的敏感性檢測，根據(jù)CLSI/NCCLS2005 年標(biāo)準(zhǔn)判斷細(xì)菌的耐藥情況。

1.2.2 大腸埃希菌總DNA提取 采取水煮法[5]提取菌株中的總DNA分子，分裝后-20℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 測試Ⅰ類整合子-基因盒系統(tǒng)及耐藥基因序列分析結(jié)果 按照參考文獻(xiàn)[6,7]設(shè)計(jì)引物，用以擴(kuò)增Ⅰ類整合酶與Ⅰ類整合子可變區(qū)，引物序列見表1。反應(yīng)體系：2×Master Mix 12.5 μl，上下游引物各1 μl，模板DNA 1 μl，ddH2O 8.5 μl。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃ 5 min；變性94℃ 30 s，退火58℃ 30 s，延伸72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；最后延伸72℃ 1 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳運(yùn)行110v 30 min后EB(溴化乙錠)染色，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察目的條帶。

表1 PCR引物序列

1.2.4 Ⅰ類整合子-基因盒中耐藥基因分析 隨機(jī)選取4株基因盒陽性菌株(j53、j49、j48、j57)的PCR產(chǎn)物，交由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序，得到的測序結(jié)果，在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行核酸序列同源性分析(BLASTn)。

2 結(jié)果

2.1 菌株藥物敏感試驗(yàn)的檢測結(jié)果

在所試抗菌藥物中，99株大腸埃希菌對碳青霉烯類抗生素如美羅培南和亞胺培南等敏感度較高，其耐藥率為5%和7%；對氨芐西林耐藥率高達(dá)83%；而對頭孢呋辛、慶大霉素、四環(huán)素、復(fù)方新諾明、氨芐西林/舒巴坦等的耐藥率，則超過了50%。具體耐藥結(jié)果見表2。

2.2 含Ⅰ類整合酶的菌株篩選結(jié)果

以483 bp處出現(xiàn)條帶判定該菌株為含有Ⅰ類整合酶的陽性菌株，若無條帶出現(xiàn)則判定為不含有Ⅰ類整合酶。99株菌中，共有55株(陽性率55.56%)在約500 bp處出現(xiàn)特異性條帶，提示其所對應(yīng)菌株可能攜有Ⅰ類整合子。PCR產(chǎn)物部分電泳圖見圖1。

M：DL2000 Maker j47-j60：大腸桿菌

2.3攜有Ⅰ類整合子-基因盒大腸埃希菌菌株的耐藥分析

以前面獲得的這55株菌株的DNA分子作為反應(yīng)模板，以表1中的引物擴(kuò)增Ⅰ類整合子的可變區(qū)，共出現(xiàn)36個(gè)Ⅰ類整合子陽性菌株(陽性率36.4%)，大小均在1 000 bp-2 000 bp之間，這些菌株中，其中19株菌株未檢出基因盒。分析基因盒攜帶與否與大腸埃希菌耐藥率之間的關(guān)系(見表3)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，比較23種抗菌藥物的耐藥情況，基因盒陰性的菌株耐藥率普遍低于陽性菌株。經(jīng)Fisher精確檢驗(yàn)可見，兩組大腸埃希菌對于氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林、頭孢呋辛、阿莫西林/棒酸、左氧氟沙星、氨曲南、阿米卡星的耐藥性差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。任意選取4株耐藥相關(guān)基因盒陽性菌株的PCR產(chǎn)物測序，經(jīng)BLASTn比對分析發(fā)現(xiàn)，四株菌中均含有不同種類的耐藥基因盒，j53株含arr-3與dfrA27，j57、j49均攜帶dfrA17和AadA5?？梢奷frA17-AadA5是所測菌中比較常見的耐藥基因攜帶形式。

表2 99株大腸埃希菌耐藥情況統(tǒng)計(jì)分析

表3 基因盒陽性菌株耐藥分析

3 討論

從全國細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)站提供的數(shù)據(jù)不難看出，在近年來大力控制抗生素用藥的背景下，臨床分離大腸埃希菌對喹諾酮類和碳青霉烯類以及三代頭孢菌素等的耐藥程度有所降低，但同比世界其他國家，我國仍處于較高的耐藥水平，說明控制臨床抗生素的耐藥情況任重道遠(yuǎn)，需要全國范圍的醫(yī)務(wù)人員共同努力，嚴(yán)格把關(guān)。整合子作為天然的水平轉(zhuǎn)移元件，不但可以跨過種屬，更可以在細(xì)菌與真菌中介導(dǎo)耐藥基因之間的傳遞[8]。在本研究中，99株大腸埃希菌的菌株，對所試23種抗生素其中13種抗生素的耐藥率均超過50%，對亞胺培南和美羅培南兩者較敏感，但耐藥程度仍大于國內(nèi)其它報(bào)道[9]。目前比較常見的與大腸埃希菌耐藥緊密相連的整合子有3類，本文主要探究了Ⅰ類整合子-基因盒在這一過程中的作用。通過PCR技術(shù)篩選出55株大腸埃希菌含有Ⅰ類整合酶，陽性率為55.56%，與國內(nèi)報(bào)道基本相近[10]，說明在抗生素大量使用這種社會環(huán)境下，細(xì)菌耐藥性的形成在人群中具有普遍性。PCR擴(kuò)增Ⅰ類整合酶陽性菌株的Ⅰ類整合子可變區(qū)時(shí)，36株菌株為陽性結(jié)果，基因盒陽性菌株的耐藥率普遍高于陰性菌株，通過4株大腸桿菌整合子可變區(qū)測序結(jié)果分析顯示，本實(shí)驗(yàn)中共出現(xiàn)arr-3、dfrA27、dfrA17和AadA5四種基因盒，有兩種組合方式，其中dfrA17-AadA5的組合形式比較常見，有arr-3 利福平ADP-核糖基化轉(zhuǎn)移酶，dfrA17編碼二氫葉酸還原酶，介導(dǎo)磺胺類藥物甲氧芐啶耐藥，AadA5編碼鏈霉素3’-腺苷?；D(zhuǎn)移酶,介導(dǎo)對鏈霉素、慶大霉素等的耐藥，可發(fā)現(xiàn)其中攜帶的基因盒類型與藥敏試驗(yàn)結(jié)果不太符合，間接說明了整合子只是參與了細(xì)菌耐藥機(jī)制的形成過程，而細(xì)菌對抗生素耐藥的分子機(jī)制是受多種因素共同作用。

隨著抗生素最后一道防線多粘菌素的突破，超級細(xì)菌的出現(xiàn)警示了合理用藥的迫切需要。本文初步探討了大腸埃希菌耐藥與Ⅰ類整合子-基因盒之間密切關(guān)系，為更深入了解細(xì)菌產(chǎn)生耐藥的分子機(jī)制和抗菌新藥物的研究與發(fā)現(xiàn)提供更多可靠依據(jù)。

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Correlationofantimicrobialresistancepatternswithclass1integronsinEscherichiacoliisolatesfromTongliaoarea

YUXin,HECheng-yan,WEIXue-feng,etal.

(DepartmentofClinicalLaboratory,China-JapanUnionHospitalofJilinUniversity,Changchun130033,China)

ObjectiveTo understand the distribution situation of class 1 integrons and Gene cassette type,inquire the relation between antimicrobial and resistance patterns.MethodsCollect non-repetitive strains in Tongliao Hospital from Oct.,2013 to Mar.2014 as trial bacterial strain,and use K-B method for drug sensitive tests,and use PCR method to amplify the class 1 integrons.And then use the result to amplify class 1 integron variable region and analyze the partial gene cassette positive strains.ResultsAntimicrobial susceptibility testing revealed that among the 99 clinical escherichia coli,there is more than 50% (>50%) of the isolates were resistant to 13 out of 23 antibiotics tested in this study,mainly is against penicillin,sulfonamide,cephalosporin and etc.PCR and DNA sequencing analysis revealed the presence of class I integrons is 55 isolates,i.e.relevance ratio 55.6%;gene cassettes of class I integrons is 36 isolates,i.e.carrier ratio 65.46%;there are 4 types of gene cassettes been tested,combined in 2 patterns,one was dfrA17 and aadA5,the other was aar-3 and dfrA27.ConclusionThe resistance of escherichia coli exhibited significant impact on the expression level of class I integrase,dfrA17 and aadA5 is a common form of gene cassettes combination.

Escherichia coli;Antibiotic Resistance;Integron

*通訊作者

1007-4287(2017)09-1316-04

R378.2+1

：A

2016-03-22)