PLEKHQ1基因敲除小鼠的永生化骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞系的建立*

陸 琤 周晨辰 張鵬飛 張 硌 查玉華*

PLEKHQ1基因敲除小鼠的永生化骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞系的建立*

陸 琤①周晨辰①?gòu)堸i飛①?gòu)?硌①查玉華①*

目的：建立PLEKHQ1基因敲除小鼠的永生化骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞系，為PLEKHQ1基因功能的研究奠定基礎(chǔ)。方法：用慢病毒感染的方法將包裝質(zhì)粒pCDH-SV40/GFP導(dǎo)入野生型和PLEKHQ1基因敲除小鼠的骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞，建立永生化細(xì)胞系；觀察永生化細(xì)胞的生物學(xué)性狀，用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)目的基因的整合，用RT-PCR鑒定目的基因的表達(dá)，并對(duì)永生化和非永生化骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況進(jìn)行比較。結(jié)果：構(gòu)建的骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞系已擴(kuò)大培養(yǎng)并穩(wěn)定傳代，經(jīng)鑒定，SV40LT抗原已整合入細(xì)胞并穩(wěn)定表達(dá)。結(jié)論：通過(guò)慢病毒感染細(xì)胞的方法成功構(gòu)建了PLEKHQ1基因敲除小鼠的永生化骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞系。

PLEKHQ1基因敲除小鼠；骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞；永生化；SV40LT抗原

基因PLEKHQ1(pleckstrin homology domain containing，family Q member 1)，又被稱(chēng)為基因PLEKHO2(pleckstrin homology domain containing，family O member 2)，是一種包含490個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，屬于含有Pleckstrin同源區(qū)結(jié)構(gòu)域(Pleckstrin homolgy domain，PHD)的蛋白超家族，目前尚無(wú)文獻(xiàn)專(zhuān)門(mén)對(duì)其功能進(jìn)行報(bào)道[1]。本研究的前期實(shí)驗(yàn)研究表明，PLEKHQ1可能在巨噬細(xì)胞的功能調(diào)控中發(fā)揮作用。因此，通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease，TALEN)技術(shù)[2-6]剪切PLEKHQ1外顯子DNA，使DNA發(fā)生修復(fù)后形成移碼突變，從而使控制PLEKHQ1蛋白表達(dá)的基因失活，得到PLEKHQ1基因敲除小鼠，經(jīng)過(guò)繁殖篩選后，分離其骨髓細(xì)胞并誘導(dǎo)成巨噬細(xì)胞進(jìn)行研究[7]。但是，原代培養(yǎng)的骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞(bone marrow-derived macrophage，BMDM)生存期短，傳代次數(shù)有限，分離原代細(xì)胞不但工作量巨大，而且由于每批細(xì)胞來(lái)源于不同的個(gè)體，不可避免存在差異，限制了研究工作的開(kāi)展。因此，有必要建立穩(wěn)定的細(xì)胞系以便深入研究PLEKHQ1的功能。本研究采用慢病毒介導(dǎo)的方法，將SV40LT整合至野生型(wild type，WT)小鼠和PLEKHQ1基因敲除(knockout，KO)小鼠的BMDM基因組，使其永生化，為進(jìn)一步探討PLEKHQ1基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

(1)C57BL/6 PLEKHQ1基因敲除及野生型小鼠各1只，均為雄鼠，包裝質(zhì)粒PMD、SPA、pCDHSV40/GFP，均由本實(shí)驗(yàn)室保存；293TX細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存；Q5超保真DNA聚合酶購(gòu)自(英國(guó)NEB公司)；Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen Life Technologies公司；RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司；血清購(gòu)自Hyclone；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；細(xì)胞DNA、RNA提取試劑盒均購(gòu)自(北京)TIANGEN公司。其余常用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)引物由北京天一輝遠(yuǎn)有限公司合成。

(2)GL-1800型梯度基因擴(kuò)增(PCR)儀(美國(guó)伯樂(lè)，BIO-RAD，C1000 Touch)；Thermo LABOFUGE 400R型低溫離心機(jī)(美國(guó)Thermofisher公司)；WD-9413B型凝膠成像分析儀(北京市六一儀器廠)；BIORAD，TC20細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(美國(guó)伯樂(lè)公司)；EX 450-490 DM 505 BA520型熒光倒置顯微鏡(日本尼康，Nikon Eclipse Ts 100)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

將C57BL/6小鼠脫頸處死后，無(wú)菌條件下取后肢骨，將股骨和脛骨中的骨髓沖入培養(yǎng)皿中，此過(guò)程重復(fù)2次。過(guò)濾，加入紅細(xì)胞裂解液靜置10 min。1000 r/min，離心5 min，棄上清，1 ml培養(yǎng)基重懸骨髓細(xì)胞，接種于60 mm培養(yǎng)皿內(nèi)。加入含20%的L929上清條件培養(yǎng)基，刺激骨髓細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化。放置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于3 d換液1次，約8 d后貼壁細(xì)胞為巨噬細(xì)胞。

1.2.2 SV40LT慢病毒的包裝

293TX細(xì)胞于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)接種于60 mm培養(yǎng)皿中，用含10%血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。將PMD 1 μg、SPA 3 μg、pCDH-SV40/GFP 4 μg與100 μl無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)基溫和混勻，Lipofectamine 2000 16與100 μl無(wú)血清RPMI1640溫和混勻，室溫靜置5 min，再將二者混勻，室溫靜置20 min，將混合液緩慢滴入293TX細(xì)胞中，即完成轉(zhuǎn)染過(guò)程。轉(zhuǎn)染后8 h或過(guò)夜后換液，24～36 h收1次上清，補(bǔ)液5 ml。約72 h后再收上清，3 000 r/min 離心5 min，使得細(xì)胞等雜質(zhì)沉淀，取上清用0.22 μm濾器過(guò)濾后加入millipore超濾離心管，3 000 r/min，離心5 min，后得約200 μl濃縮病毒，于-40 ℃保存或立刻使用。

1.2.3 骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞的感染及培養(yǎng)

待感染的BMDM少量接種至12孔板中的1孔，加入濃縮病毒20 μl，感染后72 h，在倒置熒光顯微鏡下，激發(fā)光于450～490 nm藍(lán)光波長(zhǎng)照射下，觀察BMDM感染情況，判定感染率。

1.2.4 SV40T基因在BMDM中的整合及表達(dá)

(1)PCR擴(kuò)增。收集PLEKHQ1基因KO小鼠及WT小鼠非永生化BMDM及永生化BMDM，提取基因組DNA。根據(jù)SV40大T抗原基因序列設(shè)計(jì)引物，上游引物5＇-CGCAGTGAGTTTTTGTTAGA-3＇；下游引物5＇-TGTGGTATGGCTGATTATGA-3＇，擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)為391 bp。使用Q5高保真聚合酶，反應(yīng)條件：預(yù)變性98 ℃ 30 s，然后98 ℃ 10 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，34個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸2 min，4 ℃保持。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

(2)RT-PCR分析。按TIANGEN試劑盒操作法提取細(xì)胞RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。SV40大T抗原基因引物序列及大小同上。內(nèi)參β-肌動(dòng)蛋白，上游引物為：5＇-CCTAGAAGCATTTGCGGTGCACGA TG-3＇，下游引物為：5＇-CATCGTGCACCGCA AATGCTTCTAGG-3＇，擴(kuò)增產(chǎn)物為260 bp，反應(yīng)條件同上，PCR產(chǎn)物用1% 瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.5 KO小鼠的原代BMDM和永生化BMDM生長(zhǎng)情況比較

取KO小鼠的原代BMDM和永生化第5代BMDM各接種3個(gè)孔至24孔板中，每孔接種10 000個(gè)細(xì)胞，用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀每隔1 d計(jì)數(shù)取平均值，連續(xù)15 d，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

2 結(jié)果

2.1 永生化BMDM的生物學(xué)性狀

BMDM具有粘附平展能力，在體外培養(yǎng)中呈貼壁生長(zhǎng)。以KO小鼠為例，在平皿中可看到呈梭形、星形或圓形的貼壁細(xì)胞，有許多偽足和凸起。永生化的BMDM與非永生化的BMDM相比，在形態(tài)結(jié)構(gòu)上無(wú)明顯差異，但能見(jiàn)到較多的細(xì)胞分裂相。在熒光顯微鏡下觀察，前者能觀察到綠色熒光，而后者觀察不到。如圖1所示。

2.2 BMDM中SV40的PCR擴(kuò)增結(jié)果

使用質(zhì)粒pCDH-SV40/GFP作陽(yáng)性對(duì)照，對(duì)WT小鼠非永生化BMDM、WT小鼠第5代永生化BMDM、KO小鼠非永生化BMDM和KO小鼠第5代永生化BMDM，提取基因組DNA，后進(jìn)行PCR，產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析。結(jié)果3號(hào)條帶和5號(hào)條帶在391 bp處有一特異擴(kuò)增條帶，與1號(hào)條帶位置相同，而2號(hào)條帶和4號(hào)條帶在該處無(wú)擴(kuò)增條帶，如圖2所示。

2.3 BMDM中SV40的RT-PCR結(jié)果

永生化BMDM，無(wú)論是WT小鼠的還是KO小鼠的，有特異性擴(kuò)增條帶，大小為391 bp，而非永生化的BMDM未見(jiàn)該條帶，內(nèi)參為β-肌動(dòng)蛋白，大小為260 bp，如圖3所示。

2.4 永生化BMDM和原代BMDM生長(zhǎng)情況比較

將KO小鼠的第5代永生化BMDM與原代BMDM生長(zhǎng)速率進(jìn)行比較，二者均在培養(yǎng)第3 d進(jìn)入快速增長(zhǎng)期，但前者一直保持較快速率生長(zhǎng)，而后者在培養(yǎng)約兩周后生長(zhǎng)緩慢，進(jìn)入平臺(tái)期，如圖4所示。

圖3 SV40T mRNA在非永生化BMDM和永生化BMDM中的表達(dá)電泳圖

圖4 KO小鼠永生化BMDM和原代BMDM生長(zhǎng)情況示圖

3 結(jié)論

前期的研究結(jié)果表明，PLEKHQ1基因可能參與細(xì)胞因子與受體的相互作用，可能在調(diào)控細(xì)胞炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，且表達(dá)譜數(shù)據(jù)顯示其在巨噬細(xì)胞中特異高表達(dá)，因而本研究選擇小鼠巨噬細(xì)胞來(lái)進(jìn)行PLEKHQ1基因的研究。但前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，原代培養(yǎng)的BMDM生長(zhǎng)緩慢、生存期短，限制了實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展[1]。因此，迫切需要建立永生化的骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞系，為下一步研究打下基礎(chǔ)。

永生化細(xì)胞是體外培養(yǎng)細(xì)胞自發(fā)的或在外界因素影響下獲得無(wú)限增殖能力的細(xì)胞[8]。建立永生化BMDM是實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化的重要基礎(chǔ)。有些研究建立永生化細(xì)胞系只是單純用轉(zhuǎn)染的方法直接將pCDH-SV40/GFP導(dǎo)入細(xì)胞，效果不好，而本實(shí)驗(yàn)研究先將pCDH-SV40/GFP包裝成慢病毒，再用慢病毒去感染細(xì)胞，能建立更加穩(wěn)定的永生化細(xì)胞系

SV40是20世紀(jì)60年代發(fā)現(xiàn)的一種猴腎細(xì)胞病毒，目前被廣泛用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的建立和各種人類(lèi)及動(dòng)物細(xì)胞的永生化，SV40 T抗原基因的導(dǎo)入能加快轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長(zhǎng)速率，同時(shí)也能保留其原始細(xì)胞的許多分化表型，可作為體外研究原始細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞模型[9-13]。本研究就是利用SV 40的這些特點(diǎn)，用慢病毒包裝并感染目的細(xì)胞的方法將BMDM永生化。本研究結(jié)果顯示，利用SV40T基因使WT和KO小鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞永生化是一種可行、可重復(fù)的建系方法，且該永生化細(xì)胞系已穩(wěn)定培養(yǎng)了半年，為PLEKHQ1基因的功能研究提供了可實(shí)行的方法和手段，成功構(gòu)建了PLEKHQ1基因敲除小鼠的永生化骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞系。

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Establishment of an immortalized bone marrow-derived macrophage cell line in PLEKHQ1 knockout mouse/

LU Cheng, ZHOU Chen-chen, ZHANG Peng-fei, et al//
China Medical Equipment,2017,14(9):167-170.

Objective: To establish an immortalized bone marrow-derived macrophage(BMDM) cell line in PLEKHQ1 knockout mouse so as to pave the way for further studies on the function of PLEKHQ1 gene. Methods: Packaging plasmid pCDH-SV40/GFP was transfected into wild type mouse BMDM and PLEKHQ1 knockout mouse BMDM by the means of lentivirus infection so as to establish immortalized cell lines. The cell morphology of immortalized cell lines was observed and Polymerase chain reaction(PCR)was used to detect the integration of the target gene, and RTPCR was used to identified the expression of target gene. The proliferation between the immortalized BMDM and nonimmortalized BMDM was compared and analyzed in the finally. Results: The established immortalized BMDM cell line has achieved stable growth and serial propagation, and the results of identification showed that SV40LT antigen gene has been integrated in cell and been stably expressed. Conclusion: An immortalized BMDM cell line of PLEKHQ1 knockout mouse has been successfully established by the mean of. lentivirus infecting cells.

PLEKHQ1 knockout mouse; Bone marrow-derived macrophage; Immortalization; SV40 LT antigen

Department of Medical Engineering, The Affiliated Hospital to Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100071, China.

1672-8270(2017)09-0167-04

R516.8

A

10.3969/J.ISSN.1672-8270.2017.09.047

2017-06-07

國(guó)家自然科學(xué)基金(31400739)“PH結(jié)構(gòu)域蛋白PLEKHQ1協(xié)調(diào)巨噬細(xì)胞遷移與激活的機(jī)制研究”；軍事醫(yī)學(xué)創(chuàng)新基金(2015CXJJ29)“PLEKHQ1調(diào)控細(xì)菌性膿毒敗血癥的功能和機(jī)制研究”

①軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)工程科 北京 100071

*通訊作者：ygk307@sina.com

陸琤,女,(1987- ),碩士，助理工程師。軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)工程科，從事細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究工作。