除草劑生物測定方法及操作方法

摘要：本文簡要介紹了除草劑生物測定方法，著重介紹組織或器官水平測定、整株水平測定、酶水平測定、細胞或細胞器水平測定4種方法，并就生物測定供試生物選擇、除草劑濃度設(shè)置和施藥方法進行概述。

關(guān)鍵詞：除草劑；生物測定方法；操作方法

中圖分類號： S482.4 文獻標識碼： A DOI編號： 10.14025/j.cnki.jlny.2017.18.023

生物測定技術(shù)是除草劑研究的一項基本工作，是除草劑活性測定、安全性檢測以及殘留診斷的常用方法，特別是在除草劑新品的研制開發(fā)中發(fā)揮著不可替代的作用，也是高通量篩選中必不可少的手段之一[1]。

1 除草劑生物測定方法

除草劑生物測定的主要方法有：點滴法、小杯法或培養(yǎng)皿法、浮萍法、玉米幼苗法、黃瓜幼苗法、燕麥幼苗法、蘿卜子葉法、番茄水培法、稗草胚軸法等[2]。除草劑具有控制生長激素的分泌，干擾蛋白質(zhì)、葉綠素、脂類等的生物合成，抑制光合作用、細胞分裂、呼吸作用等多種作用方式，利用生物活體作為靶標是生物測定中的一種常規(guī)選擇，生物測定中靶標生物的生長發(fā)育情況、生理生化指標以及形態(tài)特征的變化可作為除草劑生物活性的判定依據(jù)。另外，在進行除草劑生物測定時，除草劑的不同作用方式?jīng)Q定了靶標生物和測定方法的選擇。

1.1組織或器官水平測定

組織或器官水平測定常用的有葉片、種子、根尖等，一般在實驗室進行。選用種子作為生物測定的供試材料時，通常采用小杯法或培養(yǎng)皿法。培養(yǎng)皿法的培養(yǎng)介質(zhì)一般是常規(guī)自來水，在培養(yǎng)皿內(nèi)墊上兩層濾紙，把一定數(shù)量的種子均勻地鋪在濾紙上，提前把需要測定的除草劑按事先設(shè)定好的濃度梯度進行稀釋，再用移液槍將不同濃度梯度的除草劑加入培養(yǎng)皿，放入培養(yǎng)箱，設(shè)定好適宜的溫度和濕度，進行培養(yǎng)。小杯法可以采用滅菌、過篩的沙子，均勻地將細沙填充到小杯的固定位置，把一定數(shù)量的種子均勻鋪設(shè)到沙子上，再覆蓋上厚度基本一致的細沙。可以用地上植株鮮重、株高或主根長作為測量指標，具體采用哪項指標應依據(jù)預備實驗結(jié)果來確定，但是選定的指標應具備穩(wěn)定性好、相關(guān)性好以及容易測量的特點。以主根長生測法應用最為廣泛。例如采用油菜或玉米主根長生測法測定磺酰脲類除草劑殘留活性[3，4]。在選用種子作為生測材料時， 供試的種子一定是近一年或兩年的，必須進行預實驗，確保種子發(fā)芽率高、發(fā)芽勢穩(wěn)定，否則會影響試驗結(jié)果。

1.2整株水平測定

采用整株植物測定除草劑的活性，通常是在溫室進行。用不同規(guī)格的花盆或培養(yǎng)皿等培養(yǎng)供試植物， 然后根據(jù)試驗預設(shè)，把供試除草劑按一定濃度梯度進行稀釋，用噴霧法對供試植物進行處理，根據(jù)除草劑特性，待除草劑作用癥狀明顯后分兩次進行觀察、測量、記錄、評價。評價的指標為株高、鮮重、死亡率等，還可對植物受害癥狀進行分級，再計算綜合藥害指數(shù)[5]。根據(jù)供試植物出現(xiàn)的除草劑作用的顯著癥狀進行等級劃分，從無明顯癥狀到癥狀最明顯可分為5～7級，然后對每一個培養(yǎng)皿或花盆中供試植物的除草劑作用癥狀進行統(tǒng)計記錄，計算藥害綜合指數(shù)，最后依據(jù)藥害綜合指數(shù)判定除草劑活性。

藥害綜合指數(shù)（%）= [（每皿或每盆各受害級別株數(shù)×級別）/（每皿或每盆株數(shù)×最高級別）]×100。

也可以用鮮/干重抑制率來進行等級劃分，唐慶紅等人研究油菜田新型除草劑丙酯草醚的殺草譜，對20種供試雜草根據(jù)其對丙酯草醚反應程度進行劃分，分成了五類，分別為很敏感（防效大于90%）、敏感（防效位于80%～90%）、中度敏感（防效位于60%～80%）、一般耐藥（防效位于30%～60%）以及耐藥雜草（防效低于30%）。研究結(jié)果表明，在600g a.i/hm2的推薦劑量下，以鮮重防效為評價指標，看麥娘、日本看麥娘、早熟禾、薺菜、■草、牛繁縷、棒頭草、刺果毛茛、硬草和小藜等10種雜草對丙酯草醚較敏感和敏感。

1.3 酶水平測定

在酶水平上進行的生物測定，前提是已知該除草劑的作用靶標。例如，草甘膦的作用靶標為EPSP合成酶，是芳香族氨基酸合成過程中的重要酶，通過抑制EPSP合成酶活性可以導致莽草酸累積，所以通過測定植物體內(nèi)莽草酸累積量可以確定草甘膦活性大小[6]（Pline W. A. et al.，1999；Fuchs M. A. et al，2002）。另外，磺酰脲類除草劑的作用靶標為乙酰乳酸合成酶，那么植物對磺酰脲類除草劑的敏感性可以通過乙酰乳酸合成酶的活性變化來判定[7]。

1.4細胞或細胞器水平測定

特定作用機制的除草劑可采用細胞或細胞器水平測定，其中又以線粒體和葉綠體中的特定生理生化反應的測定居多。在離體線粒體中，可以采用瓦氏呼吸裝置測定氧的吸收和磷氧比，進而確定呼吸作用抑制劑類除草劑的活性[8]。三氮苯類等光合作用抑制劑類除草劑作用于光系統(tǒng)Ⅱ中質(zhì)體醌QB結(jié)合部位，替換與D1蛋白結(jié)合的質(zhì)體醌QB，致使電子傳遞受阻，這類除草劑可以測定希爾反應活性，通過測定鐵氰化鉀光還原，折算成放氧活力，能很好地反映除草劑的除草活性[9]。另外，細胞器中特定物質(zhì)含量的測定也可以作為測定指標用于除草劑活性評價，如葉綠素含量測定，在用于新型磺酰脲類除草劑HNPC-C9908活性測定時，藻細胞中葉綠素含量隨供試藥劑濃度的增加而逐漸降低，表現(xiàn)出良好的劑量——效應關(guān)系[10]。

2除草劑生物測定操作方法

2.1生物測定中供試生物體的選擇

在除草劑的生物測定中，常常以植物為主，但特殊情況情況下也可選用其他生物。在實際操作中，根據(jù)實驗目的不同選擇不同的作物或者雜草。比如需要測定除草劑對特定作物或雜草的生物活性，以特定的作物或雜草為實驗材料；需要測量除草劑在土壤或水體中的殘留量，就要先通過預實驗或者實際經(jīng)驗篩選敏感植物，之后通過一系列的實驗設(shè)計用敏感植物在土壤或水中的生存情況來確定殘留情況。一般來講，生物測定中選擇供試植物應遵循以下幾個原則：一是供試植物來源要充分、個體應基本一致；二是供試植物對除草劑反應是有規(guī)律性的，比如一定范圍內(nèi)劑量和死亡率（或生理生化指標）成一定的相關(guān)性（正相關(guān)或負相關(guān)）等；三是現(xiàn)象具有可重復性，即相同或相似實驗條件下，正相關(guān)的關(guān)系效應可以重復顯現(xiàn)。在材料選擇上，主要以高等被子植物作為生測材料，有時也可選用低等生物如藻類作為生測材料，主要是藻類作為低等生物，材料生長均勻一致性高、生長周期短、生理生物指標顯現(xiàn)明顯，準確性較高。實際操作中，對于實驗條件較為完善、實驗設(shè)備較為齊全的研究室，可以考慮開展藻類生物測定。對于基層實驗單位，比如農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣系統(tǒng)、基層農(nóng)業(yè)廣播學校等技術(shù)員培訓機構(gòu)，則建議采取作物或雜草作為指示植物，更利于操作和觀察。endprint

2.2生物測定中除草劑濃度的設(shè)置

除草劑的生物測定中，需要做系列濃度（或劑量）設(shè)置，可以采用等差或等比數(shù)列的方式，原則上濃度（或劑量）設(shè)置應在5個以上，并且設(shè)置空白對照或清水對照，必要時還要設(shè)置標準樣品對照或當?shù)爻Ｓ贸輨φ铡９┰嚦輨┑臐舛仍O(shè)置應在靶標植物的正常響應范圍內(nèi)，通常認為靶標植物對供試除草劑的反應在0%～90%時的濃度（或劑量）設(shè)置是比較合理的，可以獲得較為準確的回歸方程，應用該回歸方程計算出EC10、EC50 、EC90等試驗所需濃度（或劑量）。為保證試驗條件的一致性和試驗結(jié)果的可比性，試驗前應先將原藥配制成一定濃度的母液后，采用梯度稀釋的方法進行；試驗方法也應按照除草劑的使用方法，選擇噴霧處理或土壤處理。噴霧處理中，噴霧設(shè)備性能要良好，霧滴要均勻一致，如不具備良好的噴霧設(shè)備，可采用滴定法，即用微量移液器將定量藥液滴在供試植物的特定部位，如植物第二展開葉，該方法可以避免噴霧霧滴不勻造成的人為誤差。采用土壤處理時應先配制成一定濃度的毒土，用相同土壤逐步稀釋成梯度濃度，均勻撒適于相應處理中[11]。所有試驗濃度（或劑量）都應重復3次以上。

2.3生物測定在新農(nóng)藥篩選中的應用

篩選目標化合物除草活性的一般步驟為：1.確定生物活性，在相同植物試材，相同劑量下，進行新化合物普篩，明確化合物活性。2.確定活性大小，通過設(shè)置梯度濃度，初步確定目標化合物的活性大小。3.確定除草劑作用特點和特性，通過不斷篩選、復篩，逐漸增加靶標雜草的種類和擴大試驗作物的范圍，對除草劑自身特性和使用特點進行研究，確定應用劑量、除草劑選擇性、雜草譜和應用階段，進而確定對作物的安全性以及除草劑殘留消解動態(tài)等[12，13]。目前，新農(nóng)藥創(chuàng)制中，生物測定時普遍采用培養(yǎng)皿法，也就是種子萌發(fā)法。具體做法是將靶標生物種子放入鋪有雙層濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，用移液槍加入稀釋成梯度濃度的目標除草劑，放入人工氣候箱內(nèi)進行培養(yǎng)，7天后對種子生物指標進行統(tǒng)計，通過發(fā)芽率、鮮重、根或莖的抑制情況等數(shù)據(jù)計算抑制中濃度，從而判斷比較目標除草劑生物活性[14]。種子萌發(fā)法在除草劑新化合物篩選上具有一定的局限性，對氨基甲酸酯類除草劑具有很高的篩出率，但難以檢出大部分光合作用抑制型除草劑[2]，因此在除草劑新化合物篩選上應進一步拓展新方法、新思路，避免化合物的錯選、漏篩。

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作者簡介：謝娜，碩士研究生，林業(yè)工程師，研究方向：農(nóng)藥毒理與有害生物抗藥性。endprint