CARD9在感染性疾病中的研究進展

曹 靜 張福仁

CARD9在感染性疾病中的研究進展

曹 靜1,2張福仁1,2

胱天蛋白酶募集域蛋白9(CARD9)是CARD蛋白家族中的一員，是重要的銜接蛋白，通過蛋白-蛋白相互作用調(diào)節(jié)細胞內(nèi)信號傳遞。CARD9能高效整合多種固有免疫受體的識別信號，在機體對真菌、細菌、病毒等的識別和抵抗方面起重要作用。近年來有多例因CARD9缺陷導致的深部真菌病和泛發(fā)性復發(fā)性皮膚黏膜真菌感染的病例報道，使得CARD9在感染性疾病中的研究日益受到關注。本文就CARD9在感染性疾病中的分子調(diào)控機制進行了綜述。

胱天蛋白酶募集域蛋白； 感染性疾??； 固有免疫； 信號通路

胱天蛋白酶募集域蛋白9(caspase recruitment domain protein 9，CARD9)是包含CARD蛋白(CARD containing proteins)家族中的一員，通過蛋白-蛋白相互作用調(diào)節(jié)細胞內(nèi)信號傳導，是細胞內(nèi)信號傳導重要的銜接蛋白。CARD9位于染色體9q34.3，cDNA全長2108 bp，編碼536個氨基酸殘基，產(chǎn)生分子大小為62.3kD的蛋白質。CARD9在結構上包含著2個功能區(qū)，一個是位于氨基末端的胱天蛋白酶募集域(CARD)；另一個位于羧基末端的7肽重復特征的卷曲螺旋域，行使蛋白質寡聚化功能；與大鼠cDNA比對發(fā)現(xiàn)，大鼠CARD9的cDNA也編碼536個氨基酸，與人類相似度高達88%[1]。CARD9位于細胞內(nèi),存在于多種組織中，如脾、胸腺、肺、骨髓等，尤其是在骨髓源巨噬細胞和骨髓源樹突狀細胞中有大量表達，而T細胞、B細胞和NK細胞中表達并不多，這提示CARD9可能主要參與機體的固有免疫反應[2]。固有免疫系統(tǒng)中能夠識別病原體相關分子模式(pathogen associated molecularpatterns，PAMP)的受體稱為模式識別受體(PRR)[3]，巨噬細胞和樹突狀細胞都是先天免疫細胞，表達著多種模式識別受體，PRR在細胞內(nèi)、外和細胞膜上均有分布，包括Toll樣受體(TLRs)、核苷酸寡聚化區(qū)樣受體(NLRs)、RIG-I樣受體(RLRs)以及樹突狀細胞相關的C型凝集素受體(CLRs)等[4-6]。受體偶聯(lián)之后，PRRs就會啟動細胞內(nèi)信號的傳導，CARD9能夠高效整合多種固有免疫受體的識別信號，激活NF-KB、MAPK等通路，在機體的固有免疫中發(fā)揮重要作用?，F(xiàn)對CARD9在不同感染性疾病中的分子調(diào)控機制進行闡述。

1 細菌感染

免疫受體酪氨酸激活基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM)是受體相關分子胞內(nèi)段上的特定結構，在固有免疫和適應性免疫中都起到重要作用。Hara等[7]發(fā)現(xiàn)CARD9可能是ITAM下游分子，參與多種信號通路的激活，用ITAM關聯(lián)受體激動劑刺激CARD9基因敲除小鼠(CARD9-/-)和野生型小鼠的樹突狀細胞，發(fā)現(xiàn)CARD9-/-細胞NF-κB入核與DNA結合作用顯著低于野生型細胞，MAPK通路的激活不受影響；用Toll樣受體激動劑刺激，結果CARD9-/-細胞IκBa的降解和NF-κB與DNA結合情況并沒有受到損害，而MAPK通路中Jnk和P38的磷酸化卻受到抑制。這表明ITAM偶聯(lián)受體介導骨髓來源細胞NF-κB的激活必須有CARD9的參與，而Toll樣受體介導的MAPK通路激活也需要CARD9的存在。Hsu等[2]研究發(fā)現(xiàn)CARD9參與胞內(nèi)菌感染時機體固有免疫的調(diào)節(jié)，并且對Nod2介導的P38和Jnk這兩個MAPK通路的激活有至關重要的作用。他們用多種細菌胞壁成分刺激野生型小鼠和CARD9-/-小鼠巨噬細胞，發(fā)現(xiàn)用Poly(I:C)和MDP刺激的CARD9-/-小鼠巨噬細胞P38通路不能激活，IL-6和TNF產(chǎn)生缺失，而LPS刺激卻無異常，并且NF-κB通路的激活在兩種細胞中也無差異；構建CARD9和Nod2表達載體轉染293T細胞進一步研究得出CARD9為Nod2的下游信號組件，能激活MAPK通路，而對Nod2誘導的NF-κB通路沒有影響，可見CARD9在Nod2介導的通路中有選擇的激活P38通路而不是NF-κB通路。另外，TLR-5受體識別細菌鞭毛蛋白并引發(fā)細胞免疫的過程是在CARD9參與下完成的[8]。2010年Dorhoi等[9]發(fā)現(xiàn)CARD9在機體控制結核分枝桿菌感染中也必不可少。結核分枝桿菌感染的CARD9-/-小鼠比野生型小鼠更早出現(xiàn)感染癥狀，結核桿菌負荷也更高，化膿性肉芽腫出現(xiàn)更快，粒細胞聚集更迅速，血清和肺中的促炎性細胞因子和粒細胞集落刺激因子水平也更高；但是CARD9-/-小鼠的T細胞反應正常；CARD9-/-小鼠感染之后細菌增殖不受控制，出現(xiàn)了致死的系統(tǒng)性炎癥反應。除此之外,索狀因子(TDM)是吞噬細胞識別分枝桿菌的重要成分，Miyake等[10]發(fā)現(xiàn)不僅Mincle可以識別索狀因子，Dectin-3也在分枝桿菌的識別中發(fā)揮作用，Zhao等[11]又探索發(fā)現(xiàn)Mincle與Dectin-3之間密切相關：首先由Dectin-3識別TDM并通過Card9-Bcl10-Malt1復合物激活轉錄因子NF-κB，使得Mincle的表達量上調(diào)，Mincle又能識別更多的TDM再次激活NF-κB信號，激活機體免疫反應。CARD9不僅在識別分枝桿菌的多條通路中起調(diào)節(jié)作用，還可輔助視黃酸誘導蛋白-1(RIG-I)間接識別細菌入侵。RIG-I是RIG-I樣受體家族(RLRs)中的一員，是機體識別和抵抗RNA病毒感染的重要受體[12]，然而Abdullah等[13]發(fā)現(xiàn)RIG-1不僅可以識別RNA病毒,還可在CARD9的參與下識別入侵細胞的李斯特菌所分泌的核酸，產(chǎn)生IL-1β，介導免疫反應的發(fā)生。CARD9蛋白是胞內(nèi)重要的銜接蛋白，能傳遞由TLRs、NLRs和RLRs等介導的信號，激活NF-κB和MAPK通路，調(diào)節(jié)細菌侵時機體的免疫反應和炎癥反應。

2 真菌感染

Dectin-l和Dectin-2是兩種主要在巨噬細胞和樹突狀細胞表面表達的C型凝集素樣模式識別受體，它們分別通過p-葡聚糖和a-甘露聚糖對真菌進行識別，通過CBM復合體(Card9-Bcl10-Malt1)激活NF-KB信號通路，產(chǎn)生多種細胞因子，參與機體抗真菌的固有免疫[14]。Saijo等[15]發(fā)現(xiàn)IL-17A在宿主抗真菌的適應性免疫也發(fā)揮重要保護作用，而這兩條信號通路能誘導Th1和Th17細胞的分化，促進IL-17A的分泌[16]。Leibund等[17]發(fā)現(xiàn)，當CARD9缺失時，白念珠菌感染的小鼠Th17細胞及IL-17的產(chǎn)生缺失，無法啟動抗真菌的適應性免疫應答。與此同時，臨床上的幾例由于CARD9突變導致的患者對真菌易感的情況，為之前的研究提供了臨床依據(jù)。2009年Glocker[18]報道了一個易患慢性皮膚黏膜真菌感染的大家族，并對其中的36例進行了基因學分析，發(fā)現(xiàn)4例患者均攜帶CARD9基因上的一個純合突變Q295X，導致CARD9蛋白的編碼提前終止，野生型CARD9蛋白缺失，同時攜帶此突變的患者Th17細胞數(shù)量明顯較正常人低。2013年Drewniak[19]報道一位念珠菌性腦膜炎患者CARD9蛋白缺失，中性粒細胞失去對念珠菌殺傷作用，基因學研究發(fā)現(xiàn)該患者攜帶兩個雜合突變位點c.214G.A和c.1118G.C使得蛋白質發(fā)生G72S和R373P改變，導致蛋白缺失。同年Lanternier等[20]對17例深部真菌病患者基因進行測序，也發(fā)現(xiàn)了CARD9基因上的兩個罕見純合突變位點：Q289X和R101C，它們分別導致野生型CARD9蛋白的完全缺失和表達下降，IL-6和IL-17A水平也顯著降低，這提示CARD9常染色體隱性遺傳缺陷可能是深部真菌病的發(fā)病原因。近年來，隨著對CARD9在真菌易感性方面研究的深入，研究人員在遇到難治性復發(fā)性真菌病時，開始有意識地從遺傳學角度尋找病因。從2009年至今，共有11篇[18-28]關于CARD9基因缺陷導致真菌感染發(fā)生的病例報道(表1)，包括8種不同的致病真菌和14種不同的突變位點(圖1)，其中有5例是我國患者，致病真菌分別是疣狀瓶霉[21]和多主棒孢霉菌[27]。

不論是細菌還是真菌感染，一旦病原微生物進入吞噬細胞內(nèi)，就會有吞噬溶酶體形成，成熟的吞噬溶酶體會釋放大量活性氧(ROS)，抑制病原微生物的增殖、擴散[29]。Wu等[30]研究發(fā)現(xiàn)CARD9也參與調(diào)節(jié)巨噬細胞釋放ROS殺滅入侵病原微生物，它能抑制LyGDI(GDP解離抑制劑)對GTP酶Rac1的抑制作用，激活Rac1，產(chǎn)生ROS抑制和殺滅病原微生物。

表1 CARD9突變病例摘要

圖1 CARD9突變位點示意圖

3 病毒感染

Hsu等[2]2007年研究發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)微生物感染需要CARD9作為招募蛋白，這里的胞內(nèi)微生物不僅指胞內(nèi)菌，也包括病毒。他們用水皰性口炎病毒(VSV)感染野生型和CARD9-/-小鼠巨噬細胞，檢測MAPK和NF-κB的激活情況，結果NF-κB通路未受影響，而P38和Jnk的磷酸化受到抑制。提示在機體抵御病毒感染時P38和Jnk通路的激活及相關細胞因子的產(chǎn)生可能需要CARD9參與。維A酸誘導基因I樣受體家族(RLRs)，包括RIG-I(retinoic acid-inducible gene I)、黑素瘤分化相關基因5(melanoma differentiation-associated gene 5, MDA5)和遺傳學和生理學實驗室蛋白2(laboratory of genetics and physiology 2, LGP2)，是一類識別細胞內(nèi)RNA病毒的受體[12]。RLR識別RNA病毒后將信號傳遞給干擾素(IFN)調(diào)節(jié)因子和NF-κB信號通路，產(chǎn)生IFN、IL-6和IL-1β前體等調(diào)節(jié)免疫反應， Poeck等[31]用水皰性口炎病毒或腦心肌炎病毒刺激CARD9-/-小鼠樹突狀細胞，發(fā)現(xiàn)NF-κB亞單位p65入核水平和IL-6、IL-1β產(chǎn)生水平遠遠低于野生型細胞，但是干擾素的產(chǎn)生卻沒有受到影響，這提示RLR識別RNA病毒后NF-κB信號通路的激活是依賴CARD9的，而干擾素的合成與CARD9不相關，可見CARD9是有選擇性地調(diào)節(jié)RLR介導的炎癥反應。Gianni等[32]研究發(fā)現(xiàn)，CARD9也參與了機體對抗單純皰疹病毒的防御機制。RAD50是來自核內(nèi)的DNA傳感器蛋白，能識別受損的雙鏈DNA并啟動修復信號[33]，2014年Roth等[34]研究發(fā)現(xiàn)RAD50不僅能在細胞核內(nèi)識別和修復DNA損傷，還能在細胞質中與CARD9形成復合體識別病毒DNA，募集BCL10蛋白與CARD9一起激活NF-κB通路，產(chǎn)生IL-1β的前體，為后續(xù)IL-1β的產(chǎn)生及抗病毒的適應性免疫應答反應提供信號。流感病毒是一種常見的能引起病毒性肺炎并可以誘發(fā)急性呼吸窘迫綜合征的病原體，其肺部嚴重的病理改變可能是由于流感病毒刺激引起強烈的固有免疫反應所致。 Uematsu等[35]用流感病毒感染野生型和CARD9-/-小鼠，觀察他們的生存率和肺部的病理改變，結果CARD9-/-小鼠的生存率明顯高于野生型小鼠，缺陷小鼠肺部的炎癥性細胞因子和趨化因子也顯著低于野生型小鼠，但是病毒的清除，I型干擾素的產(chǎn)生，抗病毒的T細胞和B細胞免疫反應卻沒有受到影響。可見CARD9在病毒性肺炎的發(fā)生過程中主要介導炎癥反應和早期固有免疫的發(fā)生，對適應性免疫反應并沒有很大影響。這為治療嚴重的病毒性肺炎提供了新思路。

4 結語

CARD9是胞內(nèi)信號傳導的重要銜接蛋白，在多種系統(tǒng)疾病中廣泛表達，并能調(diào)控NF-κB、MAPK等信號通路，尤其在機體對病原微生物防御反應和固有免疫中起重要調(diào)節(jié)作用。CARD9缺失導致患者對真菌易感，已經(jīng)成為公認的常染色體隱性遺傳疾病，雖然現(xiàn)在臨床上因CARD9突變發(fā)生的只有真菌感染性疾病，但是經(jīng)過大量實驗室研究發(fā)現(xiàn)，CARD9突變對其他病原微生物的感染也有重要影響。CARD9已是感染性疾病發(fā)生發(fā)展機制中的重要一員，在此僅將近年來與CARD9相關的感染性疾病的研究進行歸納整理，隨著對其作用機制在感染性疾病中的深入研究，有可能為感染性疾病發(fā)生發(fā)展機制及臨床治療提供新思路。

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(收稿：2016-08-23 修回：2016-09-04)

Updateofcaspaserecruitmentdomaincontainingprotein9ininfectiousdiseases

CAOJing1,2,ZHANGFuren1,2.

1.ShandongProvincialHospitalforSkinDiseases,ShandongUniversity,Jinan250022,China; 2.ShandongProvincialInstituteofDermatologyandVenereology,ShandongAcademyofMedicalSciences,Jinan250022,China

ZHANGFuren,E-mail:zhangfuren@hotmail.com

Caspase recruitment domain-containing protein 9 (CARD9) is a member of the CARD protein family, which is a nonredundant adapter protein regulating intra-cellular signal transduction pathway through CARD-CARD interaction. CARD9 is a key signaling molecule for innate immune responses, which plays an important role in recognizing and resisting the fungi and bacteria infection. CARD9 deficiency has been reported to be associated with severe fungal diseases and chronic mucocutaneous candidiasis. The potential molecular mechanism of CARD9 in infectious diseases is reviewed in this article.

way caspase recruitment domain-containing protein; infectious diseases; innate immune; signal path

1山東大學附屬省皮膚病醫(yī)院，山東大學，濟南，250022 2山東省皮膚病性病防治研究所，山東省醫(yī)學科學院，濟南，250022

張福仁，E-mail: zhangfuren@hotmail.com