一株產(chǎn)電菌Klebsiella oxytoca d7的分離及產(chǎn)電機理

劉 玥,袁林江(西安建筑科技大學(xué),陜西省環(huán)境工程重點實驗室,教育部西北水資源和環(huán)境生態(tài)重點實驗室 陜西 西安 710055)

一株產(chǎn)電菌Klebsiella oxytoca d7的分離及產(chǎn)電機理

劉 玥,袁林江*(西安建筑科技大學(xué),陜西省環(huán)境工程重點實驗室,教育部西北水資源和環(huán)境生態(tài)重點實驗室 陜西 西安 710055)

采用厭氧雙層平板法從運行穩(wěn)定的雙室型微生物燃料電池(Microbial fuel cell,MFC)陽極生物膜上分離純化出一株優(yōu)勢產(chǎn)電純菌Klebsiella oxytoca,并對其產(chǎn)電機理進行了研究.通過對該純菌的循環(huán)伏安掃描分析,表明該菌具有較強的電化學(xué)活性,并且在胞外存在電子受體時就會進行胞外產(chǎn)電呼吸.對該菌培養(yǎng)物進行三維熒光掃描和比較,發(fā)現(xiàn)該菌主要是利用腐殖質(zhì)作為胞外電子傳遞的介體來完成產(chǎn)電呼吸.鐵還原性測試的結(jié)果表明過量的3價鐵沒有給菌株帶來額外的增長,該菌對3價鐵的還原量有限.研究認為,胞外呼吸不是Klebsiella oxytoca在無氧條件下的主要呼吸方式,而是當(dāng)有外在電子受體存在時細菌進行胞內(nèi)呼吸的一種輔助方式,即使環(huán)境中存在充分的胞外電子受體,也不會帶來Klebsiella oxytoca生長量的顯著增加,該菌無法從胞外還原中獲得足夠的生長需要的能量,仍然主要是通過胞內(nèi)呼吸獲得細胞生長所需的能量,有機物氧化所產(chǎn)生的電子只有少部分用于胞外電子受體的還原.

MFC；生物產(chǎn)電；克雷伯氏菌；循環(huán)伏安法；三維熒光分析

微生物燃料電池(MFC),是一種利用微生物作為“催化”者,能將有機物中的化學(xué)能轉(zhuǎn)化為電能、可利用生物質(zhì)來產(chǎn)生可替代能源的裝置[1]. Logan[2]認為MFC依賴“Electricigens”(產(chǎn)電微生物)產(chǎn)出電子.微生物是影響MFC性能最重要的因素,直接影響著MFC的內(nèi)阻、功率密度和庫倫效率等.因此,產(chǎn)電微生物直接關(guān)系到微生物燃料電池的電能產(chǎn)出[3].

胞外呼吸是近年來發(fā)現(xiàn)的新型微生物能量代謝方式[4,6],MFC產(chǎn)電被認為是胞外呼吸電子傳遞的結(jié)果.微生物分解基質(zhì)中產(chǎn)生的電子通過外電路傳遞至陰極用以還原電子受體,微生物獲得能量來供自身生長繁殖[5].

但目前對產(chǎn)電微生物的產(chǎn)電過程及相關(guān)產(chǎn)電機理尚不清楚,缺少指導(dǎo)調(diào)控 MFC產(chǎn)電的理論基礎(chǔ).產(chǎn)電微生物為何要進行胞外電子傳遞?胞外電子傳遞和胞內(nèi)電子的產(chǎn)生、傳遞有什么關(guān)聯(lián)?這些問題尚不完全清楚.

MFC的研究中,純菌體系更有利于產(chǎn)電機理的揭示,所以近年來優(yōu)勢產(chǎn)電菌的研究備受關(guān)注,所分離純化出來的產(chǎn)電菌的種類也逐漸增多,迄今為止,已報道的產(chǎn)電微生物已達到 30余種,研究較多的是Shewanella sp.[7-8]和Geobacter sp.[9]這兩類產(chǎn)電菌,MFC產(chǎn)電性能的優(yōu)化一直以來都是研究的熱點,但對產(chǎn)電微生物產(chǎn)電呼吸代謝的研究尚不充分,已有的研究多針對于所分離出純菌產(chǎn)電性能的測試[10-11]以及對其胞外電子傳遞機制的探討[12-13],而對于產(chǎn)電機理也不完全清楚.產(chǎn)電微生物在不同環(huán)境下,電子傳遞途徑有什么變化,微生物為什么會選擇胞外產(chǎn)電呼吸等,有待探明.

本研究采用厭氧雙層平板法從運行穩(wěn)定的雙室型MFC陽極上的生物膜里分離純化出了優(yōu)勢產(chǎn)電純菌,通過三維熒光分析、循環(huán)伏安掃描、鐵還原性測試等探究了該純產(chǎn)電菌的產(chǎn)電與呼吸作用途徑.

1 材料與方法

1.1 產(chǎn)電微生物的富集與分離

在多年運行穩(wěn)定的、以1g/L的葡萄糖為電子供體的雙室型 MFC裝置中,刮取少許陽極生物膜,采用厭氧雙層平板法分離反應(yīng)器中產(chǎn)電菌.在無菌操作臺上采用無菌的接種環(huán)刮取一定的陽極生物膜接入滅過菌的厭氧 LB培養(yǎng)基中(厭氧培養(yǎng)基在滅菌前曝氮氣15min),水浴鍋中35℃恒溫靜置培養(yǎng)24h后,采用雙層平板法稀釋涂布于厭氧檸檬酸鐵培養(yǎng)基中,培養(yǎng)2天后,根據(jù)菌落的形態(tài)、顏色等差異選取不同的單菌落接種至厭氧檸檬酸鐵液體培養(yǎng)基中,如此反復(fù)純化5～7代,得到一個純培養(yǎng)菌株,命名為d7.

所用的檸檬酸鐵培養(yǎng)基配方為:胰蛋白胨(Tryptone)10g/L,酵母提取物(Yeast extract)5g/L,氯化鈉(NaCl)10g/L,添加 20mmol/L的檸檬酸鐵為電子受體,并用 NaOH調(diào)節(jié)該培養(yǎng)基的pH=7±0.3,固體培養(yǎng)基則加入 18g/L瓊脂粉后制成.

1.2 菌種鑒定

1.2.1 形態(tài)觀察 將菌株稀釋涂布于檸檬酸鐵固體培養(yǎng)基(厭氧)中和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(好氧)中35℃恒溫培養(yǎng) 2d,觀察菌落形態(tài),采用草酸銨結(jié)晶紫進行簡單染色,染色后采用Nikon 90i光學(xué)顯微鏡觀察菌體特征.

1.2.2 菌株d7的biolog鑒定 由于菌株d7可在好氧條件下生長,所以采用 biolog GENⅢ(用于好氧菌的鑒定)微平板進行鑒定[14].

1.3 循環(huán)伏安分析

1.3.1 菌株d7批式培養(yǎng)循環(huán)伏安分析 循環(huán)伏安分析中,主要通過觀察循環(huán)伏安曲線中的氧化-還原峰來判斷其電化學(xué)活性,氧化-還原峰的峰電流越大,說明其氧化還原能力越強,電化學(xué)活性越高[15].

將菌株d7接種至含有滅過菌的厭氧檸檬酸鐵液體培養(yǎng)基的三電極體系中進行批式培養(yǎng),每隔 24h進行一次循環(huán)伏安掃描,培養(yǎng) 72h后, 9000r/min離心10min,取上清液再次進行循環(huán)伏安掃描.其中以鈦絲穿過碳氈(一起培養(yǎng))為工作電極,鉑絲電極為對電極,Ag/AgCl電極為參比電極,在電化學(xué)工作站中的掃速為100mV/s,掃描電壓范圍為-1～1V.

1.3.2 不同條件下菌株d7的循環(huán)伏安分析 將菌株d7分別以相同的接種量接種至好氧LB培養(yǎng)基、厭氧LB培養(yǎng)基、好氧檸檬酸鐵培養(yǎng)基、厭氧檸檬酸鐵培養(yǎng)基中(好氧培養(yǎng)基在滅菌前曝空氣15min,厭氧培養(yǎng)基在滅菌前曝氮氣15min).控制溫度相同,好氧進行35℃恒溫搖床150r/min培養(yǎng),厭氧進行35℃恒溫水浴鍋培養(yǎng),均培養(yǎng)36h后(經(jīng)過 36h,兩種條件下的細菌生長都能進入穩(wěn)定期),分別進行循環(huán)伏安掃描,以未接種菌株的培養(yǎng)基為空白對照.

1.4 三維熒光分析

將菌株d7分別在好氧LB培養(yǎng)基、厭氧LB培養(yǎng)基、好氧檸檬酸鐵培養(yǎng)基和厭氧檸檬酸鐵培養(yǎng)基中培養(yǎng)進入穩(wěn)定期后,離心取上清液經(jīng)過0.45μm濾膜過濾后采用F-7000型熒光分光光度計來進行代謝產(chǎn)物的測定,激發(fā)波長和發(fā)射波長范圍分別為 200～450nm、220～500nm,均以 5nm步長遞增,激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5nm,掃描速度為 12000nm/min.用超純水做空白,先減去空白樣并采用 Delaunnay三角插值法去除瑞麗散射,繪制處理后的3DEEM等高線圖.

1.5 鐵還原實驗

1.5.1 三價鐵的存在對菌株d7生長的影響 將菌株d7以相同的接種量接種至含有不同濃度梯度3價鐵離子(采用檸檬酸鐵作為外電子受體)的液體培養(yǎng)基中,分別在好氧條件和厭氧條件下進行批式培養(yǎng),以未接種菌株的不同濃度檸檬酸鐵培養(yǎng)基為空白對照,采用UV紫外/可見分光度計測量OD600,繪制其在不同濃度鐵離子存在條件下的生長曲線.

1.5.2 菌株d7的鐵還原性試驗 將菌株d7以相同的接種量接種至含有不同濃度梯度 3價鐵離子(采用檸檬酸鐵作為外電子受體)的液體培養(yǎng)基中,分別在好氧條件和厭氧條件下培養(yǎng),培養(yǎng)36h后,9000r/min離心10min,取上清液對其進行鐵還原性測試,以未接種菌株的不同濃度檸檬酸鐵培養(yǎng)基為空白對照,鐵離子的測定采用鄰菲羅啉分光光度法[16].所測得的 Fe(Ⅱ)的濃度與培養(yǎng)基中原 Fe(Ⅱ)的濃度之差,除以培養(yǎng)基中總鐵濃度的百分比,即得Fe(Ⅲ)還原率.

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株d7的分離和鑒定

2.1.1 形態(tài)學(xué)觀察 從長期運行穩(wěn)定的雙室型MFC陽極生物膜上分離得到一株純培養(yǎng)菌株,命名為d7,如圖1.

菌株d7在厭氧檸檬酸鐵固體培養(yǎng)基中35℃恒溫培養(yǎng) 2d后,菌落形態(tài)呈圓形,邊緣整齊有光澤,黑褐色,直徑 1.5mm左右.在營養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基中培養(yǎng) 2d后,菌落形態(tài)呈圓形,邊緣整齊有光澤,乳白色,低凸起狀,有粘性,易挑,直徑 2.5mm左右.染色后在 1000X顯微鏡下觀察,短桿菌,菌體寬度為0.3～0.5μm左右,菌體長度為0.8～1.0μm左右.

圖1 菌株d7在厭氧檸檬酸鐵培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)(A)、菌株d7在好氧營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)(B)菌株d7在1000X顯微鏡下圖像(C)Fig.1 Colony morphology in the anaerobic ferric citrate medium (A), in the nutrient agar medium (B) and the electron-microscope photo (1000X) (C) of the strain d7

2.1.2 biolog鑒定 采用 biolog專用接種液將菌株d7接種至biolog GENⅢ微平板中,35℃恒溫培養(yǎng)24h后,采用biolog自動微生物鑒定系統(tǒng)進行鑒定,結(jié)果顯示為Klebsiella oxytoca(以下簡稱d7).

克雷伯氏菌屬是多次被報道過的高效產(chǎn)電菌[17-18].Klebsiella oxytoca GEB-1是Kim[19]首次于2006年從活性污泥中分離得到的,屬于γ-變形菌綱,不運動,有莢膜,是一種革蘭氏陰性、異養(yǎng)兼性厭氧菌,試驗中發(fā)現(xiàn)這種細菌具有較強的電化學(xué)活性.隨后,也有研究者分離出克雷伯氏菌屬.2008年,Zhang等[20]從土壤沉積物中分離出一株Klebsiella pneumoniae L17,將其接種至MFC中,以 2g/L葡萄糖為電子供體時,最大可產(chǎn)生0.3326V的電壓.2013年,Yue等[21]從以污水處理廠的活性污泥接種的MFC中分離出了一株產(chǎn)電微生物Klebsiella oxytoca Z6,并對其產(chǎn)電性能進行測定發(fā)現(xiàn),以檸檬酸鈉為底物時,將該菌株接種到單室空氣陰極MFC中可產(chǎn)生0.31V的最大輸出電壓,同時以檸檬酸鈉、乳酸鈉、葡萄糖、丙三醇、谷氨酸為電子供體測試了其產(chǎn)電性能,產(chǎn)生的最大輸出電壓分別為0.31V、0.26V、0.213V、0.207V、0.107V.

2.2 菌株d7的循環(huán)伏安分析

2.2.1 菌株d7的批式培養(yǎng)循環(huán)伏安分析 為了進一步驗證其產(chǎn)電效果,將菌株d7接種至滅過菌的含有檸檬酸鐵厭氧液體培養(yǎng)集的三電極體系中,每隔24h進行一次循環(huán)伏安掃描,培養(yǎng)72h后,再離心取上清液進行循環(huán)伏安掃描,結(jié)果如圖2.

圖2 菌株d7的批式培養(yǎng)循環(huán)伏安分析Fig.2 Cyclic voltammetry analysis of the strain d7 in the batch culture

由圖2可知,隨著培養(yǎng)時間的延長,循環(huán)伏安曲線的氧化還原峰逐漸升高,電化學(xué)活性變得越來越好,離心取上清液后,上清液也出現(xiàn)了較好的氧化還原峰,說明菌株d7可能是利用胞外電子介體來傳遞電子、完成產(chǎn)電呼吸的.隨著培養(yǎng)時間的延長,生物量的增長使胞外電子介體的量逐漸增多,有了一定的積累,所以逐漸表現(xiàn)出越來越好的電化學(xué)活性.但是上清液的氧化還原峰的峰電流沒有培養(yǎng) 72h時的峰電流高,所以可以認為胞外電子介體傳遞電子不是d7唯一的胞外電子傳遞方式[22],有研究者對克雷伯氏菌進行過陽極包裹式MFC(即碳氈陽極經(jīng)0.22μm微孔濾膜包裹)產(chǎn)電測試[23],結(jié)果發(fā)現(xiàn)包裹型 MFC雖仍能成功啟動,但其啟動時間相對延長、輸出電壓降低,所以克雷伯氏菌也可利用生物膜機制進行胞外電子傳遞.

2.2.2 菌株 d7在不同環(huán)境下培養(yǎng)的循環(huán)伏安分析 有研究者[24]認為產(chǎn)電呼吸是產(chǎn)電微生物在厭氧條件下的一種被迫行為,也有研究者使用曝氣+停曝這種間歇的方式來優(yōu)化MFC的產(chǎn)電性能[25],因此,為探究菌株d7的產(chǎn)電呼吸機理,將菌株分別在好氧LB培養(yǎng)基、厭氧LB培養(yǎng)基、好氧檸檬酸鐵培養(yǎng)基、厭氧檸檬酸鐵培養(yǎng)基中培養(yǎng) 36h后,分別進行循環(huán)伏安掃描,結(jié)果如圖3.

圖3 菌株d7在不同條件下的循環(huán)伏安分析Fig.3 Cyclic voltammetry analysis of the strain d7 in the different condition

由圖3可知,菌株d7在沒有3價鐵存在時,無論在好氧還是厭氧條件下,都無法進行胞外呼吸,沒有胞外電子傳遞現(xiàn)象.而當(dāng)有3價鐵存在時,無論是好氧還是厭氧,循環(huán)伏安分析都表現(xiàn)出明顯的氧化還原峰,說明菌株d7會進行一部分的胞外呼吸,產(chǎn)生胞外電子傳遞.這說明對于 d7而言,胞外呼吸并不是其在沒有溶解氧作為內(nèi)電子受體時的一種被迫行為,而是在進行正常胞內(nèi)呼吸時所附加的一種呼吸方式.

2.3 菌株d7代謝產(chǎn)物的三維熒光分析

通過比較分析菌株d7在有胞外電子受體和沒有胞外電子受體存在時的代謝產(chǎn)物的不同,可以得出菌株d7進行胞外電子傳遞的電子介體以及其電子傳遞機制.三維熒光分析的掃描結(jié)果如圖4.根據(jù)掃描結(jié)果確定峰值所對應(yīng)物質(zhì),好氧LB培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株d7的代謝產(chǎn)物中出現(xiàn)一個熒光峰(Em/Ex=385/340,熒光強度 765.9),厭氧 LB培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株d7的代謝產(chǎn)物中出現(xiàn)一個熒光峰(Em/Ex=372/335,熒光強度 858.9),這兩種熒光峰主要為微生物代謝物,即溶解性微生物代謝產(chǎn)物對應(yīng)的熒光峰.好氧檸檬酸鐵培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株d7的代謝產(chǎn)物中出現(xiàn)兩個熒光峰(1、Em/Ex=387/ 342,熒光強度754.3;2、Em/Ex=421/385,熒光強度553.9),厭氧檸檬酸鐵培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株d7的代謝產(chǎn)物出現(xiàn)兩個熒光峰(1、Em/Ex=381/338,熒光強度 864.3;2、Em/Ex=430/383,熒光強度 713.9),其中第一個熒光峰主要為微生物代謝產(chǎn)物,第二個熒光峰是腐殖酸類熒光物質(zhì).

圖4 菌株d7代謝產(chǎn)物的三維熒光分析Fig.4 Three dimensional fluorescence analysis of the strain d7’s metabolite

由此實驗結(jié)果可知,當(dāng)有胞外電子受體存在時,無論在好氧條件下還是厭氧條件下,菌株 d7除了產(chǎn)生正常的微生物代謝產(chǎn)物外,還會有腐殖酸類物質(zhì),而這類物質(zhì)在沒有胞外電子受體存在時并沒有出現(xiàn),所以可以得知這類腐殖質(zhì)就是菌株d7進行胞外呼吸時的胞外電子傳遞介體.腐殖質(zhì)是由動植物及微生物殘體演化而成的高分子醌類聚合物,廣泛存在于土壤、沉積物和水生環(huán)境中[26].它既可以作為微生物胞外呼吸的電子受體,也可以充當(dāng)電子穿梭體促進其他形式的胞外呼吸.

微生物氧化有機物,將產(chǎn)生的電子傳遞給胞外氧化態(tài)的腐殖質(zhì),由腐殖質(zhì)傳遞電子至鐵氧化物,并產(chǎn)生能量供自身生長.腐殖質(zhì)及其類似物的氧化還原電位在-180mV到+300mV之間,相對于鐵氧化物來說,電位差異較大,因而腐殖質(zhì)可能充當(dāng)鐵氧化物和微生物之間的電子穿梭體.而且,大量的研究已經(jīng)證實,腐殖質(zhì)及其類似物確實可以作為電子穿梭體,促進鐵氧化物的還原[27].如: Xia等[22]利用三維熒光和紫外-可見波長掃描手段推斷klebsiella sp. ME17可能通過醌類物質(zhì)作為電子傳遞中間體來傳遞電子;Yue等[21]的研究中將所分離的克雷伯氏菌接種至 MFC中后,通過添加外源性 AQDS使接種了克雷伯氏菌的MFC產(chǎn)電性能有明顯提高.

2.4 菌株d7的鐵還原性測試

2.4.1 三價鐵的存在對菌株d7生長的影響 為進一步探究3價鐵存在時胞外呼吸對菌株d7生長量的影響,將菌株以相同的接種量接種至含有不同濃度梯度3價鐵離子的液體培養(yǎng)基中,分別在好氧條件和厭氧條件下進行批式培養(yǎng),測量OD600繪制其在不同濃度鐵離子存在條件下的生長曲線,結(jié)果如圖5.

由圖5可知,在好氧條件下,3價鐵對菌株d7生長的影響很小,只在鐵離子濃度較低時能使菌株快速進入穩(wěn)定期,但促進作用也很微弱,當(dāng)Fe(Ⅲ)的濃度在2mmol/L、5mmol/L、10mmol/L、20mmol/L時,菌株d7的生長曲線基本重合,可見在好氧條件下,菌株雖然可以還原3價鐵,但3價鐵的存在對于菌株的生長基本沒有好處,沒有因為過量鐵離子的存在使菌株d7通過胞外呼吸而獲得更多的生長.

厭氧條件下,隨著鐵離子的濃度從 0mmol/L升高到20mmol/L,菌株d7進入穩(wěn)定期的時間越來越短,說明在厭氧條件下,鐵離子的存在可以使菌株在厭氧呼吸的同時進行胞外產(chǎn)電呼吸,通過兩種呼吸方式共同獲得細胞生長所需能量,完成細胞代謝,在這一時期,3價鐵作為外電子受體對細胞生長起到促進的作用,但進入穩(wěn)定期后,菌株的生物量就基本一致,此時的生物量約為好氧條件下的一半,厭氧條件下也沒有因為過量鐵的存在而給菌株d7帶來過量的增長,說明鐵呼吸在厭氧條件下也不能作為菌株d7的主要呼吸方式來完成細菌的正常生長代謝.細菌還是主要通過發(fā)酵產(chǎn)能.

圖5 菌株d7在不同鐵濃度下培養(yǎng)的生長曲線Fig.5 The growth curve of the strain d7in the different Fe(Ⅲ) concentration

2.4.2 菌株d7的鐵還原性試驗 為更深入的研究菌株d7對3價鐵離子的利用率,對菌株d7進行鐵還原性測試.將菌株以相同的接種量接種至含有不同濃度梯度 3價鐵離子的液體培養(yǎng)基中,分別在厭氧條件和好氧條件下培養(yǎng),進入穩(wěn)定期后測定其 Fe(Ⅱ)的產(chǎn)出量和 Fe(Ⅲ)的還原率,結(jié)果如圖6.

由圖6可知,在好氧條件下,菌株d7產(chǎn)出的Fe(Ⅱ)量很少,而且當(dāng)培養(yǎng)基中 Fe(Ⅲ)的濃度從0.5mmol/L增加到20mmol/L時,菌株d7所能還原的3價鐵都是很少的,還原產(chǎn)生的Fe(Ⅱ)最高只有 0.24mmol/L,產(chǎn)出的 Fe(Ⅱ)的量基本相當(dāng),總體而言鐵還原率逐漸下降.雖然好氧條件下鐵還原率小,但是仍有 Fe(Ⅱ)的產(chǎn)出,說明好氧條件下菌株 d7仍能進行一部分的胞外呼吸,這也解釋了菌株 d7在好氧檸檬酸鐵培養(yǎng)基中培養(yǎng)36h后進行循環(huán)伏安分析時表現(xiàn)出明顯氧化還原峰的原因.

圖6 菌株d7的鐵還原性測試Fig.6 The ferric reducing ability of the strain d7

厭氧條件下,菌株d7還原的3價鐵較好氧條件下多,當(dāng)培養(yǎng)基中 Fe(Ⅲ)的濃度從 0.5mmol/L增加到10mmol/L時,菌株d7產(chǎn)出的Fe(Ⅱ)逐漸增多,當(dāng)Fe(Ⅲ)高于10mmol/L時,菌株d7產(chǎn)出的Fe(Ⅱ)也不再增加,保持持平,最多產(chǎn)出0.79mmol/L的Fe(Ⅱ),鐵還原率逐漸下降.

根據(jù)鐵還原性測試的結(jié)果結(jié)合菌株d7在不同濃度鐵離子存在時的生物量的變化可以看出,對于菌株d7而言,胞外產(chǎn)電呼吸并不能作為其主要的呼吸產(chǎn)能方式完成細胞的生長代謝,在厭氧條件下,低濃度的鐵離子能促進細胞的生長,但細菌所能還原的鐵離子也是很有限的,高濃度的鐵沒有給菌株 d7帶來過量的增長,所以,細菌還是主要通過發(fā)酵獲得細胞生長所需的能量,其呼吸作用所產(chǎn)生的電子只有少部分用于胞外電子受體的還原.

雖然產(chǎn)電呼吸不是克雷伯氏菌的主要呼吸代謝方式,但克雷伯氏菌可利用的碳源種類豐富,且類似于克雷伯氏菌這種發(fā)酵型產(chǎn)電微生物的種類繁多,這類細菌在自然界中分布廣泛、數(shù)量大,所以其對于產(chǎn)電呼吸機理的研究和 MFC性能的提升都具有重要意義[28].

2.5 對菌株 d7的電子傳遞和呼吸作用方式的分析

從本研究所得出的數(shù)據(jù)出發(fā),菌株d7可在不同環(huán)境條件下進行不同的電子傳遞和呼吸作用方式.

像諸多兼性厭氧的klebsiella菌屬的細菌一樣,d7在有氧培養(yǎng)狀態(tài)下,如果沒有胞外電子受體存在,菌株 d7就主要進行胞內(nèi)呼吸,是以氧作為最終電子受體的好氧呼吸,產(chǎn)生CO2和H2O.在無氧環(huán)境下,進行厭氧發(fā)酵,以中間代謝產(chǎn)物的小分子有機物為最終電子受體.

圖7 菌株d7的電子傳遞示意Fig.7 The electron transfer map of the strain d7

當(dāng)加入Fe(Ⅲ)時,有了胞外電子受體,由代謝產(chǎn)物的三維熒光分析結(jié)果顯示,此時的代謝產(chǎn)物中多出了腐殖酸類物質(zhì),而其它主要的微生物代謝產(chǎn)物與沒有加入胞外電子受體時相同;另外加入了過量的 Fe(Ⅲ)并沒有給菌株帶來過量的增長,菌株d7仍主要以胞內(nèi)呼吸作為主要的呼吸代謝方式,而此時胞外電子受體的存在會激發(fā)菌株產(chǎn)生腐殖質(zhì),從而誘導(dǎo)一部分電子通過腐殖質(zhì)傳遞至胞外再傳遞給 Fe3+,使 Fe3+得到電子被還原為Fe2+,完成了胞外產(chǎn)電呼吸.不同條件下的循環(huán)伏安分析結(jié)果說明,菌株d7的這種胞外呼吸的現(xiàn)象在好氧時和厭氧時均可發(fā)生,但是,由菌株的鐵還原性測試的結(jié)果可知:加入同樣的Fe(Ⅲ)后,厭氧時產(chǎn)生的Fe(Ⅱ)均較好氧時多,所以,厭氧條件下菌株進行胞外呼吸的能力較好氧時強.其四種不同條件下的呼吸電子傳遞示意圖如圖 7所示.在厭氧且存在 3價鐵離子的環(huán)境下,如實驗中MFC內(nèi),菌株d7發(fā)酵有機基質(zhì)時,脫下的少量電子就可能是通過腐殖質(zhì)傳遞到電極再到 3價鐵,實現(xiàn)了胞外呼吸.在胞內(nèi)產(chǎn)生了可供細胞生長的能量AT,在MFC中形成了電流.

3 結(jié)論

3.1 高效產(chǎn)電菌Klebsiella oxytoca d7主要是通過利用胞外電子介體腐殖質(zhì)傳遞電子來完成胞外電子傳遞的.

3.2 胞外呼吸只能給Klebsiella oxytoca d7產(chǎn)生很少量的能量,再多的胞外電子受體也不能給菌株帶來更多的生長量;該產(chǎn)電菌不能從胞外電子受體還原中獲得足夠的用于生長的能量,氧化分解有機物產(chǎn)生的電子只有少部分被用于胞外電子受體的還原.

3.3 產(chǎn)電菌Klebsiella oxytoca d7進行胞外呼吸產(chǎn)生胞外電子傳遞是細菌在受到胞外電子受體的誘發(fā)而產(chǎn)生的現(xiàn)象,其通過利用胞外電子介體,將分解有機物產(chǎn)生的一小部分電子通過胞外電子介體傳遞至胞外電子受體,在胞內(nèi)呼吸的基礎(chǔ)上完成產(chǎn)電呼吸.

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Isolation of an electrogen Klebsiella oxytoca d7 and its electricity-generating mechanism.

LIU Yue, YUAN Lin-jiang*, (Key Laboratory of Environmental Engineering, Shaanxi Province, Key Laboratory of Northwest Water Resources, Environment and Ecology, Ministry of Education, Xi’an University of Architecture and Technology, Xi’an, 710055, China), China Environmental Science, 2017,37(9)：3540～3548

An electrogen strain Klebsiella oxytoca-d7 was isolated from biofilm on the anode of a stable operating double chamber microbial fuel cell (MFC) using anaerobic double-plate method and its electricity-generating mechanism was investigated in this study. The results show that the bacteria Klebsiella oxytoca d7 performed high electrochemical activity according to the cyclic voltammetry analysis. It carried out extracellular electricigenic respiration in the environment with extracellular electron acceptor. The strain accomplished electricity generating respiration mainly through humus secreted as extracellular electron media detected by the three simensional fluorescence analysis of the strain’s metabolite. Ferric reducing experiments implied that excessive ferric ion did not result in extra growth of the strain, and the ferric ion reduction rate of the strain was limited. This research suggests that extracellular respiration is not the mainly respiration path way of the klebsiella oxytoca d7under anaerobic condition, but a subsidiary one as of the intracellular respiration in the presence of extracellular electron acceptor in the environment. Even there are enough extracellular electron acceptor in the environment, the strain’s growth won’t increase significantly. It is considered the strain does not obtain main growth energy from extracellular reduction, but from intracellular respiration. Only a small part of the electrons produced by oxidation of organic is used to reduce the extracellular electron acceptor.

microbial fuel cell；electricity generation；Klebsiella sp.；cyclic voltammetry；three dimensional fluorescence analysis

X172

A

1000-6923(2017)09-3540-09

2017-01-20

重大水專項(2009ZX07212-002)

* 責(zé)任作者, 教授, yuanlinjiang@xauat.edu.cn

劉 玥(1991-),女,陜西銅川人,西安建筑科技大學(xué)碩士研究生,主要研究方向為城市污水生物處理理論與技術(shù).